Введение к работе
Актуальность проблемы. Демографическая ситуация в России, несмотря на некоторую стабилизацию, наметившуюся в последние годы, продолжает оставаться неблагоприятной. Сохраняющиеся негативные тенденции представляют угрозу интеллектуальному, трудовому, культурному и оборонному потенциалу страны.
Доля семей на территории РФ, неспособных иметь детей составляет 15-19%, тогда как критическим уровнем считается 15%, при котором бесплодие следует рассматривать в качестве фактора, значительно влияющего на демографические показатели в стране (ВОЗ, 1999; Артифексов С.Б. и др., 2003). Основой государственной стратегии преодоления демографического кризиса является Концепция демографической политики Российской Федерации до 2025 года, в которой вопросам сохранения и восстановления репродуктивного здоровья мужчин впервые отведено особое внимание [Указ Президента РФ № 1351 от 9 октября 2007]. Удельный вес «мужского фактора» в семейном бесплодии за последние годы изменился с 30% до 50% и продолжает расти [Пшеничникова Т.Я., 1991; Селезнева И.Ю., 1999; Леонов Б.В., 2000; Тер-Аванесов Г.В., 2004; Кулаков В.И., 2005; Sigman M., 2009]. По данным научного Центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова РАМН, частота нарушений репродуктивной функции мужчин в структуре бесплодного брака составляет 47,2% [Тер-Аванесов Г.В., 2005].
Зарубежные исследования также выявили увеличение частоты рака яичек, простаты, молочной железы, врожденных пороков развития мужской половой системы и снижение фертильности мужчин за последние десятилетия. Скорость падения концентрации сперматозоидов в сперме здоровых мужчин составляет около 2% в год - со 113 млн/мл в 1940г. до 66 млн/мл в 1990г. [Carlsen E. et al., 1992; Auger J. et al., 1995]. Похожие результаты получены при обследовании мужчин Великобритании, Греции, Италии, Германии, Бельгии, Канады и др. [Waeleghem K. et. al., 1996; Pajarinen J. et. al., 1997; Никитин А.И., 2005]. За этот же период произошли беспрецедентные в медицинской теории и практике изменения общепринятых минимальных стандартов фертильной концентрации сперматозоидов - с 60 млн/мл до 40, а затем и до 20 млн/мл.
Причины, которые ведут к ухудшению качества спермы, недостаточно ясны, однако, ряд исследователей подчеркивает, что описанные тенденции характерны для промышленно развитых стран Европы и Америки и, в меньшей степени, для стран Азии и Африки [Menkveld R. et al., 1997; Swan Sh. et al. 2003]. Все это послужило основанием для выдвижения гипотезы о поражении мужской репродуктивной системы химическими факторами окружающей среды [Swan S. et al., 1997, 2000, 2003; Hauser R. et al., 2002; Comhaire F. et al., 2007]. В пользу этого предположения свидетельствует и тот факт, что абсолютное большинство экотоксикантов появилось именно в середине прошлого века и имеет искусственное происхождение [Майстренко В.Н., 2004]. В настоящее время в литературе имеются сведения о влиянии различных промышленных химических соединений на функцию гонад. Наибольшую опасность среди прочих ксенобиотиков представляют полихлорированные бифенилы (ПХБ), обладающие чрезвычайно высокой физико-химической стабильностью и устойчивостью к биологической деградации [Юфит С.С., 2002; Norstrom R., 2003]. Всего в мировых масштабах было произведено от 1 до 2 млн. тонн этих соединений [Майстренко, 2004]. По данным ВОЗ, в организм человека, не имеющего профессионального контакта с этими соединениями, поступает от 5 до 100 мкг ПХБ в сутки [Толстопятова Г.В., Коркач В.И., 1982].
ПХБ в низких концентрациях вызывают серьезные нарушения нервной, иммунной, гормональной и др. систем, обладают канцерогенным и мутагенным эффектами [Bessmann A., 1981; Cooke P.S. et al., 1996; , ., 2002; Lee Y.W., Park H.J., 2003; . et al., 2007]. Полихлорбифенилы способны индуцировать в организме процессы свободнорадикального окисления [Safe S., 1995; McLean M.R. et al., 2000; Twarovski T.P. et al., 2001; Supriyo De et al., 2004; Murugesan P. et al., 2007]. Известно, что окислительный стресс, развивающийся в тканях репродуктивной системы, является одним из важных патогенетических факторов снижения мужской фертильности [Agarwal A., 2006; Aitken 2007; Артифексов С.Б. и др., 2008; Божедомов В.А. и др., 2009; Громенко и др., 2009].
Некоторые исследования показали, что отравление ПХБ приводит к угнетению продукции половых гормонов, ухудшению количественных и качественных параметров спермы [Faqi A.S. et al., 1998; Safe S., 2000; Камилов Ф.Х. и др., 2000, 2003, 2005, 2009; Murugesan P. et al., 2005; Хабиров Р.Э., 2003, 2004; Галимов Ш.Н. и др., 2005, 2006; Галимова Э.Ф., 2005, 2006; Громенко Д.С. и др., 2007; Макашева Л.О., 2008; Булыгин К.В. и др., 2008, 2009].
В то же время, имеющиеся в литературе сведения о влиянии ПХБ на мужскую половую систему крайне неоднозначны, весьма противоречивы и требуют дальнейшего изучения [Barone M.A. t al., 1991; De Guise S. et al., 1995; Rozati R. et al., 2002; Colborn T., 2004; Acharya U.R. et al., 2006, Arunakaran J. et al., 2010]. Между тем, без углубленного исследования механизмов повреждения бифенилами мужской репродуктивной системы невозможна разработка эффективных патогенетически обоснованных принципов фармакологической коррекции нарушений фертильности, обусловленных экополлютантами.
Целью настоящей работы являлось выявление биохимических механизмов влияния полихлорированных бифенилов на мужскую репродуктивную систему и способов фармакологической коррекции установленных сдвигов в условиях эксперимента.
Задачи исследования:
1. Изучить действие различных доз промышленной смеси полихлорированных бифенилов «Совол» на сывороточные концентрации основных гормонов, регулирующих репродуктивную функцию.
2. Охарактеризовать действие поллютанта в различных дозах и длительности перорального введения на метаболический и морфофункциональный статус семенников.
3. Определить уровни биохимических маркеров функционального состояния акцессорных половых органов экспериментальных животных, подвергшихся субхроническому отравлению ксенобиотиком.
4. Выполнить исследование оплодотворяющей способности крыс-самцов in vivo, подвергшихся отравлению токсикантом в различных дозах, биохимических параметров и морфо-функциональных свойств нативного физиологического эякулята in vitro при интоксикации бифенилами.
5. Охарактеризовать интенсивность прооксидативных процессов и состояние неферментного и энзиматического звеньев физиологической антиоксидантной защиты тканей репродуктивных органов и печени самцов крыс, подвергшихся длительному воздействию полихлорбифенилов.
6. Дать сравнительную оценку эффективности использования фармакологических препаратов с антиоксидантным действием с целью коррекции ПХБ-индуцированных сдвигов оксидантного баланса в семенниках, эякуляте и печени самцов крыс.
7. Исследовать влияние комбинированного применения фармакологических препаратов на состояние основных показателей метаболического и морфофункционального статуса репродуктивной системы самцов крыс на фоне длительного воздействия полихлорированных бифенилов.
Научная новизна.
Впервые показано, что экспозиция крыс ПХБ в низких концентрациях приводит в тестикулах к дозозависимому усилению липопероксидации, уменьшению общей антиокислительной активности, истощению пула неферментных водо- и жирорастворимых антиоксидантов, подавлению активностей ферментов физиологической антиокислительной защиты, угнетению биосинтеза белков, снижению уровня НАДФН, интенсивности апотомического окисления глюкозы и активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы, развитию гипоэнергетического состояния, падению концентрации АТФ и скорости окисления НАД- и ФАД-зависимых энергетических субстратов.
Впервые охарактеризовано динамическое состояние системы глутатиона в тканях репродуктивных органов под действием совола: показано дозо- и хронозависимое снижение под действием ПХБ уровня глутатиона восстановленного, свободных сульфгидрильных групп, фазовые изменения активностей глутатионзависимых ферментов детоксикации (глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы), обмена и рециклирования глутатиона (глутатионредуктазы и -глутамилтрансферазы) и особенности взаимосвязи системы глутатиона с другими ферментативными (супероксиддисмутаза, каталаза) и неферментными (-токоферол, аскорбат) антиоксидантами при интоксикации бифенилами.
Впервые установлено, что продолжительное воздействие совола вызывает нарушения метаболического статуса сперматозоидов, выделенных из эякулята: в лизате сперматозоидов обнаружено увеличение содержания мочевой кислоты, уменьшение концентрации общего белка, альбумина, фруктозы, глюкозы, снижение активностей аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы.
Впервые выявлено существенное снижение метаболической активности акцессорных половых желез, участвующих в формировании эякулята: в тканях семенных пузырьков, эпидидимиса и вентральной простаты отравленных животных зафиксировано снижение уровня фруктозы, активностей нейтральной гликозидазы и кислой фосфатазы.
Показана относительная сохранность и функциональная способность к адаптационным сдвигам неферментативного и энзиматического звеньев антиоксидантной системы печени крыс. Обнаружены динамические сдвиги оксидантного статуса тканей репродуктивных органов и печени животных на фоне поступления поллютанта: выявлено снижение общей антиоксидантной активности и возрастание концентрации продуктов пероксидации в зависимости от дозы и длительности воздействия ксенобиотика.
Продемонстрировано негативное влияние полихлорированных бифенилов на репродуктивный потенциал экспериментальных животных – снижение оплодотворяющей способности самцов крыс и численности их потомства, полученного при спаривании с интактными самками.
Впервые показано, что длительная интоксикация промышленной смесью ПХБ «Совол» в низких концентрациях приводит к поражению тестикулярной ткани самцов экспериментальных животных. Об этом свидетельствует дозозависимое уменьшение при действии бифенилов содержания сперматогоний, сперматоцитов, ранних и поздних сперматид, сперматозоидов в тестикулах экспонированных самцов.
Впервые выявлено снижение количества клеток Сертоли и интерстициальных клеток Лейдига в яичках, сопровождающееся падением сывороточных и тестикулярных концентраций ингибина и активина, уровней тестостерона и эстрадиола в крови отравленных крыс. Установлено, что длительное воздействие полихлорбифенилов (1,5-2,0 мес.) приводит к заметному уменьшению общей концентрации сперматозоидов в эякуляте крыс. Кратковременное поступление токсиканта вызывает ухудшение способности половых гамет к активному поступательному движению, существенное увеличение долей половых клеток с колебательными движениями и неподвижных спермиев в эякуляте.
Показано, что при интоксикации низкими концентрациями ПХБ у самцов крыс наблюдается падение сывороточных концентраций трийодтиронина и тироксина на фоне одновременного уменьшения плазменного содержания тиреотропного гормона. Уровни лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гонадотропинов в крови самцов, подвергшихся длительному воздействию больших доз бифенилов, снижаются.
Впервые экспериментально апробированы новые подходы к коррекции выявленных нарушений. Установлено, что использование препаратов антиоксидантного действия оказывает существенное влияние на соотношение прооксидантных процессов и антиоксидантной активности в тканях печени, семенников и эякуляте крыс, подвергшихся отравлению соволом. Полученные данные также указывают на центральную роль развития окислительного стресса в патохимических механизмах репротоксического действия полихлорбифенилов.
Впервые показано, что применение оксиметилурацила, а также витаминно-минерального комплекса «Селмевит», оказывает защитное действие на метаболический статус тканей животных при субхронической интоксикации соволом. Под влиянием иммурега и селмевита в органах мужской репродуктивной системы и в печени крыс, подвергнутых воздействию полихлорированными бифенилами, снижается интенсивность свободнорадикального окисления и стимулируется антиокислительная защита, восстанавливается функциональная активность ферментативного звена антиоксидантной системы, нормализуется уровень основных водо- и жирорастворимых антиоксидантов.
Впервые продемонстрировано, что комбинированное применение селмевита и иммурега на фоне длительной интоксикации полихлорбифенилами способствует восстановлению большинства параметров энергетического, углеводного, белкового видов обмена веществ, оксидантного баланса в тканях репродуктивных органов крыс-самцов и их фертильности при спаривании с интактными самками.
Полученные данные определяют возможные способы рациональной патогенетически обоснованной фармакологической коррекции экологически обусловленных субфертильных состояний.
Научная и практическая значимость.
Полученные данные существенно расширяют и уточняют имеющиеся представления о биохимических механизмах репротоксического действия стойких органических загрязнителей класса хлорбифенилов. Разработка механизмов развития окислительного стресса при интоксикации диоксино-подобными экотоксикантами позволяет наметить пути фармакологической коррекции метаболических и структурно-функциональных нарушений мужской репродуктивной системы, вызванных отравлением стойкими органическими загрязнителями.
Установлен ведущий патогенетический механизм действия полихлорированных бифенилов, заключающийся в развитии окислительного стресса в тканях семенников, акцессорных половых органов, эякуляте и печени экспериментальных животных.
Выявленные особенности эндокринного статуса, результаты биохимического и морфометрического исследования тестикулярной ткани и спермы экспериментальных животных указывают на многоуровневый характер токсического действия бифенилов и предопределяют направления дальнейших исследований.
Показано корригирующее влияние экзогенного введения препаратов с антиоксидантным механизмом действия на основные показатели оксидантного статуса тканей на фоне отравления бифенилами. Уточнены некоторые биохимические механизмы репропротекторного действия селмевита и иммурега при субхронической интоксикации соволом. Результаты экспериментального исследования позволяют рекомендовать применение при интоксикации ксенобиотиками препаратов с антиоксидантной активностью в качестве средств, улучшающих тканевой метаболизм и функциональное состояние органов репродуктивной системы и печени.
Экспериментально обоснована необходимость периодического контроля функционального состояния половой системы и печени у мужчин, имеющих профессиональный контакт с полихлорбифенилами, а также проживающих на экологически дестабилизированных территориях, с целью ранней диагностики интоксикации, определения степени ее тяжести и своевременного предупреждения развития субфертильного состояния.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Репротоксическое действие полихлорированных бифенилов на мужской организм реализуется на различных уровнях организации половой системы. Снижение сывороточных концентраций гонадотропных гормонов, тиреотропина и отсутствие адекватной реакции гипофиза на снижение уровней в крови тестостерона, ингибина В, активина А, трийодтиронина, тироксина при отравлении соволом указывает на претестикулярный уровень нарушения функции самовоспроизведения и ее регуляции.
2. Пероральное поступление поллютанта приводит к поражению тестикулярной ткани – нарушению белкового, энергетического, углеводного видов обмена веществ, уменьшению количества сперматогоний, сперматоцитов, сперматид, сперматозоидов, клеток Лейдига, клеток Сертоли и угасанию сперматогенной и стероидогенной функций яичек.
3. Проявлением посттестикулярной токсичности полихлорбифенилов является ухудшение биохимического статуса и функциональной активности акцессорных органов мужской половой системы, а также сперматозоидов, полученных из эякулята крыс, подвергшихся кратковременному воздействию соволом в низких дозах.
4. Интоксикация полихлорбифенилами вызывает в тканях репродуктивных органов, эякуляте и печени самцов крыс накопление продуктов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков, изменения уровней глутатиона, свободных сульфгидрильных групп, аскорбиновой кислоты, токоферола и активностей ферментов физиологической антиоксидантной защиты. Их направленность и выраженность определяются интенсивностью и продолжительностью перорального введения токсиканта.
5. Использование препаратов антиоксидантного действия в целях патогенетической коррекции при отравлении самцов животных полихлорированными бифенилами способствует нормализации метаболического статуса семенников, спермы и печени.
6. Одновременное применение витаминно-минерального комплекса «Селмевит» и препарата «Иммурег» на фоне продолжающегося воздействия ксенобиотика более эффективно препятствует развитию эндокринотоксических и репротоксических эффектов ПХБ и способствует нормализации функции мужской репродуктивной системы экспериментальных животных
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедрах биологической и биоорганической химии, фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии, фармакологии №2, мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф, урологии с курсом ИПО ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет Росздрава, кафедре биохимии ГОУ ВПО Ижевская государственная медицинская академия Росздрава, кафедре биохимии и лабораторной медицины с курсом клинической и лабораторной диагностики последипломного образования ГОУ ВПО Омская государственная медицинская академия Росздрава, кафедре биохимии с курсом физколлоидной и токсикологической химии ГОУ ВПО Оренбургская государственная медицинская академия Росздрава, кафедре биохимии ГОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия, кафедре биохимии ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Росздрава.
Апробация результатов работы. Результаты исследований были представлены и обсуждены на VII конференции Российской ассоциации репродукции человека «Лечение бесплодия: нерешенные проблемы» (Саратов, 2001); III Съезде Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002); Российской конференции «Национальный план действий по экологически обоснованному управлению диоксинами/фуранами и диоксиноподобными веществами» (Санкт-Петербург, 2002); Всероссийской конференции «Актуальные вопросы охраны репродуктивного здоровья в медицине труда» (Самара, 2002); 1-й Всероссийской научной конференции с международным участием «Влияние загрязнения окружающей среды на здоровье человека» (Новосибирск, 2002); Российском научном форуме «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2003, 2004, 2008); International Ecologic Forum "Environment and Human Health» (St.Petersburg, 2003); межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов - до внедрения в клиническую практику и производство» (Оренбург, 2003); Международном конгрессе «Профилактика нарушений репродуктивного здоровья от профессиональных и экологических факторов риска» (Волгоград, 2004); Всероссийской конференции с международным участием «Биологические аспекты экологии человека» (Архангельск, 2004); ІV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Всероссийской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения профессора Р.И. Лифшица «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009); 7-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2010); совместном заседании кафедр биологической и биоорганической химии, фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии с участием сотрудников кафедр фармакологии №2, общей гигиены с экологией с курсом гигиенических дисциплин медико-профилактического факультета, патологической физиологии, мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф, клинической лабораторной диагностики ИПО ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет Росздрава (Уфа, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 60 печатных работ, из них 13 - в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 304 страницах печатного текста, содержит 27 рисунков, 34 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав результатов исследований, заключения, выводов и списка литературы, который включает 354 иностранных и 127 отечественных источников.
