Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Представления о структуре и химическом составе соединительной ткани 9
1.1. Клетки костной ткани 9
1.2. Внеклеточный матрикс 12
1.3. Ремоделирование и развитие костной ткани 22
Глава 2. Материалы и методы исследования 30
2.1. Материалы исследования 30
2.2. Методы исследования 32
2.2.1. Подготовка материала к исследованию, определение воды и липидов... 32
2.2.2. Влажное озоление и определение минеральных компонентов 33
2.2.3. Исследование органических компонентов костной ткани 34
2.2.4. Разделение белков костной ткани 38
2.2.5. Электрофорез белков и ГАГ, выделенных из костной ткани 41
2.2.6. Методы определения активности ферментов 42
2.2.7. Статистические методы 44
Глава 3.Ре зультатыисследованийиихобсуждение 45
3.1. Возрастные и половые изменения количества коллагена и нуклеиновых кислот в костной ткани 45
3.2. Характеристика состояния углеводсодержащих компонентов костной ткани человека 55
3.3. Изменение содержания неорганических веществ и липидов в костной ткани человека в зависимости от пола и возраста 62
3.4. Исследование зависимости биохимических показателей состава костной ткани от паспортного возраста индивидуума 70
3.5. Исследование активности ферментов костной ткани 76
Заключение 84
Выводы 92
Литература 93
- Клетки костной ткани
- Материалы исследования
- Исследование органических компонентов костной ткани
- Возрастные и половые изменения количества коллагена и нуклеиновых кислот в костной ткани
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время в экономически развитых странах Европы и Америки, а в последние годы и России, наблюдается выраженное старение населения [59]. Эти демографические сдвиги представляют собой социально обусловленный процесс. Старение населения планеты делает актуальными ряд проблем социально-экономического и медико-санитарного характера. Сегодня исследователи уже говорят не о простом увеличении количества лет прожитой жизни человека, а о продлении его творческого долголетия [46; 47].
Старение костной ткани проявляется, прежде всего, интенсификацией и рассогласованием процессов костеобразования и резорбции, в результате чего развивается разрежение костной ткани — остеопороз [44]. Сенильный (возрастной) остеопороз определяется у подавляющего большинства людей старше 45—50 лет и является почти универсальным признаком старения организма человека. По данным ВОЗ, остеопоротические изменения выявляются у 15—50 % всего населения России старше 55 лет, при этом у 30% рарефикация кости настолько выражена, что может привести к переломам [79; 82; 103; 154].
Несмотря на огромное количество исследований по данной проблеме, невыясненными остаются вопросы об изменениях в химическом составе межклеточного матрикса кости, возникающих с возрастом, и схожести этих изменений с дегенеративными при различной патологии. С каждым годом увеличивается число остеопоротических переломов, лечение их весьма трудоемко и долговременно. Доля переломов у трудоспособного населения также увеличивается [10; 58]. Однако недостаточное знание механизмов этого заболевания не позволяет эффективно бороться с ним [79; 82]. Многие исследователи находят в основе патогенеза остеопороза потерю минеральной фазы кости [83], некоторые обнаруживают потерю костной ткани в целом [87; 108], и практически полностью отсутствуют данные о состоянии биополимеров костной ткани и органического матрикса.
Кроме этого, исследования костной патологии, проводимые непосредственно на биопсийном и аутопсийном материале, невозможны без сравнения со здоровой костной тканью, состав и строение которой изменяется в течение жизни. В связи с этим изучение возрастных особенностей строения кости становится актуальным и для понимания патологических процессов, протекающих в кости.
С развитием техники и урбанизацией населения России и других стран в последние десятилетия участились случаи массовых катастроф, ведущих к появлению неопознаваемых фрагментов тел их жертв. В связи с этим в бюро судебной медицинской экспертизы (СМЭ) все чаще возникает вопрос об определении пола и возраста трупа по его останкам [112]. На сегодняшний день нет общепринятой системы оценки возраста человека по остеологическим данным, за исключением методов с применением атомно-абсорбционной спектрометрии, которые недоступны подавляющему большинству бюро СМЭ.
Отсутствие достоверных данных о составе и строении костной ткани людей различного возраста определили направление предпринятых нами исследований. Их необходимость связана также с тем, что остаются неизученными различия в составе костной ткани мужчин и женщин. Кроме того, изучение минерального состава, характеристики состояния биополимеров и ферментных систем костной ткани человека позволят более точно определять возраст индивидуума в судебно-криминалистических целях.
Цель исследования. На основе биохимических показателей охарактеризовать возрастные изменения и половые отличия химического состава компактной и губчатой костной ткани человека.
Задачи исследования:
1. Охарактеризовать возрастные изменения химического состава компактного и губчатого вещества бедренной кости человека.
2. Изучить возрастное изменение количества минеральных веществ и отношения органической компоненты к неорганической в бедренной кости человека.
3. Оценить различия в составе компактной и губчатой костной ткани бедренной кости мужчин и женщин в возрастные периоды 21-35, 36-60, 61-74 и более 74 лет.
4. Исследовать различие содержания уроновых кислот(УК), сиаловых кислот (СК), гексозаминов (ГА), нуклеиновых кислот (НК), коллагена, кальция, фосфатов, магния в компактной костной ткани (КК) бедренной кости и губчатой кости (ГК) головки бедра человека биохимическими методами.
5. Исследовать ферментативную активность белков, выделенных из компактной костной ткани человека в различные возрастные периоды.
Положения, выносимые на защиту.
1 Биохимический состав и строение костной ткани человека зависят от пола и возраста. С возрастом наиболее изменяются содержание анионов (SO42", РО43") минеральной фазы костной ткани. Наибольшие половые различия наблюдаются во втором зрелом возрасте в составе и строении губчатой костной ткани, выражающиеся в достоверном изменении содержании уроновых кислот, увеличении сульфатов и превышающем, более чем в 5 раз содержании ДНК у женщин.
2 Активность биосинтетических процессов, протекающих в губчатой костной ткани человека, выше, чем в компактной кости, что выражается в большем содержании в губчатой кости количества нуклеиновых кислот и невысоком содержании коллагена.
Объекты исследования. Работа выполнена на базе лаборатории биохимии Государственного учреждения Российского научного центра
«Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова. Объектами исследований явились трупы людей, умерших от травм и других причин, не связанных с костной патологией, в г. Кургане (50 трупов). Материалом исследования служили: компактная и губчатая костная ткань, выделенная из бедренной кости человека в результате танаталогического вскрытия в бюро СМЭ г. Кургана. В ходе выполнения данной работы использовались биохимические методы, методы математической обработки результатов исследований.
Научная новизна исследования. Впервые комплексно изучены изменения содержания ионов Са2+, РО43", Mg2+, SO42", коллагена, нуклеиновых, сиаловых, уроновых кислот, гексозаминов, компактной и губчатой костной ткани человека в возрастном аспекте. Впервые в возрастном аспекте изучены активность щелочной и кислой фосфатаз в нормальной компактной костной ткани человека. Впервые показано различие в интенсивности биосинтетических процессов, протекающих в компактной и губчатой ткани человека, отражающееся на биохимическом составе кости. Впервые изучены различия в обменных процессах протекающих в костной ткани у мужчин и женщин в зрелом, пожилом и старческом возрасте.
Практическое значение, область внедрения. В комплексе оценены изменения в химическом составе костной ткани человека в течение жизни, что позволит внести ясность в исследование патогенеза сенильного остеопороза. По результатам работы в лабораторию биохимии Центра внедрены методы исследования, характеризующие состояние биополимеров костной ткани и методы получения биологически активных веществ. Показано, что результаты работы могут быть использованы при определении паспортного возраста в условиях бюро СМЭ. По теме диссертации оформлено два изобретения: «Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани и косметическое средство по уходу за кожей на основе выделенных гликозаминогликанов» (приоритетная справка на изобретение № 2003131580 033777 от 27.10.2003) и «Способ выделения коллагена из минерализованной соединительной ткани и косметическое средство на его основе» (приоритетная справка на изобретение № 2003134131 036658 от 24.11.2003).
Материалы диссертации включены в планы выполнения курсовых и дипломных работ студентов Курганского государственного университета.
Материалы работы доложены на первом Всероссийском симпозиуме «Возрастные изменения минеральной плотности костей скелета и проблем профилактики переломов», Курган, 2002; работа стала лауреатом республиканской итоговой научно-практической конференции молодых ученых и студентов республики Башкортостан с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины», Уфа, 2004; IX Российском конгрессе «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2004.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 10 печатных работ в республиканских и областных изданиях.
Объем и структура работы: диссертация состоит из введения, представлений о структуре и химическом составе соединительной ткани, материалов и методов исследования, результатов исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 191 работу (из них 113 отечественных, 78 зарубежных); изложена на 111 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 12 таблицами. Диссертационная работа выполнена по плану НИР РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова № 0.34/1-15 (номер государственной регистрации 01.2.00 109073).
Клетки костной ткани
В костной ткани различают несколько основных типов клеток это остеобласты, остеоциты, остеокласты, моноциты, макрофаги и некоторые другие [172; 181]. Остеобласты - клетки костной ткани, продуцирующие компоненты костного матрикса, имеющие характерные морфологические признаки, выявляющиеся на электроно микроскопическом уровне [57]. Известно, что остеобласты обладают развитым эндоплазматическим ретикулумом, комплексом Гольджи и множеством секреторных гранул, содержащих проколлаген [16]. Ядро в клетке расположено эксцентрично, цитоплазма резко базофильна. Зрелые остеобласты не способны к делению. Считают, что основная функция остеобластов заключается в синтезе всех продуктов матрикса, однако их роль в период созревания остеоида остается не выясненной [79]. Исследованию регуляции активности остеобластов посвящено много исследований [111; 173]. Отмечено, что регуляция активности остеобластов имеет многоступенчатый характер. В этот процесс вовлечены как системные факторы регуляции - гормоны, прежде всего паратиреоидный гормон (ПТГ) и соматотропный гормон (СТГ) [20; 96], так и локальные факторы роста - инсулинподобный фактор роста (ИПФР), трансформирующий фактор роста р (ТФР-Р) и др. Кроме этого, на активность костных клеток влияют механические нагрузки [39].
Остеоциты - зрелые неделящиеся клетки, расположенные в костных полостях или лакунах [79; 16]. Остеоциты образуются из остеобластов, которые в результате своей синтетической деятельности оказываются замурованными в обызвествленном матриксе. При этом интенсивность синтетических процессов в замурованных клетках резко падает [144; 138]. Тем не менее, остеоциты поддерживают нормальное состояние костного матрикса (и баланс Са и РО4 " в организме), обладая способностью не только вырабатывать его компоненты, но и частично растворять его. Они запускают локальный процесс перестройки костной ткани, ограниченной мелким участком скелета [120; 162; 188; 189].
Остеокласты - крупные многоядерные клетки, сформированные посредством слияния мононуклеарных клеток гемопоэтической природы, расположенных в костном мозге [175]. Эти клетки имеют ряд характерных особенностей строения. У остеокластов выделяют гофрированный край и светлую зону. Гофрированный край, как правило, обращен к резорбируемой поверхности, а светлая зона определяет место прикрепления остеокласта к матриксу. Цитоплазма остеокластов имеет ацидофильный характер. Остеокласт - первичная клетка, резорбирующая кость, которая может находиться в активном и неактивном состоянии. В активном состоянии остеокласты продуцируют гидролитические ферменты и ионы Н+, растворяя, таким образом, как органические, так и неорганические компоненты костного матрикса [120; 123; 189]. В настоящее время выяснены механизмы активации костной резорбции, однако непонятно, каким образом выбирается место резорбции и механизм прикрепления чистой зоны.
Большинство исследователей считают, что потенциальными предшественниками остеокластов являются моноциты и макрофаги, между которыми существует несколько отличий. Моноциты имеют складчатую мембрану, активную кислую фосфатазу, нескольких ядер и большую подвижность, но они не образуют гофрированный край, направленный к матриксу и их взаимодействие с участком кости происходит посредством фагоцитоза [181]. Одной из наиболее важных функций моноцитов и макрофагов является продукция фактора, некротизирующего опухоль а (ФНО-а), интелейкина 1а и р (ИЛ-1а, -3), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-ФСК) [171; 185].
По одной из наиболее распространенных теорий остеобласты и остеокласты, формирующие кость, происходят от мультипотентной стволовой клетки, которая является родоначальницей хрящевой, мышечной, жировой и других клеток соединительной ткани [163]. Из этой клетки сначала образуется скелетная клетка предшественница, которая в дальнейше м может давать начало костным клеткам, хондробластам и преостебластам. Наличие общей клетки предшественницы подтверждено экспериментально [141; 149]. К тому же, клетки предшественники присутствуют в зрелой костной ткани и обладают хондрогенными возможностями. Количество этих клеток может снижаться с возрастом, этим можно объяснить медленное заживление переломов в пожилом и старческом возрасте. [149].
Минерализованный матрикс костной ткани — уникальный секреторный продукт, создаваемый преимущественно клетками остеобластной линии [7; 79]. Он поддерживает структуру скелета под координирующим влиянием остеобластов и остеокластов [16; 73].
Коллаген. Коллагеновые волокна — главный компонент большинства соединительных тканей, а коллаген — наиболее распространенный белок. Молекула коллагена — спираль из трёх про-а-цепей. Длина подобной спирали — 300 нм, диаметр — 1,5 нм. Все типы коллагена содержат области с повторяющейся последовательностью из трёх аминокислот с глицином в третьем положении. Первая аминокислота в такой последовательности может быть любой, вторая — пролин, гидроксипролин или лизин [42]. Благодаря обилию поперечных связей между остатками лизина коллагеновые волокна обладают высокой прочностью [45; 75; 92]. Известно не менее 13 типов коллагена. Наиболее распространены коллагены первых пяти типов, остальные встречаются сравнительно редко и в небольших количествах; иногда в литературе их называют минорными [107]. Коллагены типов I, II и III образуют фибриллы с периодичностью 65 нм. Коллаген типа I — один из наиболее распространённых, синтезируется фибробластами, остеобластами [131; 180]. Коллаген типа II синтезируется хондробластами, хондроцитами, нейронами сетчатки, присутствует в стекловидном теле. Коллаген типа Ш входит в состав ретикулиновых волокон, образующих нежную поддерживающую сеть в некоторых органах и тканях, синтезируется фибробластами. Коллаген типа IV образует сетевидную основу базальных мембран, синтезируется большинством эпителиальных клеток. Коллаген типа V присутствует в кровеносных сосудах и в костном матриксе, синтезируется остеобластами [131; 180].
Материалы исследования
Исследования были выполнены на 50 трупах людей в возрасте от 17 до 84 лет, умерших от травм, и - по оценке эксперта патологоанатома не имевших явной костной патологии. Объектом исследования послужили 50 образцов компактной и 50 образцов губчатой костной ткани, выделенных из верхней трети диафиза бедренной кости и головки бедра трупов. Материал для исследования извлекался в соответствии с приказом Минздрава № 694 от 21 июля 1978 г. п. 2.24 «Инструкция о производстве судебно-медицинской экспертизы в СССР». Для отбора костной ткани по наружной поверхности бедра производилось тупое рассечение кожных покровов, мягких тканей и скелетировалась верхняя треть бедра. Вскрывалась капсула тазобедренного сустава и бедренная кость вывихивалась наружу. Пилкой Джигли резецировалась верхняя полусфера головки бедра высотой 1,5-2 см. После этого на уровне верхней трети диафиза по наружной поверхности бедренной кости выполнялись два запила на расстоянии 3 см друг от друга. Долотом высекался полуцилиндр кортикальной пластинки вместе с костным мозгом. Полученные образцы костной ткани после выделения запаивались в пластиковый контейнер, подвергались заморозке при -70 С и хранились не более одной недели до препарирования. Для изучения состава межклеточного вещества кости после предварительной размораживания образцов компактной ткани проводилось макроскопическое описание костной ткани. Отмечался цвет кости, наличие полостей, шероховатостей, оценивалась механическая прочность при измельчении. Далее образцы очищали от надкостницы и остатков костного мозга скальпелем, измельчали до кусочков размером 1 см . Губчатую кость скальпелем отделяли от хряща и, не задевая субхондральной кости, костными кусачками Люера отбирали пробы для исследования. Для объективизации результатов исследования обработки забор материала проводили с учетом пола. Для распределения материала по возрастным группам была использована схема, рекомендованная симпозиумом по возрастной периодизации в институте возрастной физиологии АМН СССР в 1969 году [88]. В результате были исследованы 35 образцов костной ткани мужчин и 15 образцов костной ткани женщин. В связи с тем, что в каждой возрастной группе имелось небольшое количество образцов (не менее трех), нами использовались соответствующие статистические критерии для небольших выборок, что на наш взгляд дает возможность определить основные тенденции изучаемых возрастных изменений. 2.2. Методы
Подготовленную ткань помещали во взвешенные заранее пенициллиновые флаконы, закрывали крышками и взвешивали на электронных весах Balance 6110 (Tecator, UK), предел чувствительности составил 0,0001 г. После этого навески сырой компактной и губчатой костной ткани замораживали при -70 С и высушивали на лиофильной сушке НЕТО Liolab 3000 (Heto, Германия) в течение суток. Высушенные образцы повторно взвешивали и по разности масс находили количество воды [184]. Высушенные пробы костной ткани обезжиривали смесью этанол : эфир (1 : 1) в объеме 4 мл смеси на одну пробу. После интенсивного встряхивания жирорастворитель сливали, а костную ткань высушивали в сушильном шкафу в течение суток при температуре 110С.
Сухие обезжиренные пробы взвешивали, по разности веса флаконов после лиофильной сушки и сухожаровой сушки вычисляли количество лилидов [102]. Полученные таким образом пробы костной ткани хранились в холодильнике в закрытых флаконах на протяжении исследования.
Изучение изменения состава межклеточного вещества костной ткани, происходящее с течением возраста, осуществляли на основе комплексного исследования, включающего препаративные, биохимические, электрофоретические и статистические методы. Для определения количества минеральных веществ в костной ткани применяли влажное озоление. Навеску костной ткани весом 15-20 мг помещали в колбы Кьельдаля, изготовленные из стекла «Рігех» и добавляли 1 мл смеси уксусного ангидрида и хлорной кислоты 1:1. Колбу со смесью нагревали на песчаной бане до полного обесцвечивания содержимого. В процессе охлаждения в колбах выпадали иглообразные кристаллы солей Са . Затем колбы охлаждали на воздухе и количественно переносили содержимое в пробирки, градуированные на 10 мл. Полученные пробы нейтрализовали раствором NaOH до рН 6-7 по универсальной индикаторной бумаге и доводили водой до 10 мл.
Определение ионов Са2+ выполняли на анализаторе «Corning 940» (Corning, UK). Метод основан на титровании исследуемого раствора, содержащего ионы Са2+, раствором этилендиаминтетраацетета натрия (ЭДТА) в присутствии флюоресцентного индикатора Calcein (кальцеин). Исследование количества фосфат-ионов проводили фотометрическим методом с молибдатом аммония в присутствии малахитового зеленого [22]. Сульфатную серу определяли турбидиметрическим методом с хлористым барием в присутствии полиэтиленгликоля со степенью полимеризации п=20000 [27; 100].
Исследование органических компонентов костной ткани
Разделение костной ткани проводили по схеме, приведенной на рис.1, предложенной К.С Десятниченко [25]. На первой стадии проводилось измельчение компактного костного вещества на мельнице с ручным приводом до частиц 180-360 мкм. Навеску порошка величиной 2 г помещали в виалу и добавляли 15 мл 0,5 М НС1. Виалу закрывали и помещали на магнитную мешалку в холодильник. Через некоторое время отмечалось повышение рН раствора, и его восстанавливали по универсальной индикаторной бумаге концентрированной соляной кислотой. Деминерализацию костной ткани вели до стабилизации рН, после чего суспензию центрифугировали на центрифуге ЦЛ-1 при 3000 об/мин (радиус ротора г=14 см) в течение 30 мин Супернатант удаляли декантацией и диализовали против дистиллированной воды, используя диализную пленку фирмы CelluSep, не задерживающую белки менее 3500 Да. Содержимое диализного мешка высушивали на лиофильной сушке Heto Liolab 3000 (Heto, Германия). Таким образом, получали 1-ю фракцию, Из деминерализованного костного матрикса (осадка) экстрагировали длинноцепочечные гликозаминогликаны не связанные с коллагеном, добавлением 20,0 мл З М хлористого магния. Экстрагирование проводили на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение суток, после чего также центрифугировали 3000 об/мин (радиус ротора г=14 см), диализовали и высушивали надосадочный раствор в условиях, описанных выше. Далее к костному матриксу добавляли 20,0 мл 0,1 М соляной кислоты и подвергали пепсиновому протеолизу. К солянокислой суспензии добавляли пепсин (Пищепром, Россия) на кончике скальпеля, виалу закрывали и помещали на магнитную мешалку в термостат при 37С, выдерживали в течение суток. После этого суспензия приобретала коллоидные свойства и практически не содержала нерастворенных частичек матрикса. Нерастворившийся остаток отделяли центрифугированием 1500 об/мин (радиус ротора г=14 см) и отбрасывали.
Супернатант в дальнейшем подвергали последовательному высаливанию насыщенным раствором сульфата аммония. Первую фракцию белков костной ткани осаждали при насыщении 25%, раствор выдерживали не менее часа при комнатной температуре, после чего осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин (радиус ротора г=14 см) в течение 30 мин к полученному надосадочному раствору добавляли раствор сульфата аммония до насыщения 50%. Осадок отделяли в условиях, описанных выше. Точно так же получали фракцию при 75% насыщении. Таким образом, после высаливания получали четыре фракции костных белков: 1 СА, высаливаемая при 25% насыщении сульфатом аммония, 2 СА и З СА при 50% и 75% насыщении соответственно, четвертая фракция - супернатант, оставшийся после высаливания и содержащий белки и гликозаминогликаны, не осаждающиеся при 75% насыщении сульфатом аммония.
Все полученные фракции костных белков растворяли в дистиллированной воде, подвергали диализу против воды, а затем лиофильно высушивали. В результате разделения получили шесть фракций компонентов костной ткани. По нашему мнению 1-я фракция, содержит неколлагеновые белки костной ткани, 2-я, содержит длинноцепочечные ГАГ, не связанные с коллагеном, 3-я фракция, содержит коллаген, 4-я и 5-я фракции, содержит внутриклеточные белки и протеогликаны, 6-я, включает в себя ГАГ и малое количество слабозаряженных белков. После разделения все полученные фракции взвешивали на электронных весах Balance 6110 (Tecator, UK). В полученных фракциях определяли количество уроновых кислот, гексозаминов, коллагена по описанным выше методикам и общее количество белка методом Лоури [74].
Электрофорез белков костной ткани проводили в 1% геле агарозы для электрофореза (Ьаспета,Чехия). Из опробованных нами буферных растворов: ацетат бария - уксусная кислота, рН=8,0, хлористый литий -НС1, рН=5 и барбиталовый буфер, рН=8,2, - наилучших результатов разделения удалось добиться в последнем. Гель готовили растворением при нагревании 100 мг агарозы в 10,0 мл буферного раствора в течение 30 мин, затем прозрачный раствор выдерживали при комнатной температуре 15 мин и заливали между двух морфологических стекол с зазором 1,5 мм. Гель формировался в течение 20 мин при охлаждении до +5 С. После этого одно из стекол удаляли путем сдвигания. Пробу наносили через прорези в полимерной пленке фронтом 0,5 см и шириной 0,7 мм. Количество наносимого раствора составляло 3 мкл. Электрофорез вели в течение часа при силе тока 20 мА, используя источник тока ПЭФА-1У4,2 (Россия). Для избежания высыхания геля камеру с пластинкой помещали в холодильник с температурой +5С. Окраску геля осуществляли 0,1 % раствором амидо черного в 1% уксусной кислоте в течение 15 мин, затем отмывали гель от излишка красителя раствором 1% уксусной кислоты до обесцвечивания фона. Для определения углеводных составляющих использовали вышеуказанный метод за исключением того, что форез проводили в течение 15 мин и для окраски полученной пластинки использовали 0,1 % раствор толуидинового синего [67]. 2.2.6. Методы определения активности ферментов
Для исследования активности щелочной фосфатазы, кислой фосфатазы, лактатдегидрогеназы во фракциях белков, выделенных из костной ткани человека, использовали наборы фирмы «Vital Diagnostics SPb» и автоматический анализатор «Stat Fax 1904 Plus» (США).
Метод определения активности кислой фосфатазы (К.Ф. 3.1.3.2.) основан на кинетическом исследовании реакции гидролиза 1-нафтилфосфата под действием фермента до 1-нафтола и фосфата. 1-нафтол реагирует с азокрасителем с образованием окрашенного соединения, количество которого пропорционально активности фермента.
Возрастные и половые изменения количества коллагена и нуклеиновых кислот в костной ткани
Костная ткань и кость как орган является объектом изучения специалистов различных специальностей, прежде всего, врачей ортопедов и травматологов, патологоанатомов и специалистов судебной медицины. Это связано с уникальностью строения, многообразием и важностью функций выполняемых костью. На сегодняшний день проведено огромное количество исследований, посвященных изучению биологических, физических и химических свойств кости. Однако большинство этих исследований выполнялось на лабораторных животных, а результаты экстраполировались на человека без учета видовых особенностей [89]. Кроме того, исследования состава костной ткани проводились малоинвазивными методами с использованием рентгеновского или другого вида облучения [41; 52; 84], что, на наш взгляд, не дает полной картины состояния кости. Для характеристики возрастных изменений в криминалистике в настоящее время используют описательные морфометрические методы, которые характеризуют только изменения размеров отдельных костей скелета, в которых, на взгляд авторов, происходят наибольшие изменения [60]. И лишь небольшая часть работ посвящена изучению состава нормальной костной ткани человека, при этом наибольшее внимание уделяется возрастному периоду до 25 лет, в котором происходят формирование и глобальная перестройка кости. Незначительное внимание уделяется изучению ремоделирования костной ткани в трудоспособном возрасте, который с достижением науки и техники в развитых странах увеличивается, а вместе с тем и увеличивается число случаев возникновения переломов, связанных с сенильным остеопорозом. В связи с этим возникает необходимость количественного изучения химического состава костной ткани в возрастном аспекте.
На этапе отбора материала нами было отмечено, что бедренная кость у лиц в возрасте 22-35 лет имела желтоватый цвет. На уровне верхней трети диафиза кость была гладкой и при остеотомии образовывала мелкую стружку. На некоторых образцах имелись кровоизлияния, которые, по-видимому, связаны с криминальной причиной смерти. Головка бедренной кости после вскрытия суставной сумки не имела участков некроза, склероза или других видимых патологических изменений. Поверхность хряща ровная, с голубоватым оттенком. Губчатая ткань головки бедра имела вид пемзы, костные балочки располагались достаточно близко друг к другу, в лакунах имелось достаточное количество маслянистой светло-желтой межклеточной жидкости. При отборе проб компактной и губчатой кости этих образцов кусачками требовалось максимальной усилие, иногда приходилось пользоваться молотком. Образцы костной ткани лиц второй группы по внешнему виду мало отличались от первой группы, однако наблюдалось некоторое истончение хряща, и он имел белесую окраску. Образцы костной ткани у лиц третьей и четвертой группы отличались от предыдущих тем, что на поверхности кости появлялись шероховатости, при остеотомии края спилов лохматились, а кортикальная пластинка имела серый цвет. Кость хуже поддавалась измельчению в мельнице при получении костного порошка. Гиалиновый хрящ равномерно покрывал всю поверхность сустава, но имел желтый цвет. На некоторых суставах хрящ был с признаками фиброза и гораздо толще, чем у предыдущих групп. Губчатая кость была более разреженной и легко отбиралась скальпелем.
В связи с вышесказанным нам представилось интересным исследовать в сравнительном аспекте компактную и губчатую костную ткань человека, так как мы предположили, что процессы обмена, протекающие в них, имеют ряд различий. Эти различия отражаются в строении межклеточного матрикса кости. Интересно также было рассмотреть состав межклеточного матрикса в возрастном аспекте. С течением жизни костная ткань человека претерпевает огромные изменения, которые касаются как органической, так и неорганической составляющей внеклеточного матрикса. Эти исследования, возможно, позволят внести некоторую ясность в исследование проблемы остеопороза, которая является актуальной в наши дни. Несмотря на большое количество публикаций, посвященных данной проблеме не определены причины изменения в составе костной ткани, при которых возникают переломы в пожилом и старческом возрасте [59]. Поэтому нами был проведен ряд исследований по изучению состава межклеточного вещества костной ткани. Основным белком органического матрикса кости является коллаген, который выполняет опорную функцию благодаря своему уникальному свойству образовывать фибриллы и связывать между собой клетки костной ткани, сорбировать на своей поверхности неорганические вещества. Изучению надмолекулярной структуры этого биополимера морфологи уделяют большое внимание, но данные о количестве коллагена в костной ткани на различных этапах онтогенеза остаются противоречивыми [179]. Скорее всего, это связано с тем, что исследования выполнены на различных костях скелета. Количество коллагена в настоящее время определяют по аминокислоте гидроксипролин, которая неотъемлемо входит в состав коллагена Г типа в каждой третьей позиции из повторяющегося трипептида гли-X-Y, и ее процент остается постоянным [147].
В компактной костной ткани мужчин содержание коллагена уменьшается от 22 до 74 лет, а в дальнейшем возрасте возвращается к первоначальным значениям и составляет 30+3 г/100 г сухой обезжиренной ткани. В губчатой кости мы наблюдали подобную тенденцию (Табл. 2). Кроме этого, нами выявлено, что в возрасте от 22 до 74 года содержание коллагена в компактной костной ткани достоверно выше, чем в губчатой (Р=0,04), а после 74 лет достоверных отличий не найдено. В костной ткани женщин динамика содержания коллагена несколько отличалась от таковой у мужчин. Происходило снижение коллагена в возрасте 22-55 лет, а затем нарастание до конца исследуемого возрастного периода, от 23,3 до 27,0 г/100 г в компактной и от 19,3 до 22,3 г/100 г в губчатой костной ткани. Как и у мужчин, количество коллагена в компактной кости женщин выше, чем в губчатой. Поскольку при сравнении содержания коллагена в костной ткани мужчин и женщин не выявлено достоверных отличий (Табл. 2), результаты без разделения по половому признаку представлены на рис.4. Однако практически во всех группах у мужчин и женщин в возрасте после 74 лет отмечается тенденция к повышению содержания этого белка. Некоторые исследователи связывают такую зависимость с накоплением пиридинолиновых сшивок в старческом возрасте, что является следствием снижения активности обмена костной ткани.
Так, у мужчин в компактной костной ткани в молодом возрасте количество ДНК достоверно выше, чем в последующие возрастные периоды (Р=0,014), в остальных группах колебания находятся в пределах ошибки. Такие же изменения количества ДНК происходят и в губчатой кости, однако в последней обнаружено достоверно большее количество ДНК в возрасте 61-74 года по сравнению со вторым зрелым возрастом и старческим. Отмечается, что в спонгиозной кости содержание ДНК достоверно выше в первых трех группах, однако в возрасте старше 74 лет эти различия сглаживаются. В компактной костной ткани женщин наблюдается достоверное увеличение содержания ДНК во втором зрелом возрасте практически в 2,5 раза. В губчатой ткани, изменения сходны с изменениями у мужчин, однако в старческом возрасте наблюдается некоторое увеличение содержания ДНК. В отличие от мужчин, в первом зрелом возрасте у женщин не выявлено достоверных отличий в содержании ДНК в компактной и губчатой костной ткани, но такие изменения выявлены во всех остальных возрастных группах. На наш взгляд, такие изменения связаны с тем, что в молодом возрасте происходит активный рост кости, сопровождающийся, увеличением пула осетеобластов [29; 30], что непосредственно связано с ростом количества ДНК. В пожилом и старческом возрасте у мужчин снижается активность пролиферации клеток костной ткани и снижается количество ДНК. Наибольшее содержание ДНК в губчатой кости, скорее всего, связано с тем, что в ее трабекулах содержатся клетки костного мозга, которые завышают результат. Другие исследователи пришли к такому же выводу [43]. Нами отмечается, что значения количества ДНК в костной ткани имеют широкий размах варьирования, но статистически не достоверны. Этот факт связан, скорее всего, с небольшой выборкой исследуемых образцов особенно в женской группе.
