Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Биологическая роль белков беременности (ББ). 11
1.1.1. Продукция ББ при физиологически протекающей беременности 11
1.1.2. Продукция ББ при патологии беременности 20
1.2. Современные представления о мишенях белков беременности. 23
1.3. Белки беременности как диагностические тесты при заболеваниях человека. 27
1.4. Современные представления о локализации и месте синтеза ББ. 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 34
2.1. Характеристика и объем материала исследований. 34
2.2. Методы исследований 35
2.2.1 Методы очистки антигенов и получения антисывороток . 35
2.2.2 Гистологические и гистохимические методы 37
2.2.3 Метод иммунофлюоресценции 40
2.2.4 Методы,статистической обработки данных 41
Результаты собственных исследований 43
Глава 3. Изучение общего белка и белков беременности в различных тканях человека в условии нормы и при патологии 43
3.1 Выделение и очистка СБАГ и ТБГ для последующего получения к ним антисывороток 43
3.2 Изучение общего белка и белков беременности в тканях плаценты человека 47
3.2.1. Морфология нормальной плаценты рожениц 47
3.2.2. Иммунофлюоресцентное исследование СБАГ в плаценте 49
3.2.3. Иммунофлюоресцентное исследование ТБГ в плаценте 51
3.3. Изучение общего белка и белка беременности в печени 53
3.3.1. Морфология печени 53
3.3.2. Иммунофлюоресцентное исследование СБАГ в печени 56
3.4. Изучение общего белка и белка беременности в аппендиксе 57
3.4.1. Морфологиячервеобразного отростка 57
3.4.2. Иммунофлюоресцентное исследование СБАГ в аппендиксе 60
3.5. Изучение общего белка и белков беременности в эндометрии 61
3.5.1. Морфология эндометрия в норме 61
3.5.2. Морфология малигнизированного эндометрия 63
3.5.3. Иммунофлюоресцентное исследование СБАГ в нормальном и малигнизированнном эндометрии 68
3.6. Изучение общего белка и белка беременности в толстом кишечнике 71
3.6.1. Морфология толстого кишечника в норме 71
3.6.2. Морфология малигнизированного толстого кишечника 74
3.6.3. Иммунофлюоресцентное исследование СБАГ в нормальном и малигнизированном толстом кишечнике 78
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 81
Выводы 88
Практические рекомендации 89
Список литературы 90
- Биологическая роль белков беременности (ББ).
- Продукция ББ при патологии беременности
- Методы очистки антигенов и получения антисывороток
- Изучение общего белка и белков беременности в тканях плаценты человека
Введение к работе
Актуальность работы. Одной из главных целей реализации приоритетного национального проекта Российской Федерации в сфере здравоохранения является формирование предпосылок демографического роста в стране. Министерством здравоохранения РФ для реализации поставленной цели определены следующие основные задачи: улучшение репродуктивного здоровья населения и охрана здоровья матери и ребенка.
Среди важнейших методов диагностики как самой беременности, так и ряда патологических процессов, возникающих в период беременности, следует отметить количественный и качественный анализ маркеров беременности. К таким исследованиям относится определение гормонов и специфических белков беременности, а именно таких белков-маркеров как альфа-фетопротеин (АФП), связанный с беременностью альфа2-гликопротеин (СБАГ), трофобла-стический бета-глобулин (ТБГ). Эти белки беременности продолжают оставаться пристальным объектом научных исследовании, несмотря на их внедрение в практику как диагностикумов, что связано, прежде всего, с появлением новых методических подходов, позволяющих проводить тонкие исследования поведения и функции белковых молекул в организме [75; 77; 111].
Следует отметить, что в лабораторной диагностике используются также и постоянные белковые компоненты сыворотки крови, уровень которых повышается при беременности: альфа2-макроглобулин (МГ), трансферрин (ТФ), церу-лоплазмин (ЦП), гаптоглобин (ГГ) и другие. Все перечисленные белки крови относятся к белкам острой фазы.
Концентрация практически всех названных белков в биологических жидкостях характерно изменяется не только при физиологически протекающей беременности, но и при многих патологических состояниях, сопровождающих беременность, таких как ранние и поздние гестозы [17; 22; 36; 247], нефротиче-ский синдром [247], сахарный диабет [11; 206; 232], резус-несовместимость
[232], эклампсия, спонтанные и индуцированные аборты и внутриутробная гибель плода [10; 232; 247]. Изменение сывороточных концентраций белков-маркеров беременности может служить диагностическим подспорьем при многоплодии [10; 17] и переношенной беременности [17; 113]. Кроме того, уровень этих белков может служить косвенным ориентиром состояния плода [17].
Следует отметить, что белки первой группы (АФП, СБАГ и ТБГ) являются маркерами не только беременности [2; 86; 97; 141; 143], но и ряда онкологических заболеваний [9; 23; 36; 67; 85]. Кроме того, большинство вышеуказанных белков характерно изменяют свой уровень при многих воспалительных заболеваниях [35; 42; 100; 247; 221]. Доказана иммуносупрессивная и иммуно-модулирующая активность вышеуказанных белков [58; 91; 175].
Все вышеизложенное доказывает огромную физиологическую и патогенетическую роль белков, ассоциированных с беременностью. Вместе с тем многие вопросы их места синтеза и локализации в нормальных и малигнизиро-ванных тканях остаются не до конца изученными, несмотря на пристальное внимание исследователей к белкам беременности [49].
Поэтому приобретает важное не только теоретическое, но и клиническое значение знание места локализации и* синтеза наиболее значимых белков беременности с целью последующего использования их в диагностике и оценке эффективности лечения. Иными словами, для обоснованной корректировки го-меостаза организма.
В настоящее время ведущими методами в исследовании белков являются иммунохимические. Среди них известны иммуногистохимические методы, позволяющие выявить места локализации исследуемого белка в конкретной структуре органа или ткани. С помощью иммуногистохимии можно проводить скрининг-исследования в условиях поликлинической лаборатории для оценки состояния организма: в случае определения белков беременности - плода и матери.
Наиболее полно и достоверно определено место синтеза, локализации и накопления в субклеточных структурах при физиологическом и патодогиче-
ском течении беременности ТБГ [96; 103]. Установлено, что этот белок продуцируется и секретируется в кровь матери для выполнения своей основной функции - иммуносупрессивной. Сведения же по гистотопографии СБАГ отличаются большой разноречивостью как при беременности, так и при развитии заболеваний, сопровождащихся усилением синтеза этого белка.
Таким образом, совершенно закономерным и актуальным представляется детальное изучение белков беременности в органах и тканях в условиях нормы и патологии.
Цель исследования: Определение локализации и места синтеза белков беременности в тканях человека для уточнения представлений о молекулярных механизмах в условиях нормы и при канцерогенезе, а также для улучшения диагностики опухолей.
Задачи исследования:
Определить гистотопографию и количество общего белка в экзокриноци-тах исследуемых тканей в норме.
Сравнить гистотопографию и количество общего белка в малигнизирован-ных экзокриноцитах толстого кишечника и эндометрия.
Изучить гистотопографию белков беременности в тканях (печень, толстый кишечник, эндометрий) человека (мужчин и небеременных женщин) в норме, и в тканях рожениц (плацента).
Изучить гистотопографию белков беременности в тканях человека при канцерогенезе.
Сравнить гистотопографию белков беременности в нормальных и малиг-низировованных тканях.
Разработать принципы практического использования полученных результатов в лечении заболеваний женской половой сферы.
Научная новизна.
В ходе исследования впервые были получены новые данные о топографии суммарного белка с одновременным определением локализации белков беременности (СБАГ) в тех же тканях человека в физиологических условиях нормы и при онкопатологии.
Также впервые были получены количественные характеристики суммарного белка и СБАГ в норме и при канцерогенезе в некоторых тканях с помощью программно-аппаратного комплекса «Морфолог».
Полученные новые данные о динамике содержания и распределения как суммарного белка в тканях, так и иммуногистохимического исследования СБАГ в аналогичных участках организма позволят сделать рекомендации для практического здравоохранения с целью наиболее ранней диагностики предбо-лезни.
Научно-практическая значимость работы
На основе результатов исследования сформированы рекомендации для практического здравоохранения по иммунофлюоресцентному анализу опухолевых тканей эндометрия и толстого кишечника по выявлению определенного антигена. Полученные результаты позволяют рекомендовать этот анализ как лабораторный тест для ранней диагностики опухолей.
Выносимые на защиту положения
Содержание общего белка в неизмененных тканях эндометрия, толстого кишечника, плаценты, аппендикса и печени по данным углубленных цитофотометрических исследований существенно различается.
В малигнизированных тканях эндометрия и толстого кишечника его количество существенно возрастает соответственно для эндометрия 231,23 в норме и 314,02 усл.ед. при аденокарциноме; для толстого кишечника 174,07 в норме и 347,05 усл.ед при аденокарциноме.
Наибольшие концентрации СБАГ в различных тканях по степени убывания выявляются в малигнизированных тканях толстого кишечника, эндометрия и в нормальной плаценте рожениц.
Выявленное увеличение содержания СБАГ в плаценте и малигнизированных тканях, вероятно, связано с разной степенью дерепрес-сии структурного гена СБАГ, реализующего иммуносупрессивную активность в большей степени при беременности и опухолях.
Внедрение результатов в практику
Выявление СБАГ в гистологических препаратах может быть использовано для диагностики в гинекологической практике для оценки состояния эндометрия и проктологии в качестве дополнительного критерия степени малигни-зации исследуемых тканей.
Материалы работы были доложены на научных региональных и международных форумах.
Материалы диссертации доложены на заседаниях кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики и конференциях ГОУ ВПО АГМА, на международных научных конференциях молодых ученых «Белки - маркеры патологических состояний» (Астрахань - Москва, 1999, 2003гг.), на научно-практической конференции молодых учёных с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Москва, 2004г.), были представлены на XXVIII Meeting of the international society for oncodevelopmental biology and medicine (ISOBM) (Мюнхен, Германия, 2000 и Хельсинки).
По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, 2 из них в изданиях рекомендованных ВАК изданиях.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ БЕЛКОВ БЕРЕМЕННОСТИ
1.1.1 ПРОДУКЦИЯ БЕЛКОВ БЕРЕМЕННОСТИ ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ ПРОТЕКАЮЩЕЙ БЕРЕМЕННОСТИ
Спектр сывороточных белков у беременных женщин значительно отлича
ется от такового у небеременных. Ещё в начале 20-го века в 1903 г. Zangemeister
[255] описал увеличение глобулярных фракций при нормальной беременности.
В течение последующих десятилетий многими авторами были показаны коли
чественные изменения в профиле сывороточных белков при беременности.
"' Удобнее всего рассматривать эти изменения, основываясь на классифи-
кации сывороточных белков по их электрофоретической подвижности.
Longsworth L.G. et al., в 1945 г. [172] изучали белковый спектр сыворот
ки крови при нормально протекающей беременности методом свободного элек
трофореза. При этом они не только подтвердили полученные ранее данные об
уменьшении уровня альбуминов и увеличении уровня глобулинов, но и выяс
нили, что увеличение глобулинов происходит за счет альфа- и бета-глобулинов,
^ в то время как количество гамма- глобулинов не изменялось. Эти данные позд-
нее были подтверждены многими исследователями [7; 196; 251].
Следует отметить, что многочисленные литературные данные об изменении уровня различных фракций глобулинов при беременности, неоднозначны, а зачастую и противоречат друг другу.
Так, Longsworth L.G. et al. [172], Pozzi P.C. [203] считали, что альфа- и бета- глобулины увеличиваются в одинаковой степени.
Boselli A et al. [95], Bayer Н. [80], Smith Е. et al. [216], напротив, нашли, что бета-глобулины увеличиваются в большей степени, чем альфа-глобулины.
Вурманн Ф., Лийвранд В.Э. [31], De Alvarez R.R. et al. [108], напротив, показали, что альфа-глобулины увеличиваются в большей степени, чем бета-глобулины.
Имеются данные о равноценном повышении уровня всех фракций глобулинов при беременности [21; 201].
По сведениям Roszkowsky I. [208], Alvarez-Pita С.[72], Wirken Н. et al. [251], при беременности, наряду с повышением уровня альфа- и бета-глобулинов, происходит одновременное падение уровня гамма-глобулинов.
Отличаются также данные различных авторов относительно динамики уровней фракций глобулинов на протяжении беременности.
Fakhri О. [ПО] и Mac Gillivray Let al. [178] утверждают, что содержание альфаі- , альфа2- и бета-глобулиновувеличивается постепенно, по мере развития беременности, а содержание гамма-глобулинов - снижается до 2-го триместра беременности и в дальнейшем, до конца беременности, не изменяется.
По данным Лийвранд В.З. [31], уровень альфа- и бета-глобулинов увеличивается в течение всей беременности (колебания же гамма-глобулинов незначительны). Причем содержание альфа-глобулинов возрастает постепенно, с начала беременности до 8-го лунного месяца, чуть заметно снижаясь на 9-Ю лунных месяцах.
Имеются сведения, что содержание альфа2-глобулинов в первые три месяца беременности повышается, на 4-5 месяцах слегка падает и, начиная с 6-го месяца, увеличивается с каждым месяцем беременности [47; 46].
В периоде родов уровень глобулиновых фракций крови не претерпевает значительных изменений по сравнению с таковым в конце беременности [31; 208].
В послеродовом периоде содержание альфа!-, альфа2- и бета-глобулинов постепенно снижается, в то время как содержание гамма-глобулинов слегка повышается [7; 31].
К хорошо изученным белкам, повышающим свой уровень при беременности, относятся: альфаг-макроглобулин, гаптоглобин, церулоплазмин (все -
зона альфа-глобулинов) и трансферрин (зона бета-глобулинов) [30]. Сам факт количественных отличий в спектрах сывороточных белков крови беременных и небеременных имеет, безусловно, большое значение в биологии и медицине.
В 1959 году Smithies [219], методом электрофореза на крахмальном геле в зоне альфа2-глобулинов обнаружил дополнительную фракцию, которая отсутствовала у небеременных. Smithies назвал эту фракцию зоной беременности [219]. Частота выявления этой зоны увеличивалась по мере увеличения срока беременности [69]. "Зона беременности" не была выявлена ни у одного здорового мужчины и у здоровой небеременной женщины.
В дальнейшем многие авторы подтвердили наличие белковой фракции в сыворотке крови, специфичной для беременности [50; 89; 140; 162].
В результате дальнейшего изучения "зоны беременности" методом им-муноэлектрофореза в агаре, удалось идентифицировать в ее составе до пяти антигенных компонентов [50; 79; 89; 140; 143; 162].
В 1959 году Мс Laren S.A. et al. [179] получили антисыворотку против сыворотки крови здоровых беременных женщин. С помощью этой антисыворотки была обнаружена дополнительная полоса преципитации (при иммуно-диффузии в агаровом геле), которая отсутствовала в сыворотке у небеременных.
В 1966 году Bayer Н. [81], применяя метод диффузии в агаре по Оухтер-лони и иммуноэлектрофорез с использованием различных антисывороток, обнаружили в сыворотке крови беременных женщин два антигенных компонента, не обнаруживаемых в сыворотке крови небеременных.
Bohn Н., в 1971 году [89] исследовал сыворотку крови беременных женщин методом электрофореза в полиакриламидном геле. При этом было обнаружено четыре белка, характерных для беременности.
Аналогичные находки были сделаны и другими авторами [19; 54; 55; 91]. Следует отметить, что "белки беременности" отсутствуют, или находятся в очень малых количествах в сыворотке крови небеременных женщин и здоровых мужчин [4; 19; 54; 55; 100].
По данным Воробьевой Т.Б., "белки беременности" подразделяются на три группы, в соответствии с происхождением:
Белки сыворотки крови, концентрация которых резко возрастает во время беременности.
Трофобластические белки.
Белки, продуцируемые эмбрионом [17].
К первой группе принадлежат, например, комплементарный к стероидам бета-глобулин (SP2), связанный с беременностью альфа2-гликопротеин (сс2-PAG), плацентарные белки РР1, РР2, РРЗ, РР4, РРб и РР7.
К белкам, специфическим для плаценты, принадлежат: плацентарный лактоген человека, плацентарная щелочная фосфатаза, связанные с беременностью белки плазмы РАРР-А и РАРР-С, трофобластический бета-гликопротеин, плацентарный белок РР5 [94].
И, наконец, примером эмбриоспецифических белков могут служить альфа-фетопротеин, эмбриоспецифический бета 1-глобулин и эмбриональный бета2-глобулин.
Из вышеуказанных белков наибольший интерес для теоретической и практической медицины представляют альфа-фетопротеин, хорионический го-надотропин, связанный с беременностью альфаг-гликопротеин и трофобластический бета-глобулин.
Альфа2-макроглобулин
Альфа2-макроглобулин (МГ) является одним из важнейших ингибиторов протеиназ, регулирующим активность различных протеолитических ферментов крови и тканей [13; 14; 122; 123; 135].
О существовании особого ингибитора протеиназ стало известно еще в начале 60-х годов, когда Веремеенко и Белицер [15] обнаружили, что трипсин в присутствии избытка ингибиторов сыворотки крови сохраняет способность расщеплять низкомолекулярные синтетические субстраты, но не гидролизует высокомолекулярные белки.
Исследования Веремеенко К.Н. и Белицер В. в 1963 году [12] показали, что трипсин в присутствии избытка ингибиторов сыворотки крови активно расщепляет протамин и становится необычно термостабильным. В результате клинических исследований было установлено, что в альфа2-глобулиновой фракции существует специальный белок, который образует комплекс с трипсином, интенсивно гидролизующий протамин [119; 120].
Веремеенко К.Н. и Кизим А.И. [15] назвали этот белок ингибитором 1, в отличие от ингибитора 2, который инактивирует фермент полностью.
Позднее Ходорова Е.Л. и соавт. [60], Mehl I.W. et al. [183] и др. выделили из сыворотки крови человека ингибитор 1, мигрирующий при электрофорезе в зоне альфа2-глобулинов.
Дальнейшие исследования показали полную идентичность ингибитора 1, трипсинпротеинэстеразы, 19S альфа2-гликопротеида и альфа2-макроглобулина [8; 61; 183].
Содержание альфа2-макроглобулина в плазме крови взрослых людей составляет 2,6 - 3,3 г/л [155; 168; 247] и с возрастом изменяется мало.
Примерно на десятой неделе внутриутробного развития уровень альфа2-макроглобулина в сыворотке крови достигает 15% от уровня взрослого и постепенно повышается до нормальных (для взрослого) значений. Максимальный уровень отмечается к 1 - 3 годам (примерно 4,5 г/л), затем постепенно снижается до стабилизации на уровне, характерном для взрослых к 25 годам [115].
Концентрация альфа2-макроглобулина у женщин примерно на 20% выше, чем у мужчин [249; 131]. Его концентрация в сыворотке крови экспоненциально возрастает в течение беременности, достигая максимума в третьем триместре. Очевидно, это связано с положительным влиянием эстрогенов на синтез альфа2-макроглобулина [68; 83; 158; 161]. Влияние уровня эстрогенов на синтез альфа2-макроглобулина доказывает и тот факт, что концентрация белка в плазме крови резко возрастает при приеме ряда гормональных контрацептивов [23; 190].
Альфа2-макроглобулин содержится также в лимфе, сперме, экссудатах [189].
В настоящее время основными методами идентификации альфа2-макроглобулина в биологических жидкостях являются иммунологические методы [133; 135; 236; 12], основанные на применении специфических антисывороток.
Связанный с беременностью альфа2-гликопротеин
Связанный с беременностью альфа2-гликопротеин (СБАГ) был обнаружен в 1959 году Smithies et Maclaren [219] при электрофоретическом разделении в крахмальном геле сыворотки крови беременных женщин.
В том же году, при иммуноэлектрофоретическом разделении сыворотки крови беременных женщин, было выявлено два специфических для сыворотки крови беременных женщин компонента, один из которых имел подвижность альфа2-глобулинов [197].
Никулина Д.М. [37] указывает, что в дальнейшем данная фракция белков изучалась довольно интенсивно. Начиная с 1970 года различными авторами было описано более десяти белков, сходных со СБАГ, среди них: pregnansy zone protein (PZP), pregnansy associated globulin (PAG) [180], pregnansy associated alfa2-glycoprotein (alfa2-PAG) [141; 143; 145], pregnansy protein [158], pregnansy alfa2-globulin [162; 182], альфа2-глобулин [53; 33], Schwangerschaftassociierte-proteine (SP3) [89], pregnoglobulin [82], new serum
alfa2-macroglobulin [227], ассоциированный с беременностью альфа2-гликопротеин (АБГ) [29].
В дальнейшем методами иммунохимической идентификации было доказано, что все вышеуказанные белки являются абсолютно идентичными [83; 129; 187; 158; 154; 76].
Во избежание затруднений, связанных с обилием названий, в 1975 году, международная группа экспертов (Beme В.Н., Hofmann R., Klausch В., Straube W., Kasukawa, Stimson W.H., Bohn H., Home C.H.W., Rittner Ch., Than G.N.) рекомендовала называть данный белок: pregnancy associated alfa2-glycoprotein (a2-PAG), что в переводе на русский означает: связанный с беременностью альфа2-гликопротеин (СБАГ).
Благодаря исследованиям Bundschuh С. [97], Hofmann R. et al. [144; 147], Wilken H. [250], Kuczynski ЦІ65], было показано, что СБАГ появляется в сыворотке крови беременных женщин, начиная с 6-10 недели беременности, и затем его концентрация экспоненциально возрастает в течение беременности и становится максимальной к концу беременности (0,5-2,0 г/л).
После родов уровень СБАГ быстро падает (период полураспада - 6-7 дней), возвращаясь к нормальным для небеременных женщин величинам через 6-8 недель после родов [54; 92; 238].
В 1970 году Татаринов Ю.С. и соавт. [53] опровергли доминирующее в то время мнение об отсутствии СБАГ в сыворотке крови небеременных женщин и мужчин. Был применен метод радиальной иммунодиффузии по Оухтер-лони в модификации Храмковой Н.И. и Абелева Г.И. [62], в результате было показано, что СБАГ находится в малом количестве (0,5-2,0 мг%) в сыворотке крови доноров женщин (частота выявления - 50,8%) и мужчин (24,6%), в то время как в сыворотке крови рожениц уровень СБАГ достигает 128 мг% (частота выявления - 100%). Впоследствии данные Татаринова Ю.С. и соавт. были подтверждены многими авторами [52; 91; 149; 162; 180].
У взрослых концентрация СБАГ в сыворотке крови варьирует от 0,1 до 60 мг/л [27]. Установлено, что она повышается пропорционально возрасту.
Уровень этого белка в 2-5 раз больше у женщин, чем у мужчин соответствующего возраста [27]. Предполагается, что это обусловлено стимулирующим действием эстрогенов [149; 27].
Уровень СБАГ в сыворотке крови колеблется на протяжении менструального цикла [41].
Уменьшение концентрации СБАГ в сыворотке крови отмечено при многих аутоиммунных заболеваниях [5; 147; 160].
Straube W. et al. [232] выявили повышение уровня СБАГ в сыворотке крови беременных женщин, больных сахарным диабетом и при резус-конфликте.
Трофобластический бета-глобулин
Среди белков "зоны беременности", синтезируемых трофобластом, большое значение имеет трофобластический бета-глобулин (ТБГ).
В 1958 году Olivetty и Ruggert, изучая сыворотку крови здоровых беременных женщин методом иммунодиффузии в геле, с помощью антиплацентарной сыворотки, выявили белок, который исчезал через несколько дней после родов. В 1960 году Hirschfeld I. et al. [140] определили антигенный компонент с подвижностью бета 1-глобулинов, который отсутствовал в сыворотке крови небеременных женщин и мужчин.
Позднее подобные результаты были описаны Bayer Н. [79] и Азявчиком А.В. и соавт. [3]
В 1970 году Татаринов Ю.С. и Масюкевич В.Н. [51] сообщили об открытии нового бета 1-глобулина "зоны беременности". В то же время белки со сходными физико-химическими свойствами обнаружили Kuczynski I. [162], Hofmann R. [134; 141; 143], Bohn H. [89], Schulze-Mosgan H. [246], Lin [170]. Позднее было доказано, что вышеуказанные протеины идентичны.
Подробное и убедительное описание ТБГ, его физико-химических свойств и клинического значения дали Татаринов Ю.С, Никулина Д.М. и Мес-нянкина Н.В. [36; 51; 56; 57].
ТБГ имеет ряд синонимов, наиболее распространенные из них: Pregnancy-associated plasma protein С (PAPP-C), Trophoblast specific betal-globulin (TSG), Pregnancy specific betal-globulin (PSJ3G), Schwangerschaft-associierte betal-glicoproteine (SP1) [89].
ТБГ постоянно выявляется в больших количествах в плацентарной ткани и в сыворотке крови беременных женщин, начиная с ранних сроков беременности [40; 52; 70; 78; 91; 102; 113]. Следует отметить, что из всех белков "зоны беременности", ТБГ имеет самую высокую концентрацию в сыворотке крови (в конце беременности).
С конца первого триместра беременности ТБГ определяется также в околоплодных водах. В первые 4 суток послеродового периода ТБГ выявляется в грудном молоке и в слизи из цервикального канала [86; 91; 173; 228]. ТБГ отсутствует в тканях и в сыворотке крови доноров.
По данным Татаринова Ю.С. и соавт. [55] ТБГ обнаруживается в пупо-винной сыворотке в 8-10% случаев. Татаринов Ю.С [55], Никулина Д.М. [36] и Воробьева Т.Е.[17] предполагают, что ТБГ попадает в кровь плода вследствие нарушения целостности плацентарного барьера.
В сыворотке крови беременных женщин ТБГ выявляется методом им-мунодиффузии на 2-3 неделе беременности и до родов [40; 70; 86]. В начале беременности процент выявления данного белка небольшой (между 8 и 16 неделями беременности его концентрация составляет 1 мг%), но с течением беременности уровень ТБГ возрастает и достигает максимума к 34-38 неделям беременности (процент выявления - 70-100%), когда он составляет 5-20 мг% [5; 36; 43; 51; 78; 209]. Далее, к моменту родов, концентрация ТБГ падает в 3-8 раз [37; 43].
В течение 5 дней после родов ТБГ исчезает из материнской крови полностью, так как период его полураспада равен 17-45 часам [39; 36; 52; 71]. Динамика изменения концентрации ТБГ в течение беременности в плацентарной ткани и в амниотической жидкости аналогична таковой в сыворотке крови беременных женщин [36; 39; 59; 63; 228].
С конца первого триместра беременности ТБГ выявляется в моче [36; 86; 173]; его концентрация составляет 2,3% от уровня белка в сыворотке крови и резко повышается к 34-38 неделям, достигая 3 мг% [39; 86; 173].
Существует иммунологическое отличие ТБГ мочи и ТБГ сыворотки крови. Гель-диффузионный тест, ТБГ мочи дает с ТБГ сыворотки крови феномен неполной иммунологической идентичности ("феномен шпоры") [36; 86; 91; 173]. Электрофоретическая подвижность в агаре ТБГ мочи и ТБГ сыворотки крови практически одинакова, но при электрофорезе в ПААГ, ТБГ мочи движется значительно быстрее и выявляется в зоне трансферрина. Bohn Н. [89] считает, что ТБГ мочи и сывороточный ТБГ имеют одинаковый заряд, но уро-ТБГ имеет меньшую молекулярную массу за счет потери части антигенных детерминант.
По мнению Никулиной Д.М. [36], иммунохимические и физико-химические различия между ТБГ мочи и крови обусловлены тем, что в мочу, в связи с нарушениями проницаемости почечного барьера, при ряде патологических состояний (поздние гестозы), проникает только меньшая субъединица ТБГ.
В 1976 году Татаринов Ю.С., Никулина Д.М. и Меснянкина Н.В. разработали иммунохимический тест на ТБГ для:
диагностики ранних сроков беременности
дифферинциальной диагностики гравидарного состояния и патологии женской половой сферы, не имеющей отношения к беременности
оценки тяжести поздних токсикозов.
1.1.2. ПРОДУКЦИЯ ББ ПРИ ПАТОЛОГИИ БЕРЕМЕННОСТИ
МГ, СБАГ и ТБГ изучались многими авторами как потенциальные маркеры осложненных вариантов течения беременности и гинекологических заболеваний. Ежегодно в мире появляются десятки публикаций, в которых содержится новая информация об их роли в регуляции репродуктивной функции.
Доказано, что для нефротического синдрома характерно увеличение концентрации МГ в сыворотке крови, которое имеет пассивный характер и поэтому коррелирует с уровнем протеинурии [234; 229].
У пациенток с послеродовым эндометритом, начиная с 1-х суток, выявлялось низкое содержание МГ в течение всего периода наблюдения. Концентрация этого белка у родильниц с осложненным течением послеоперационного периода была также сниженной, по сравнению с контрольной группой, однако незначительно отличалось от таковой у родильниц. Стойкая депрессия уровня МГ в сыворотке крови, характерная для послеродового сепсиса и перитонита, является одним из критериев генерализации инфекционного процесса [254]. При локализованных формах гнойно-септических заболеваний концентрация МГ повышалась в начале лечения, снижалась в период манифестации симптомов и нормализовалась только по мере редукции воспаления [254]. При мастите колебания его сывороточного уровня были менее выраженными, чем при эндометрите.
Не исключено, что удаление из циркуляции таких мощных иммуносу-прессоров как МГ и СБАГ приводит к усилению ответа иммунной системы матери на инфекционный процесс [153; 156; 159].
При инсулинзависимом диабете у беременных концентрация МГ в сыворотке крови имеет тенденцию к снижению, а при гипертензии она, напротив, возрастает [171; 246].
Компенсаторные реакции, типичные для сахарного диабета, могут быть прослежены на субклеточном и клеточном уровне в виде повышения функциональной активности синцитиотрофобласта [20]. В результате нередко усиливается продукция эстрогенов, которые относятся к стимуляторам синтеза СБАГ [109]. Возможно поэтому его концентрация в сыворотке крови матерей, страдающих сахарным диабетом, часто бывает повышенной, причем после 24 недели определяется её отчетливый градиентный рост [234]. Если во II половине беременности на фоне данного заболевания развивается пролиферативная ретинопатия, то наблюдается отчетливое снижение уровня СБАГ [234], а при её
молниеносной форме он часто ниже 150мкг/мл [98]. Депрессия уровня СБАГ у части больных предшествовала появлению клинических симптомов. Следовательно, можно использовать в качестве маркера микроциркуляторных нарушений при декомпенсации сахарного диабета у беременных.
Выявлено некоторое снижение СБАГ при поздних токсикозах, причем оно было пропорционально их тяжести [234; 98]. Снижение концентрации СБАГ в сыворотке крови может нивелироваться нарастающей гиповолемией, которая играет важную роль в патогенезе эклампсии. Поэтому при тяжелых формах гестоза его уровень у некоторых пациентов мало отличался от такового при неосложненном течении беременности [255].
Отмечается снижение содержания СБАГ и ТБГ в сыворотке крови в III триместре беременности у носительниц патогенной и условно-патогенной флоры в цервикальном канале [188]. В среднем, уровень СБАГ у этих женщин более, чем в 2 раза ниже, чем у беременных, у которых идентифицировались лишь непатогенные штаммы. Предполагается, что ограничение биосинтеза данных иммуносупрессоров направлено на создание более оптимальных условий для активации распознавания потенциально опасных штаммов иммуноком-петентными клетками и их дальнейшей селективной элиминации.
Достаточно сложно объяснить изменение концентрации СБАГ при резус-конфликте. Легкой форме гемолитической болезни новорожденных сопутствовало нормальное содержание СБАГ, ТБГ, IgG, IgA и IgM в сыворотке крови матери. Гибели новорожденных в течение первых 3-х суток после родов предшествовала депрессия уровней СБАГ и IgG в сочетании с высокой продукцией ТБГ в III триместре. В то же время снижение концентрации СБАГ на фоне нормального содержания ТБГ и иммуноглобулинов в течение всей беременности часто наблюдалось при беременности резус-изосенсибилизированной женщины резус-отрицательным плодом. Эти показатели имели более высокую прогностическую ценность, чем титр противорезусных антител у беременных, который совершенно не зависел от тяжести гемолитической болезни новорожденных [16; 6].
9?
Явное увеличение сывороточного содержания СБАГ наблюдалось у девушек при дефиците соматотропного гормона [112]. Кортикостероидная терапия в I половине беременности вызывала некоторую депрессию его уровня. В обзоре Munck Petersen С. [188] приведены убедительные доказательства отсутствия прямого стимулирующего воздействия гормонов на содержание МГ и СБАГ в сыворотке крови. Скорее всего, эстрогены, гестагены и другие гормоны относятся к слабым вторичным модуляторам метаболизма этих белков.
1.2. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МИШЕНЯХ БЕЛКОВ
БЕРЕМЕННОСТИ
Более 20 лет назад установлено, что около половины экзогенных комплексов МГ с протеиназами выводится из кровеносного русла человека в течение 5-6 минут, тогда как радиоактивно меченный нативный белок может находиться в нем до нескольких суток [195]. Затем был обнаружен ассоциированный с цитоплазматической мембраной рецептор, который связывает МГ, его аналоги у животных и СБАГ. Его важнейшие характеристики подробно описаны в обзоре С. Munck Petersen [188]. В последние годы появилось огромное количество публикаций о рецепторе МГ (РМГ). Наиболее распространенное его название a2-macroglobulin receptor/low density lipoprotein receptor-related protein. Участвуя в элиминации липопротеинов низкой плотности (ЛНП), их липазы, многих других белков, он играет немаловажную роль в патогенезе атеросклероза, болезни Альцгеймера и ряда других часто встречающихся заболеваний. РМГ экспрессирован, главным образом, на клетках-продуцентах МГ, т.е. на гепатоцитах, макрофагах и фибробластах. Связавшиеся с рецептором белки в считанные минуты поглощаются клетками и подвергаются расщеплению.
Альфа.2 макроглобулин
Оказалось, что РМГ в структурном, функциональном и антигеном отношениях не отличим от идентифицированного позже мембранного протеина,
родственного рецептору липопротеинов низкой плотности (lipoprotein receptor-related protein). Обнаружена высокая степень гомологии между РМГ и рядом доменов самого рецептора ЛГШ (РЛНП). Возможно, что в ходе эволюции ген РЛНП образовался в результате частичной делеции и дупликации гена РМГ [139].
Наряду с эпителиальным гликопротеином (gp), имеющим молекулярную массу ЗОО-ЗЗОкДА, РМГ участвует в поглощении клетками и последующей деградации широкого спектра функционально различных лигандов, включая липопротеины, протеиназы, а также комплексы последних с ингибиторами, например, комплексы al-антитрипсин-эластаза нейтрофилов, al-анти-химотрипсин-катепсин G, антитромбин Ш-тромбин, al-антитрипсин -трипсин [239; 240].
К антагонистам РМГ относится ассоциированный с рецептором протеин (receptor-associated protein, РАП), имеющий молекулярную массу 39кДа и состоящий из 323 аминокислотных остатков. Другое его менее распространенное название - гепарин связывающий протеин-44.
РАП способен формировать комплексы с тяжелой и легкой цепями РМГ. Он ингибирует связывание всех известных лигандов с РМГ, РЛНП и упоминавшемся выше эпителиальным гликопротеином (gp). Кроме того, РАП в комплексе с глутатион S-трансферазой блокирует эндоцитоз хиломикронов печенью [186].
В нормальных артериях человека мРНК РМГ определяется методом гибридизации in situ в гладкомышечных клетках и в фибробластах адвентиции. Эндотелиальные клетки также ее содержат, но с помощью иммунохимических методов рецептор в них обнаружить не удалось. При атеросклеротическом поражении сосудов повышенный уровень экспрессии мРНК наблюдается в гладкомышечных и "пенистых" клетках, а также в макрофагах, нагруженных липи-дами [177]. "Пенистые" клетки, образующиеся из гладкомышечных клеток и макрофагов, имеют 3 типа рецепторов: РМГ, "рецептор-мусорщик" (scavenger
receptor, РМ) и РЛНП. Высокий уровень мРНК РМГ обнаружен в гладкомышечных клетках и макрофагах на ранних и поздних стадиях атеросклероза аорты человека, тогда как мРНК РМ экспрессирована в патологически измененных макрофагах, но не обнаруживается в поврежденных гладкомышечных клетках. РЛНП отсутствовал в зоне поражения, но определялся в гладкомышечных клетках на границе со здоровой тканью. Следовательно, РМГ, наряду с РМ, играет важную роль в развитии атеросклеротических изменений сосудов у человека [176]. Кроме того, связывание им активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типов может снижать фибринолитический потенциал крови и ин-гибировать рассасывание тромбов на атеросклеротических бляшках.
Превращение моноцитов в макрофаги, а также инкубация последних с ацетилированными липопротеинами низкой плотности приводит к увеличению экспрессии мРНК РМГ. Активация транскрипции гена РМГ наблюдается при обработке гладкомышечных клеток сосудов некоторыми эпидермальными и тромбоцитарными факторами роста.
По данным проточной цитофлюорометрии РМГ определяется на мембранах моноцитов на ранних стадиях их созревания и является маркером некоторых форм хронического лейкоза. Поэтому его относят к антигенам диффе-ренцировки этих клеток.
Иммуногистохимическое исследование 107 меланом человека показало, что при прогрессировании опухоли содержание в ней РМГ и РАП заметно снижается. В большинстве случаев отмечалось значительное сходство распределений этих белков в опухолевой ткани. С помощью проточной фитофлюоромет-рии установлено, что экспрессия РМГ на цитоплазматической мембране клеток меланом резко снижается в присутствии активатора плазминогена урокиназного типа, который в больших количествах продуцируют клеточные линии с высокой способностью к метастазированию. В этих клетках определяется высокий уровень экспрессии мРНК РМГ, тогда как выраженность экспрессии мРНК РАП была примерно одинаковой во всех культурах.
В тканях низкодифференцированного рака молочной железы РМГ определяется иммуногистохимически только в макрофагах и фибробластах, но не в самих опухолевых клетках.
Связанный с беременностью альфа2 гликопротеин
После внутривенной инъекции крысам комплексов меченного Iіь человеческого СБАГ с химотрипсином период их полувыведения из кровотока равняется 2,3 минуты. Через 6 минут около 67% изотопа определяется в печени и только 3% в селезенке, как у самцов, так и у беременных самок. Его аккумуляция в других органах и в плаценте была крайне незначительная. Период полувыведения нативного СБАГ превышает 30 минут. Комплексы СБАГ-химотрипсин специфически поглощаются in vitro крысиными гепатоцитами и адипоцитами, а также человеческими фибробластами, гепатоцитами и моноцитами-макрофагами даже при 4С. Комплексы МГ-трипсин полностью блокируют связывание модифицированного СБАГ с этими клетками. Приведенные факты свидетельствуют о наличии мембранных рецепторов, общих для обоих белков.
Нативный СБАГ обнаруживает сродство к достаточно крупному белку нейтрофилов (105кДа), но его другие формы с ним не взаимодействуют. По-видимому, этот протеин является ассоциированной с мембраной протеиназой. Комплекс СБАГ с ПЛ в условиях иммуноблотинга связывался с достаточно крупным белком тромбоцитов. Это позволяет предположить наличие нескольких рецепторов для различных форм макроглобулинов в составе мембран клеток крови.
Влияние макроглобулинов на функциональное состояние мононуклеар-ных клеток (МНК) изучалось многими исследователями. Ещё в 1976 году Gout-ner А. и его коллеги обнаружили значительное подавление пролиферации лимфоцитов, индуцированной антигенами, экзогенным нативным МГ (0,04-0,6г/л).
Уже давно известно, что СБАГ способен резко подавлять пролиферацию лимфоцитов, индуцированную лектинами, а также ответ в СКЛ. Наиболее
сильный ингибиторный эффект этого макроглобулина наблюдался при его концентрации в культуре 150-400мкг/мл, и он не усиливался при дальнейшем её увеличении. Его иммуносупрессивная активность была значительно выше, чем таковая у ТБГ, АФП, ХГЧ и плацентарного лактогена.
Замечено, что он более резко угнетает пролиферацию Т-лимфоцитов, чем Т-зависимую пролиферацию В-клеток. Снижение его ингибирующего эффекта также прогрессировало пропорционально сроку беременности и не зависело от характера стимуляции клеток.
СБАГ ингибирует фагоцитоз кишечных палочек нейтрофилами и элек-трофоретическую подвижность макрофагов, однако, влияет ли это на индукцию иммунного ответа пока не известно.
1.3 БЕЛКИ БЕРЕМЕННОСТИ КАК ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЧЕЛОВЕКА
Патологические изменения концентрации МГ, СБАГ и ТБГ в сыворотке крови наблюдаются при многих заболеваниях человека. Интерес к данным белкам вызван наличием у них определенной иммуномодулирующей активности, способности воздействовать на метаболизм цитокинов, а также других уникальных биологических свойств. Показано, что они играют важную роль в патогенез ряда синдромов и, нередко, проявляют себя как маркеры некоторых патологических состояний.
Альфа2-макроглобулин
Диагностическое значение альфа2-макроглобулина довольно высоко. Снижение концентрации белка в сыворотке крови отмечается многими авторами при остром панкреатите, вирусном гепатите, ревматическом остеоартрозе, на ранних стадиях ожоговой болезни [31; 39; 98; 160; 212].
Увеличение концентрации альфа2-макроглобулина в сыворотке крови отмечается при большинстве острых воспалительных заболеваний [104; 106;
107]. Значительное повышение уровня альфа2-макроглобулина в плазме крови отмечается у нефротических больных, а также у больных при ранних отторжениях трансплантата [247]. У больных сахарным диабетом обнаружены высокие концентрации белка, особенно при нарушении функции почек [11; 206].
Установлена прямая корреляция между увеличением уровня белка и ме-тастазированием опухоли [67].
Наряду с диагностическим значением, в последнее время изучается возможность применения альфа2-макроглобулина в качестве терапевтического средства. В ряде работ [34; 44; 45; 64; 220; 132] указывается на значительное облегчение течения лучевой болезни при введении животным этого белка. Внутривенное введение альфа2-макроглобулина животным, подвергшимся воздействию летальной ионизирующей радиации летальной дозы, нормализовало синтез РНК и ДНК в костном мозге и лимфоидных органах, чем значительно снижало частоту летальности [44; 64; 220; 132].
По мнению авторов [64; 220], белок влияет на дифференциацию, а не на пролиферацию лимфоидных клеток. Некоторые из этих эффектов связаны с тем, что белок как бы "убирает" клеточные остатки после облучения [132; 155; 220].
Связанный с беременностью альфа2-гликопротеин
В 1970 году Татаринов Ю.С. [53], а в дальнейшем Berne В.Н. [86], Bohn Н. [91], Никулина Д.М. и Трубников Г.А. [58] выявили СБАГ в сыворотке крови у больных с воспалительными заболеваниями и опухолевыми процессами, после чего СБАГ стали относить к белкам "острой фазы" [38].
Многие авторы относят СБАГ к группе неспецифических маркеров рака [5; 23; 25; 26; 85].
Afonso I. и Alvarez В. [68] в 1964 году первыми предположили, что усиление синтеза СБАГ является результатом повышения уровня эстрогенов и прогестерона. В дальнейшем, Bayer Н. и Kadach D. [83; 158], Klausch В. et al.
[161], Dunston G. et al. [118], подтвердили зависимость продукции этого белка от уровня эстрогенов.
Многими отечественными и зарубежными исследователями была доказана роль СБАГ в патогенезе аутоиммунных заболеваний [84].
Доказано повышение уровня СБАГ в сыворотке крови небеременных женщин, принимавших лечебные гормональные препараты, а также оральные контрацептивы [26; 45; 190].
В 1990 году было показано, что стероидные половые гормоны не обнаруживают стимулирующих свойств на биосинтез СБАГ [23; 101].
Трофобластический бета-глобулин
В настоящее время тесты на ТБГ широко применяются для ранней диагностики беременности [40; 48] и для диагностики патологических осложнений беременности [57; 157; 175; 191; 209].
По данным Никулиной Д.М. и соавт. [39] при поздних токсикозах беременности уровень ТБГ снижается, причем уменьшение концентрации белка прямо пропорционально тяжести токсикоза.
По мнению Посисеевой Л.В. и соавт. [43], наиболее неблагоприятно для прогноза перинатальной патологии резкое понижение уровня ТБГ в 29-36 недель и повышение в 37-40 недель беременности.
Уровень сывороточного ТБГ может служить косвенным ориентиром состояния плода. Некоторые авторы [36; 175; 157; 191] отмечают, что при внутриутробной гибели плода, угрожающем выкидыше и неразвивающейся беременности наблюдается быстрое падение уровня ТБГ в сыворотке крови.
В 1974 году Татаринов Ю.С., Меснянкина Н.В. и Никулина Д.М. [56; 57] обнаружили ТБГ в больших количествах в сыворотке крови больных пузырным заносом и хорионэпителиомой. Причем прослеживалась четкая прямая зависимость сывороточной концентрации ТБГ от стадии и распространенности процесса. Концентрация сывороточного ТБГ при хорионэпителиоме была значительно выше, чем при пузырном заносе. Никулиной Д.М. и соавт.[37] разра-
ботаны иммунохимические тесты для клинической диагностики трофобластных и некоторых других опухолей. В настоящее время эти тесты широко применяются в клинической диагностике [38].
Никулиной Д.М. и Воробьевой Т.Б. разработан также дифферинциаль-но-диагностический тест на переношенную и пролонгированную беременность [37; 17].
По данным Воробьевой Т.Б. [17] и Fialova L. et al. [113] уровень ТБГ в сыворотке крови и амниотической жидкости снижается после 42-й недели беременности (в сыворотке крови - с 0,16 до 0,12 г/л), что может служить диагностическим и прогностическим подспорьем при переношенной беременности.
1.4 СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ЛОКАЛИЗАЦИИ И МЕСТЕ СИНТЕЗА БЕЛКОВ БЕРЕМЕННОСТИ
В 1971 году Татаринов Ю.С. и соавт. [50; 52] и Bohn Н. [93], опираясь на результаты иммунохимических исследований, предположили, что синтез ТБГ осуществляется в плаценте.
В 1976 году Афанасьева А.В. и соавт. [4], методами непрямой имму-нофлюоресценции и иммуноавторадиографии показали, что синтез ТБГ происходит в цитоплазме клеток Лангганса и протоплазме хорионального синцития, что позволяет считать ТБГ абсолютным маркером беременности [4; 19].
Биологическая роль ТБГ, в настоящее время, неизвестна. По данным Bohn Н. [93], в результате проведения гормонального теста на инфантильных крысах, не было выявлено действия ТБГ на матку, яичники, семенники, семенные пузырьки, простату, надпочечники, щитовидную железу и тимус.
Bohn Н. [91] считает, что местом синтеза СБАГ является печень. Однако исследования Home et al. [147] показали, что СБАГ синтезируется в эстрогенза-висимых лейкоцитах, источником его являются моноциты и Т-лимфоциты.
Thomson et Home [151], Lundgren E. et al. (1979) установили, что этот
белок может синтезироваться и В-лимфоцитами и сорбироваться мембранами
клеток печени.
В дальнейшем Home et al. [147], Chowdhiry et al. [101] показали, что местом синтеза СБАГ являются также плазматические клетки.
Биологическое значение СБАГ остается недостаточно изученным. Предположение, что он может быть средством транспорта для эстрогенов [83; 158; 161] было опровергнуто Hofmann R. et al. [144] методами радиоиммуполо-гического исследования.
Schoutz В. et al. [215], изучая СБАГ на ФГА-стимулированной лимфо-цитарной культуре, пришли к выводу, что данный белок обладает иммуносу-прессивной активностью. Иммуносупрессивные свойства СБАГ были подтверждены в опытах in vivo и in vitro [32; 212].
Home C.H.W. et al. [118; 148], lames [152] считают, что СБАГ участвует в регуляции местных иммунных реакций в клетках слизистой, а также обладает выраженными иммуносупрессивными свойствами по отношению к различным звеньям иммунной системы.
Мальцева Н.В. и соавт. [32] проводили сравнительные исследования иммуносупрессивных свойств СБАГ по отношению к лимфоцитам беременных женщин. Исследования показали, что в первом триместре беременности иммуносупрессивное действие СБАГ на клетки было максимально выраженным, во втором триместре иммуносупрессивные свойства СБАГ выражены в меньшей степени, а в третьем триместре - в еще меньшей.
После того, как была обнаружена способность СБАГ образовывать комплексы с протеиназами и менять их ферментативную активность, Sand et а1.,в 1985 году [26], а затем Gliemann et al. (1986) и другие стали относить СБАГ к группе так называемых "ингибиторов протеиназ".
В 1992 году Christensen U. et al. [105] предложили модель механизма реакции связывания СБАГ с протеиназами, включающую четыре этапа:
1. расщепление участка затравки СБАГ-димеров энзимом.
2. быстрая связь энзим-СБАГ (димерных) видов с нативным СБАГ
или другими энзим-СБАГ (димерами), приводящая к высвобождению одной из
связанных молекул энзима.
3. реакция трех тиоловых эфиров промежуточного продукта энзим-
СБАГ (тетрамера) со связанной внутренней молекулой энзима или с внешней
молекулой.
4. гидролиз последнего тиолового эфира и разрушение энзим-
СБАГ (тетрамерных) комплексов и образование фрагментов, некоторые из ко
торых имеют величину СБАГ (димера) со связанным энзимом.
Philip A. et al. [200] в 1994 году, показали, что СБАГ связывает трансформирующий рост фактор.
Установлено, что СБАГ не связывает стероиды и не связывает и не стимулирует продукцию простогландинов (Damber М, 1977).
Petersen СМ. et al., в 1988 году [197], показали, что гепатоциты человека обладают рецепторами для комплексов СБАГ-протеиназа. На основании данных цитохимического анализа они сделали вывод, что гепатоциты играют ведущую роль при удалении комплексов СБАГ-протеиназа.
Birkenmeier G. et al., в 1989 году [87], изучали гидрофобные свойства СБАГ методом аффинно-фазовой хроматографии. Исследования показали, что обработка СБАГ химотрипсином значительно повышала поверхностную гид-рофобность по сравнению с гидрофобностью нативного белка. Не обнаружено различий в гидрофобном взаимодействии между нативным и обработанным метиламином СБАГ [87].
МГ (как и СБАГ) обладает выраженной антипротеазной активностью. Связывание протеиназ осуществляется определенным фрагментом субъединицы МГ, не затрагивая каталитически активного центра фермента. [210; 74; 76].
Полагают, что биологическая функция МГ заключается в сохранении связанного с ним плазмина от аутолиза и инактивирующего действия других ингибиторов протеиназ крови [242; 184; 73]. МГ является одним из ингибиторов свертывания, обеспечивая около 25% антитромбинного потенциала плазмы крови [1; 28]. Другие сериновые протеиназы гемостаза (12-а,9-а,7-а факторы) с МГ не взаимодействуют [226].
МГ полностью подавляет биологическую активность калликреина плазмы [137; 174].
Синтез и секреция МГ осуществляются, в основном, гепатоцитами человека, начиная с 29-30-го дня внутриутробного развития [133], на протяжении всей жизни [23; 133; 185; 187]. Кроме того, МГ синтезируется и секретируется лимфоидными клетками, моноцитами, макрофагами [154]. В-лимфоциты также могут синтезировать МГ, но не выделяют его в среду [244].
Физиологическое значение МГ многогранно. МГ нельзя назвать ингибитором протеиназ в полном смысле этого слова, так как он ингибирует проте-олитическую способность протеиназ в отношении высокомолекулярных белков, сохраняя в то же время активность фермента в отношении пептидов и низкомолекулярных синтетических субстратов [135; 249]. Поэтому предпочтительнее назвать МГ не ингибитором, а ограничителем - "рестриктором" ферментативных функций протеиназ [249].
Свойство белка превращать протеиназы в пептидазы, гидролизующие низкомолекулярные токсические пептиды, вероятно, имеет определенное значение в защите организма от бактериальной инфекции [121].
Одной из предполагаемых функций белка является удаление активированных ферментов протеолиза [15; 133; 226; 249]. Комплексы МГ с плазмином, тромбином, трипсином и другими протеиназами, исчезают из кровообращения значительно быстрее, чем свободный МГ [90]. Период полураспада комплекса МГ-протеиназа невелик (30 мин.) [138; 88].
Описана способность МГ образовывать комплексы с цинком [66].
Доказано, что МГ обладает иммуносупрессивными свойствами по отношению к различным звеньям иммунной системы [148; 152]. Наиболее сильно выражено иммуносупрессивное действие белка по отношению к лимфоцитам в течение беременности, особенно в первом триместре [32].
МГ влияет на способность нейтрофилов и макрофагов мигрировать в участки воспаления [155].
Биологическая роль белков беременности (ББ).
Спектр сывороточных белков у беременных женщин значительно отлича ется от такового у небеременных. Ещё в начале 20-го века в 1903 г. Zangemeister [255] описал увеличение глобулярных фракций при нормальной беременности. В течение последующих десятилетий многими авторами были показаны коли чественные изменения в профиле сывороточных белков при беременности. " Удобнее всего рассматривать эти изменения, основываясь на классифи кации сывороточных белков по их электрофоретической подвижности. Longsworth L.G. et al., в 1945 г. [172] изучали белковый спектр сыворот ки крови при нормально протекающей беременности методом свободного элек трофореза. При этом они не только подтвердили полученные ранее данные об уменьшении уровня альбуминов и увеличении уровня глобулинов, но и выяс нили, что увеличение глобулинов происходит за счет альфа- и бета-глобулинов, в то время как количество гамма- глобулинов не изменялось. Эти данные позд нее были подтверждены многими исследователями [7; 196; 251].
Следует отметить, что многочисленные литературные данные об изменении уровня различных фракций глобулинов при беременности, неоднозначны, а зачастую и противоречат друг другу.
Так, Longsworth L.G. et al. [172], Pozzi P.C. [203] считали, что альфа- и бета- глобулины увеличиваются в одинаковой степени.
Boselli A et al. [95], Bayer Н. [80], Smith Е. et al. [216], напротив, нашли, что бета-глобулины увеличиваются в большей степени, чем альфа-глобулины.
Вурманн Ф., Лийвранд В.Э. [31], De Alvarez R.R. et al. [108], напротив, показали, что альфа-глобулины увеличиваются в большей степени, чем бета-глобулины.
Имеются данные о равноценном повышении уровня всех фракций глобулинов при беременности [21; 201].
По сведениям Roszkowsky I. [208], Alvarez-Pita С.[72], Wirken Н. et al. [251], при беременности, наряду с повышением уровня альфа- и бета-глобулинов, происходит одновременное падение уровня гамма-глобулинов.
Отличаются также данные различных авторов относительно динамики уровней фракций глобулинов на протяжении беременности.
Fakhri О. [ПО] и Mac Gillivray Let al. [178] утверждают, что содержание альфаі- , альфа2- и бета-глобулиновувеличивается постепенно, по мере развития беременности, а содержание гамма-глобулинов - снижается до 2-го триместра беременности и в дальнейшем, до конца беременности, не изменяется.
По данным Лийвранд В.З. [31], уровень альфа- и бета-глобулинов увеличивается в течение всей беременности (колебания же гамма-глобулинов незначительны). Причем содержание альфа-глобулинов возрастает постепенно, с начала беременности до 8-го лунного месяца, чуть заметно снижаясь на 9-Ю лунных месяцах.
Имеются сведения, что содержание альфа2-глобулинов в первые три месяца беременности повышается, на 4-5 месяцах слегка падает и, начиная с 6-го месяца, увеличивается с каждым месяцем беременности [47; 46].
В периоде родов уровень глобулиновых фракций крови не претерпевает значительных изменений по сравнению с таковым в конце беременности [31; 208].
В послеродовом периоде содержание альфа!-, альфа2- и бета-глобулинов постепенно снижается, в то время как содержание гамма-глобулинов слегка повышается [7; 31].
К хорошо изученным белкам, повышающим свой уровень при беременности, относятся: альфаг-макроглобулин, гаптоглобин, церулоплазмин (все зона альфа-глобулинов) и трансферрин (зона бета-глобулинов) [30]. Сам факт количественных отличий в спектрах сывороточных белков крови беременных и небеременных имеет, безусловно, большое значение в биологии и медицине.
В 1959 году Smithies [219], методом электрофореза на крахмальном геле в зоне альфа2-глобулинов обнаружил дополнительную фракцию, которая отсутствовала у небеременных. Smithies назвал эту фракцию зоной беременности [219]. Частота выявления этой зоны увеличивалась по мере увеличения срока беременности [69]. "Зона беременности" не была выявлена ни у одного здорового мужчины и у здоровой небеременной женщины.
В дальнейшем многие авторы подтвердили наличие белковой фракции в сыворотке крови, специфичной для беременности [50; 89; 140; 162].
В результате дальнейшего изучения "зоны беременности" методом им-муноэлектрофореза в агаре, удалось идентифицировать в ее составе до пяти антигенных компонентов [50; 79; 89; 140; 143; 162].
В 1959 году Мс Laren S.A. et al. [179] получили антисыворотку против сыворотки крови здоровых беременных женщин. С помощью этой антисыворотки была обнаружена дополнительная полоса преципитации (при иммуно-диффузии в агаровом геле), которая отсутствовала в сыворотке у небеременных.
В 1966 году Bayer Н. [81], применяя метод диффузии в агаре по Оухтер-лони и иммуноэлектрофорез с использованием различных антисывороток, обнаружили в сыворотке крови беременных женщин два антигенных компонента, не обнаруживаемых в сыворотке крови небеременных.
Bohn Н., в 1971 году [89] исследовал сыворотку крови беременных женщин методом электрофореза в полиакриламидном геле. При этом было обнаружено четыре белка, характерных для беременности.
Аналогичные находки были сделаны и другими авторами [19; 54; 55; 91]. Следует отметить, что "белки беременности" отсутствуют, или находятся в очень малых количествах в сыворотке крови небеременных женщин и здоровых мужчин [4; 19; 54; 55; 100].
Продукция ББ при патологии беременности
МГ, СБАГ и ТБГ изучались многими авторами как потенциальные маркеры осложненных вариантов течения беременности и гинекологических заболеваний. Ежегодно в мире появляются десятки публикаций, в которых содержится новая информация об их роли в регуляции репродуктивной функции.
Доказано, что для нефротического синдрома характерно увеличение концентрации МГ в сыворотке крови, которое имеет пассивный характер и поэтому коррелирует с уровнем протеинурии [234; 229].
У пациенток с послеродовым эндометритом, начиная с 1-х суток, выявлялось низкое содержание МГ в течение всего периода наблюдения. Концентрация этого белка у родильниц с осложненным течением послеоперационного периода была также сниженной, по сравнению с контрольной группой, однако незначительно отличалось от таковой у родильниц. Стойкая депрессия уровня МГ в сыворотке крови, характерная для послеродового сепсиса и перитонита, является одним из критериев генерализации инфекционного процесса [254]. При локализованных формах гнойно-септических заболеваний концентрация МГ повышалась в начале лечения, снижалась в период манифестации симптомов и нормализовалась только по мере редукции воспаления [254]. При мастите колебания его сывороточного уровня были менее выраженными, чем при эндометрите.
Не исключено, что удаление из циркуляции таких мощных иммуносу-прессоров как МГ и СБАГ приводит к усилению ответа иммунной системы матери на инфекционный процесс [153; 156; 159].
При инсулинзависимом диабете у беременных концентрация МГ в сыворотке крови имеет тенденцию к снижению, а при гипертензии она, напротив, возрастает [171; 246].
Компенсаторные реакции, типичные для сахарного диабета, могут быть прослежены на субклеточном и клеточном уровне в виде повышения функциональной активности синцитиотрофобласта [20]. В результате нередко усиливается продукция эстрогенов, которые относятся к стимуляторам синтеза СБАГ [109]. Возможно поэтому его концентрация в сыворотке крови матерей, страдающих сахарным диабетом, часто бывает повышенной, причем после 24 недели определяется её отчетливый градиентный рост [234]. Если во II половине беременности на фоне данного заболевания развивается пролиферативная ретинопатия, то наблюдается отчетливое снижение уровня СБАГ [234], а при её молниеносной форме он часто ниже 150мкг/мл [98]. Депрессия уровня СБАГ у части больных предшествовала появлению клинических симптомов. Следовательно, можно использовать в качестве маркера микроциркуляторных нарушений при декомпенсации сахарного диабета у беременных.
Выявлено некоторое снижение СБАГ при поздних токсикозах, причем оно было пропорционально их тяжести [234; 98]. Снижение концентрации СБАГ в сыворотке крови может нивелироваться нарастающей гиповолемией, которая играет важную роль в патогенезе эклампсии. Поэтому при тяжелых формах гестоза его уровень у некоторых пациентов мало отличался от такового при неосложненном течении беременности [255].
Отмечается снижение содержания СБАГ и ТБГ в сыворотке крови в III триместре беременности у носительниц патогенной и условно-патогенной флоры в цервикальном канале [188]. В среднем, уровень СБАГ у этих женщин более, чем в 2 раза ниже, чем у беременных, у которых идентифицировались лишь непатогенные штаммы. Предполагается, что ограничение биосинтеза данных иммуносупрессоров направлено на создание более оптимальных условий для активации распознавания потенциально опасных штаммов иммуноком-петентными клетками и их дальнейшей селективной элиминации.
Достаточно сложно объяснить изменение концентрации СБАГ при резус-конфликте. Легкой форме гемолитической болезни новорожденных сопутствовало нормальное содержание СБАГ, ТБГ, IgG, IgA и IgM в сыворотке крови матери. Гибели новорожденных в течение первых 3-х суток после родов предшествовала депрессия уровней СБАГ и IgG в сочетании с высокой продукцией ТБГ в III триместре. В то же время снижение концентрации СБАГ на фоне нормального содержания ТБГ и иммуноглобулинов в течение всей беременности часто наблюдалось при беременности резус-изосенсибилизированной женщины резус-отрицательным плодом. Эти показатели имели более высокую прогностическую ценность, чем титр противорезусных антител у беременных, который совершенно не зависел от тяжести гемолитической болезни новорожденных [16; 6].
Явное увеличение сывороточного содержания СБАГ наблюдалось у девушек при дефиците соматотропного гормона [112]. Кортикостероидная терапия в I половине беременности вызывала некоторую депрессию его уровня. В обзоре Munck Petersen С. [188] приведены убедительные доказательства отсутствия прямого стимулирующего воздействия гормонов на содержание МГ и СБАГ в сыворотке крови. Скорее всего, эстрогены, гестагены и другие гормоны относятся к слабым вторичным модуляторам метаболизма этих белков.
Методы очистки антигенов и получения антисывороток
Процесс получения антисывороток к СБАГ и ТБГ состоял из следующих этапов: приготовление иммунизирующего Аг (иммуногена); иммунизации животного; оценки полученной Ас; обработки Ас, включая при необходимости адсорбцию лиофилизированной плазмой доноров. Приготовление АГ и получение антисывороток составило первую часть собственных исследований.
Исходным биоматериалом для выделения и очистки исследуемых белков-антигенов служила сыворотка крови женщин с поздними сроками беременности. В работе использовали сочетание методов высаливания, ионообменной, гель-проникающей хроматографии и препаративного иммуноэлектрофореза. Идентификацию Аг в препаратах с каждого этапа очистки проводили классическими иммунохимическими методами: иммунодиффузионным титрованием и аналитическим иммуноэлектрофорезом. При иммунизации использовали в качестве лабораторных животных кроликов, которым в течение месяца вводили антиген дробными дозами.
Антисыворотки на исследуемые белки получали иммунизацией кроликов породы шиншилла, вес 2-3 кг, дробными дозами антигена в течение месяца.
В качестве антигенов для получения моновалентных сывороток на исследуемые белки использовали выделенные из крови беременных женщин вышеуказанными методами препараты СБАГ и ТБГ.
Для первой инъекции готовили смесь антигенного материала с полным адьювантом Фрейнда в соотношении: антигена - 0,4 мл, адьюванта Фрейнда -3,2 мл, убитых туберкулезных палочек - 4 мг и 0,4 мл 0,15М раствора хлорида натрия. Смесь вводили подкожно в 6-8 точек. После трехдневного перерыва инъекции возобновляли. Антиген вводили с равным объемом 2,5% раствора алюмокалиевых квасцов через день в возрастающих дозах от 0,05 до 0,25 мл. Всего 10 подкожных и внутримышечных введений. Заключительную инъекцию производили внутривенно или внутрибрюшинно в дозе 0,3 мл раствора антигена без дополнителей. Общее количество белка, вводимого животному за весь цикл иммунизации, составляло 150-200мг.
Реиммунизацию проводили в два дня с введением 100-120 мг белка в возрастающих количествах тремя инъекциями: подкожной, внутримышечной и внутривенной. Интервалы между инъекциями составляли 90-120 мин.
Кровь у кролика брали на 7-9 день после заключительного введения антигена из краевой вены уха в количестве 40-50 мл. Взятую кровь обводили по стенке стакана стеклянным капилляром для образования компактного сгустка. Образовавшуюся сыворотку сливали через несколько часов отстаивания в холодильнике.
Полученная антисыворотка проверялась на моноспецифичность методом иммунопреципитации: сопоставление с сывороткой крови беременных женщин и эталонной антисывороткой на исследуемый белок. При наличии дополнительных линий преципитации производили истощение полученной антисыворотки последовательно лиофилизированной плазмой донора. Полученные антисыворотки проверяли на моноспецифичность. При необходимости, процедуру истощения повторяли.
В работе использованы как парафиновые срезы, так и срезы, полученные на криостате. Приготовление парафиновых срезов осуществлялось на микротоме санного типа по стандартной методике. Толщина парафиновых срезов составляла 4-5 мкм, и 5-7 мкм для криостатных срезов.
Всего для гистологических и иммуногистохимических исследований образцов тканей было использовано 6 методов окраски: гематоксилин-эозин, по Ван-Гизону, альциановым синим, прочным зеленым при рН 2,2 на общий белок, на гликоген по Бесту, иммунофлюоресцентный анализ на СБАГ (табл 2).
Окраска гематоксилин-эозином На срез наливали несколько капель профильтрованного гематоксилина и окрашивали 3-5 минут. После этого сливали краску обратно в рабочую склянку, а стекло со срезом промывали в воде в течение 3-5 минут, ожидая посинения среза. Только что окрашенные гематоксилином срезы, а следовательно, и ядра клеток имеют красновато-фиолетовый фон, который при достаточном промывании в воде, благодаря её щелочности, переходит в синий. Синие ядра клеток будут более контрастными при сочетании с эозином.
Хорошо промытый и посиневший срез извлекали опять из воды и наливали на него несколько капель раствора эозина, окрашивая 3 минуты. После этого эозин сливали, а стекло со срезом споласкивали в воде.
Затем на срез наливали последовательно 70%, 80%, 100%) спирт на 3-5 минут для каждого, после чего удаляли спирт и, не давая срезу подсохнуть, наливали на срез толуол, выдерживая до просветления.
После удаления остатков ксилола на срез помещали каплю бальзама и накрывали покровным стеклом, избегая попадания пузырьков воздуха.
Окраска по способу Ван-Гизона
Срезы помещают в гематоксилин на 3-5 минут, затем прополаскивают в двух порциях водопроводной воды. Окрашивают в пикрофуксине 2-3 минуты, и быстро споласкивают в воде в течение 10-15 секунд. После проводки в спиртах обрабатывают толуолом и заключают в бальзам.
Изучение общего белка и белков беременности в тканях плаценты человека
Впервые было проведено параллельное исследование гистохимическими методами общего (ОБ) и специфического белка (СБАГ) в клетках и тканях отдельных органов человека, а именно печени, толстого кишечника, эндометрия, плаценты. Кроме того, было проведено исследование общего белка (ОБ) и СБАГ в эндометрии и толстом кишечнике при аденокарциноме. Были использованы как взаимодополняющие методы выявления ОБ в эндокриноцитах и иммуногистохимическое определение с помощью специфической тест-системы мест предполагаемого синтеза СБАГ.
Было установлено, что ОБ во всех изученных органах имеет сходную локализацию и распределен в цитоплазме экзокриноцитов чаще диффузно.
Исключением является печень, где общий белок представлен множественными глыбками, сливающимися в гепатоцитах друг с другом. Поэтому даже при визуальном наблюдении можно отметить его увеличенное содержание. Далее, в ряду по степени концентрации ОБ, располагаются столбчатые экзокрино-циты аппендикса, затем симпластотрофобласт плаценты, экзокриноциты желез эндометрия и столбчатые экзокриноциты толстого кишечника.
Концентрация ОБ в разных органах колеблется от 174,07 до 752,28 усл.ед., то есть изученные органы характеризуются высокой гетерогенностью функциональной активности. По-видимому, это способствует оптимальной адаптации к выполняемым функциям.
Было проведено количественное определение общего белка в клетках печени, аппендикса, плаценты, эндометрия и толстого кишечника. Данные ци го-фотометрического исследования приведены на гистограмме (Рис. 20).
Наличие большого количества белка в гепатоцитах согласуется с выполнением печенью большого объема метаболических реакций, здесь идут наиболее напряженные метаболические процессы. Учитывая, что аппендикс является элементом защитной системы организма, выработка достаточно большого количества белка столбчатыми экзокриноцитами вполне оправдана. Часть этих белков вырабатывается иммунокомпетентными клетками общей иммунной системы слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта и поступает в столбчатые экзокриноциты для борьбы с вредоносным агентом. Наличие высоких значений показателя также может объясняться тем, что здесь идут интенсивные иммунные процессы, где задействованы иммуноглобулины А. В плаценте уменьшение данного показателя может быть обусловлено тем, что синтезируемый здесь секрет очень быстро поступает в кровь, не успевая накапливаться в самой ткани. Изучение общего белка в малигнизированных тканях позволило констатировать, что локализация общего белка сохраняется, но существенно меняется количественное содержание (Рис 21). Так, при аденокарциноме толстого кишечника количество общего белка в клетках эпителия увеличивается в 2 раза, при аденокарциноме в эндометрии в полтора раза.
Исследование площади этих же клеток показывает сходные результаты, но площадь малигнизированных клеток эндометрия больше в 1,4 раза. В то же время площадь столбчатых эпителиоцитов толстого кишечника, напротив, уменьшается при малигнизации тканей, что возможно связано с усилением выделения секрета в просвет кишечника (Рис. 22).
Полученные в работе данные позволяют предположить по формализованному показателю увеличения размеров ядер железистых эпителиоцитов эндометрия с 21,48 ± 1,8 до 25,86 ± 1,9 условных единиц, при несущественном снижении размеров ядер толстого кишечника с 23,3 ± 1,8 до 22,51 ± 2,0 условных единиц о влиянии на орган гормональной составляющей.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об особенностях обмена белка, как в нормальных, так и малигнизированных клетках и тканях. Вместе с тем, представляется важным знать динамические характеристики отдельных биологически важных компонентов клетки, а именно специфических белков, таких как СБАГ.
Поскольку обычными гистохимическими методами этот белок в клетках не выявляется, был применен метод иммунофлюоресцентного анализа со специфической антисывороткой или реакция иммунофлюоресценции (РИФ), позволяющий визуально идентифицировать исследуемый белок в качестве индивидуального антигена.
Ранее было установлено, что СБАГ в норме синтезируется в печени, моноцитах и плазматических клетках. Кроме того, этот белок могут синтезировать лейкоциты и моноциты матери. Присутствие его в других органах не описано.
Анализ полученных результатов РИФ позволяет констатировать, что СБАГ выявляется во всех исследованных органах: толстом кишечнике, аппендиксе, эндометрии, печени и плаценте.
С целью объективизации данных РИФ на СБАГ были использованы формализованные показатели. На первом этапе проводилось фотографирование РИФ каждого исследуемого органа: печени, аппендикса, толстого кишечника, эндометрия и плаценты. На втором этапе микрофотографии оценивали с помощью программно-аппаратного комплекса «Морфолог» и по оптической пло гно-сти РИФ определяли концентрацию СБАГ в тканях в условных единицах. Таким образом, при анализе изображения были получены инвертированные данные. То есть, чем ниже оптическая плотность исследуемого образца, тем выше содержание белка в тканях.
Впервые установлено, что в тканях толстого кишечника и эндометрия концентрация СБАГ существенно возрастает при малигнизации .
В эндометрии местом локализации СБАГ определены экзокриноциты желез эндометрия. В толстом кишечнике и аппендиксе это были столбчатые эпителиоциты. В печени, предположительно, - фибробласты соединительной ткани, что согласуется с данными литературы. Сами гепатоциты не дали положительной реакции на СБАГ.
Проведенными исследованиями установлено, что аденокарциноматоз существенно влияет на содержание СБАГ в органе и соответственно на его синтез, но влияние проявляется в зависимости от органа в различной степени малигнизации.
