Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 . Оценка состояния прооксидантно-антиоксидантного баланса у больных с гнойными ранами (обзор литературы ) 13
1.1. Уровень прооксидантной-нагрузкиу больных с гнойными ранами. 14
1.1.1. Продукция активных форм кислорода клетками-фагоцитами... 17
1.1.2. Продукция активных форм кислорода клетками не фагоцитарного ряда 201
1.1.3. Неконтролируемая продукция активных форм кислорода 21
1.2. Состояние антиоксидантной системы у больных с гнойными ранами 22
1.3. Состояние баланса прооксидантных и антиоксидантных факторов в динамике раневого процесса 26
1.4. Принципы и способы исследования состояния прооксидантно-антиоксидантного баланса у больных с гнойными ранами 29
ГЛАВА 2 . Общая характеристика пациентов с гнойными ранами и использованных клинических и специфических методов диагностики (материалы и методы ) 34
2.1. Материалы исследования 34
2.2. Методы исследования 41
2.2.1. Общепринятые клинические лабораторные методики 41
2.2.2. Методика определения площади раны 42
2.2.3. Методика забора биологического материала 46
2.2.4. Методики оценки прооксидантно-антиоксидантного статуса биологического материала 47
2.2.4.1. Люминол-зависимая Н202-индуцированная хемилюминесценция 47
2.2.4.2. Амперометрическии анализ антиокислительной активности54
2.2.4.3. Определение активности каталазы 55.
2.2.4.4. Определение активности супероксиддисмутазы 57
2.2.4.5. Определение продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой 58,
2.2.4.6. Определение количества сульфгидрильных.групп 60'
2.2:5. Методика^ расчета интегрального показателя коэффициента окислительной модификации биомолекул эритроцитов 61
2.2.6. Методика постановки.экспериментальной части исследования. 62і
2.2.8. Методики оценки про-/антиоксидантной активности лекарственных субстанций 67
2.2.8.1. Методика определения антиоксидантной* активности лекарственных субстанций in vitro с помощью однократной индукции перекисного окисления. 67
2.2.8.2. Методика определения антиоксидантной активности, лекарственных субстанций, in vitro с помощью пролонгированной индукции перекисного окисления 68
2.2.8.3і Методика- определения антиоксидантной активности лекарственных субстанций in vitro в тест-системах с плазмой при помощи индуцированной люминол-зависимой хемилюминесценции 69
2.2.8.4. Методика амперометрического определения
антиоксидантной активности лекарственных субстанций in vitro в
тест-системах с плазмой крови 70
2.2.9. Морфологические методы 71
2.2.10: Методы статистического анализа 72
ГЛАВА 3 . Состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса на локальном уровне у наблюдаемых больных в динамике эволюции гнойной раны 75
3.1. Максимум быстрой вспышки хемилюминесценции раневого экссудата 75
3.2. Площадь быстрой вспышки хемилюминесценции раневого экссудата 78
3.3. Антиокислительная активность раневого экссудата по данным амперометрического детектирования 81
3.4. Активность каталазы в раневом экссудате 85
3.5. Активность супероксиддисмутазы в раневом экссудате 89
3.6. Коэффициент соотношения активности каталазы и супероксиддисмутазы в раневом экссудате 92
ГЛАВА 4. Состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса на системном уровне у наблюдаемых больных в динамике эволюции гнойной раны (клиническоеисследование)у наблюдаемых больных 97
4.1. Максимум быстрой вспышки хемилюминесценции плазмы крови 97
4.2. Площадь быстрой вспышки хемилюминесценции плазмы крови...101
4.3. Антиокислительная активность плазмы крови по данным амперометрического детектирования 105
4.4. Тиобарбитуровое число плазмы и эритроцитов 108
4.5. Концентрация сульфгидрильных групп в гемолизате эритроцитов 114
4.6. Активность каталазы в гемолизате эритроцитов 118
4.6. Активность каталазы в гемолизате эритроцитов 118
4.7. Активность супероксиддисмутазы в гемолизате эритроцитов 122
4.8. Соотношение активности каталазы и супероксиддисмутазы в гемолизате эритроцитов 125
4.9. Коэффициент оксидативной модификации биомолекул эритроцитов 129
4.10. Зависимость показателей прооксидантно-антиоксидантного баланса от площади раневой поверхности 132
ГЛАВА 5. Комплексный анализ прооксидантно- антиоксидантного баланса на местном и системном уровнях у наблюдаемых больных в динамике эволюции гнойной раны 145
ГЛАВА 6 . Оценка антиоксидантной активности лекарственных субстанций, применяемых для местного лечения ран, на подопытных животных в эксперименте 158
6.1. Оценка в экспериментальных моделях in vitro 158
6.2. Оценка антиоксидантной активности мазевых лекарственных форм; применяемых для местного лечения ран, в экспериментальных моделях in vivo 162
5.3. Оценка ранозаживляющей активности мазевых лекарственных форм, применяемых для местного лечения ран, в экспериментальных моделях in vivo 167
Заключение 170
Выводы: 182
Литература 184
- Уровень прооксидантной-нагрузкиу больных с гнойными ранами.
- Материалы исследования
- Максимум быстрой вспышки хемилюминесценции раневого экссудата
- Максимум быстрой вспышки хемилюминесценции плазмы крови
Введение к работе
Актуальность проблемы. Разработка эффективных методов диагностики течения раневого процесса, а также выбор оптимального метода лечения продолжает оставаться одной из актуальных проблем в современной хирургии [Б.М.Костюченок и соавт., 1976; В.К.Гостищев, 1996; В.Д.Федоров и соавт., 2005]. По данным литературы, в настоящее время пациенты с гнойно-воспалительными заболеваниями составляют от 40% [Ю.К.Абаев, 2006] до 49% больных хирургического профиля [Б.М.Даценко и соавт., 1995], а пациенты с трофическими язвами и длительно незаживающими ранами составляют около 1,5% от всего населения и 10% от числа больных общехирургических стационаров [В.Г.Морозов и др., 1998]. Рациональное лечение ран остается одной из наиболее острых и сложных проблем, эффективное решение которой будет искать еще не одно поколение врачей [К.В.Гайдуль и соавт., 2005].
Исследования раневого процесса имеют многовековую историю, причем весьма вероятно, что именно с лечения ран начинался такой раздел медицины как хирургия [Б.МІДаценко и др., 1995]. Общепринятой дефиницией раневого процесса является сложный комплекс реакций, развивающихся в ответ на повреждение покровных тканей и проявляющихся в виде местных и общих реакций [Б.М.Даценко, 1977]. В настоящее время одним из проявлений раневого процесса принято считать изменение баланса в системах генерации свободных радикалов и антиоксидантной защиты [М. Fredrickson, 1990].
Исследования в области redox-биологии, напротив, следует отнести к новым направлениям в науке. Однако, уже можно считать устоявшимся мнение, что взаимодействие свободных радикалов и антиоксидантов является неотъемлемой частью жизнедеятельности аэробных организмов. В рамках этого взаимодействия антиоксиданты поддерживают требуемый
уровень свободных радикалов, которые выполняют важнейшие регуляторные функции [B.Halliwell, 2006].
В настоящее время считается установленным фактом развитие окислительного стресса у различных категорий больных с хирургической патологией, сопровождающейся эндотоксикозом. Выраженные сдвиги баланса в системе прооксиданты-антиоксиданты, связанные с превалированием прооксидантных факторов, являются типовой патофизиологической реакцией при развитии в организме человека заболеваний гнойно-воспалительного характера [J. Gutteridge и соавт., 2000]. Не- является исключением из этого правила и раневой процесс [J.Dissemond и др., 2002].
Значительная прооксидантная нагрузка вызывает интенсификацию реакций свободно-радикального окисления и перестройку всех компонентов АОС как в организме больного в целом, так и на уровне пораженных тканей [Ю.А.Владимиров, 2000]. Для коррекции возникающих нарушений необходимо иметь методы диагностики, позволяющие с достаточной точностью определять уровень и степень дисбаланса в защитных системах организма.
Несмотря на расширение познаний о закономерностях изменения прооксидантно-антиоксидантного статуса в процессе заживления ран [A.Gupta и соавт., 2002] существует недостаток информации о его состоянии у отдельных групп пациентов, что затрудняет обоснованный выбор прооксидантной или антиоксидантной терапии [A.M.Rasik и соавт., 2001].
Для оценки состояния АОС обычной практикой является исследование активности показателей ее ферментного звена в такой биологической жидкости как кровь и в ее компонентах [О.А.Гомазков, 2003]. Очевидно, что исследования такого рода позволяют определять влияние гнойной раны на состояние прооксидантно-антиоксидантного
баланса лишь косвенно. Изменение равновесия в данной системе при локальном процессе на системном уровне значительно менее выражены, чем на местном, что связано с превалированием местных реакций над организменным ответом, формированием зоны изоляции от общего гомеостаза, отчетливой стадийностью эволюционирования раны.
Такие особенности раневого процесса позволяют утверждать, что в большинстве случаев особый интерес представляет определение состояния системы прооксиданты-антиоксиданты непосредственно в ране [А.Р.Ромм и соавт., 1986]. По факту увеличения прооксидантных процессов в ране для ее эффективного лечения требуется коррекция АОС на. местном уровне. Применяемые при лечении гнойных ран мазевые лекарственные формы в большинстве случаев способны оказывать значительное влияние на свободнорадикальные процессы как в ране, так и в предлежащих здоровых структурах [S.Shetty и соавт., 2007], но этот эффект остается недостаточно изученным в связи с отсутствием адекватных методов оценки состояния прооксидантно-антиоксидантного баланса в ране.
Учитывая вышеизложенное, целью настоящей работы явилась оценка состояния прооксидантно-антиоксидантного баланса в раневом экссудате и в периферической крови в процессе эволюции гнойной раны для прогнозирования течения раневого процесса и коррекции местного лечения.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1) разработать новый комплексный подход к оценке состояния прооксидантно-антиоксидантного баланса в раневом отделяемом, включающий авторские методы получения биологического материала, определения выраженности прооксидантных факторов и резервных возможностей антиоксидантной системы;
установить особенности изменения прооксидантно-антиоксидантного баланса на местном и системном уровнях в процессе эволюции гнойной раны у пациентов с осложненным и неосложненным течением раневого процесса;
определить комплекс основных биохимических и биофизических показателей, необходимых для объективной оценки уровня дисбаланса в системе прооксиданты - антиоксиданты у пациентов с гнойной раной;
выявить закономерности изменения изученных показателей прооксидантно-антиоксидантнои системы крови в зависимости от площади гнойной раны у пациентов с осложненным и неосложненным течением раневого процесса;
оценить влияние местной антиоксидантной терапии на состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса и клиническое течение раневого процесса на экспериментальной модели гнойной раны в различные фазы ее развития.
Новизна результатов исследования
Впервые разработан способ лабораторной диагностики окислительного стресса, включающий определение уровня компонентов прооксидантно-антиоксидантных систем организма, который обладает точностью, достаточной для достоверности определения состояния антиоксидантной системы (АОС) на системном уровне у больных с гнойными ранами.
Предложен аппаратно-программный комплекс лабораторной диагностики окислительного стресса, основанный на обработке с помощью ЭВМ биофизических показателей состояния АОС на системном и местном уровнях у больных с гнойными ранами.
Впервые предложена программа регистрации сигналов хемилюминотестера ЛТ-1, позволяющая определять максимум и площадь быстрой вспышки хемилюминесценции.
Модифицированы и внедрены в хирургическую практику способ получения биологического материала из раны для анализа состояния прооксидантно-антиоксидантного баланса на местном уровне и метод контроля динамики изменения площади раны, позволяющий производить планиметрию с высокой скоростью и достаточной точностью.
Впервые исследована динамика состояния АОС у больных с гнойными ранами параллельно на системном и на местном уровнях в процессе эволюции гнойной раны, проведен корреляционный анализ изменений отдельных показателей в экссудате раны и в периферической крови в зависимости от площади раны.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
Определение прооксидантно-антиоксидантного статуса на локальном уровне дает возможность достоверно дифференцировать характер течения и фазу раневого процесса, а также корректировать проводимое лечение.
Имеется прямая взаимосвязь между неферментными показателями, характеризующими окислительный стресс у хирургических больных, и площадью гнойной раны.
У всех пациентов с сопутствующим сахарным диабетом отмечается неадекватная реакция АОС на дополнительное ее раздражение в динамике развития гнойного процесса, особенно остро манифестирующая у пациентов с острым гнойным процессом.
4. У пациентов с острым гнойным процессом на фоне сахарного диабета
на локальном уровне имеется тенденция к сохранению прооксидатной
нагрузки, в то время как у пациентов с хроническим характером течения
гнойного процесса особенностью является меньший уровень активации и
торпидность динамики оксидативных процессов.
; і2
Теоретическая значимость исследования
Установлен характер динамики прооксидантно-антиоксидантного баланса на местном уровне (в раневом экссудате) и на уровне организма (в периферической крови) в процессе развития гнойной раны.
Доказано наличие взаимосвязи изменений показателей прооксидантно-антиоксидантной системы на местном и системном уровнях.
Продемонстрированы различия в изменении прооксидантно-антиоксидантного баланса в условиях неосложненного раневого процесса и в условиях раневого процесса, отягощенного сахарным диабетом.
Практическая значимость исследования. Предложенные методы исследования позволяют оценить характер течения раневого процесса, определить момент перехода раны из одной фазы раневого процесса в другую и оценить индивидуальную потребность в средствах коррекции прооксидантно-антиоксидантного баланса. Разработаны методические рекомендации для проведения исследований, направленных на определение влияния лекарственных средств, которые применяются для местного лечения гнойных ран, на прооксидантно-антиоксидантный баланс.
Сведения о практическом использовании результатов исследования. На основании полученных фактов предложены практические рекомендации, используемые в отделении гнойной хирургии краевой клинической больницы №1 имени профессора СВ. Очаповского и в отделении хирургии госпиталя МСЧ ГУВД Краснодарского края (см. приложение 3). Отдельные положения диссертации включены в лекции для общих хирургов и хирургов гнойной специализации на курсах повышения квалификации, а также используются в учебном процессе на кафедре фундаментальной и клинической биохимии и кафедре общей хирургии Кубанского государственного медицинского университета.
Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались: на IV Всероссийской конференции общих хирургов с международным участием «Раны и раневая инфекция» (14—15 мая 2007, Ярославль); на XIV Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (1-5 июня 2006, Украина, Крым, Ялта - Гурзуф); на V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (21-24 апреля 2007, Москва); на XI Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (22-29 апреля 2006, Тенерифе, Канарские острова, Испания). По результатам исследования опубликовано 14 печатных работ, включая 2 патента на изобретения, 1 патент на полезную модель и 1 свидетельство на регистрацию программы для ЭВМ. (см. приложение 2).
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы и трех приложений. Список литературы включает 108 отечественных и 64 зарубежных источника. Диссертация изложена на 204 страницах, иллюстрирована 52 рисунками (в том числе 7 фотографиями), 12 таблицами, представлено 3 клинических примера.
Завершая вводную часть диссертации, хочу выразить искреннюю благодарность своим учителям - доктору медицинских наук профессору Юрию - Павловичу Савченко и доктору медицинских наук профессору Ивану Ивановичу Павлюченко за предоставленную тему исследования и создание благоприятных условий р^ля его выполнения. Одновременно благодарю коллектив кафедры фундаментальной и клинической биохимии и кафедры общей хирургии Кубанского государственного медицинского университета, а также коллектив отделения гнойной хирургии краевой клинической больницы №1 за помощь в работе.
Уровень прооксидантной-нагрузкиу больных с гнойными ранами.
Имеющийся тренд развития медицинских технологий со всей убедительностью демонстрирует рост количества инвазивных методов диагностики и лечения, а также увеличение агрессивности этих методов. Такое положение неизбежно сопровождается увеличением числа гнойно-септических осложнений. Бурный эмпирический поиск способов предотвращения и лечения раневой инфекции к настоящему времени вышел за пределы понимания теоретических основ раневого процесса, а изначально многообещающие методы лечения начали проявлять свои недостатки [Е.А.Столяров и соавт., 2003]. Очевидно, что это явилось предпосылкой для активизации научного поиска в области теоретических основ и закономерностей течения раневого процесса [G.Schultz и соавт., 1998]. К настоящему времени раневой процесс хорошо описан на гистологическом уровне, но патобиохимический и патофизиологический его компонент остаются недостаточно изученными [U.Keller и соавт., 2006].
Проведенные за последние два десятилетия исследования убедительно доказали, что смещение баланса в системе прооксидантно-антиоксидантного равновесия сопровождает многие физиологические [Б.Т.Величковский, 2001] и большинство патологических процессов [А.А.Андреев и соавт., 1998; Л. П. Галактионова и соавт., 1998; М.И.Балоболкин, Е.М.Клебанова, 2000; Д.М.Габитова и соавт., 2001; С.А.Трянкина и соавт., 2003; А.М.Біловол, 2005; И. Е. Голуб и соавт., 2005; Э.А.Петросян, В. И. Сергиенко, А.А.Сухинин и соавт., 2005]. Не является исключением и раневой процесс: рядом авторов доказано, что он неизбежно связан с активацией прооксидантной системы [В.В.Захаров и соавт., 1988; R. Grief и соавт., 2000; G.M.Gordfflo, 2003; J.Kivisaari и соавт., 1975]. При этом раневой процесс имеет ряд значимых особенностей - превалирование местных реакций над организменным ответом, формирование зоны изоляции от общего гомеостаза, отчетливую стадийность эволюционирования раны. Такие особенности раневого процесса позволяют утверждать, что в болыпинстве случаев лечения раны требуется изучение прооксидантно-антиоксидантного баланса не только на системном [А.Ю.Агаев и соавт., 1989], но и на местном уровне.
Типовой патофизиологической реакцией организма на формирование раны является воспаление, которое делится на две фазы: сосудистую и клеточную. Первая фаза сопровождается кратковременным уменьшением перфузии через ткань за счет генерализованного спазма артериол и капилляров, сменяющимся восстановлением кровотока в сочетании с повышением проницаемости сосудов. Вторая фаза включает в себя реакцию клеточных элементов в ране [S.L.Robbins и соавт., 1989]. Первыми форменными элементами крови, пересекающими эндотелиальную мембрану, являются нейтрофилы. В очаге воспаления они преобладают в течение первых 6-24 часов. Моноциты в течение 24-48 часов заменяют нейтрофилы на участке вокруг раны. Важную роль в заживлении раны играют макрофаги, выделяющие цитокины, клеточные медиаторы и АФК [Б.И. Ли и соавт., 2003].
Можно сказать, что одной из первых глобальных экологических катастроф на нашей планете было «загрязнение» атмосферы кислородом -продуктом жизнедеятельность сине-зеленых водорослей [В.В.Ляхович и соавт., 2006]. Появление кислорода дало мощный импульс эволюции через переход на аэробный тип метаболизма и навсегда связало биосферу с понятием окисление. Известно, что в органических молекулах электроны на внешней электронной оболочке располагаются по одной паре на каждой орбитали. Свободные радикалы отличаются тем, что у них на внешней электронной оболочке имеется неспаренный электрон. Это делает радикалы химически активными, поскольку радикал стремится либо вернуть себе недостающий электрон, отняв его от окружающих молекул, либо отдать лишний электрон. В обоих случаях молекула-мишень модифицируется [Ю.А.Владимиров, 2000]. Неспаренный электрон в радикалах принято обозначать точкой. Например, радикал гидроксила обозначают НО», радикал перекиси водорода НОО, радикал супероксида «ОО.
Согласно существующей классификации образующиеся в организме человека радикалы можно разделить на первичные (табл. 1), вторичные (табл. 2) и третичные (радикалы антиоксидантов). Образование первичных радикалов осуществляется при участии определенных ферментных систем. Эти радикалы выполняют полезные для организма функции. Из первичного радикала — супероксида, а также в результате других реакций в организме могут образоваться весьма активные молекулярные соединения: перекись водорода, гипохлорит и гидроперекиси липидов. Под действием ионов металлов переменной валентности, с первую очередь ионов Fe2+, из этих веществ образуются вторичные свободные радикалы, такие, как радикал гидроксила и радикалы липидов, которые оказывают разрушительное действие на клеточные структуры. При действии ионизирующей и ультрафиолетовой радиации, а также при превращениях некоторых неприродных соединений, попавших в организм человека, в клетках и тканях также могут образовываться радикалы.
Материалы исследования
В основу клинических исследований положены результаты наблюдения и лечения в отделении гнойной хирургии Краевой клинической больница №1 (г. Краснодар) 62 больных с гнойными ранами, в том числе 39 больных с осложнениями нейропатической формы синдрома диабетической стопы и 23 больных с флегмонами шеи, вызванными не анаэробной флорой.
С целью проведения аналитического и статистического анализа больные были разделены на три основные группы и две контрольные группы, отличающихся по нозологии. Основная группа А включала 39 больных с осложнениями нейропатической формы синдрома диабетической стопы, которые были разделены на две подгруппы А1 -пациенты с флегмоной стопы (N=20) и А2 - пациенты с гнойными ранами стопы, требовавшими выполнения оперативного вмешательства (N=19). Основная группа В включала больных с флегмонами шеи, вызванными не анаэробной флорой (N=23). Все включенные в исследование пациенты не имели осложнений в виде флегмон граничных областей и тяжелого сепсиса.
С целью обеспечения сопоставимости статистического анализа были выделены две контрольные группы. В группу К1 были включены пациенты, находившиеся на лечении в отделении эндокринологии ГУЗ ГБ №2 г.Краснодара (N=22). Критериями отбора пациентов для включения в эту группу были: 1) диагностированный СД 2 типа, 2) стаж заболевания не менее 5 лет, 3) необходимость на момент обследования в получении базис болюснои инсулинотерапии, 4) тяжелое течение СД, 5) декомпенсация СД при поступлении (гипергликемия, кетоз), 6) отсутствие осложнений синдрома диабетической стопы и тяжелой сопутствующей патологии. В группу К2 были включены лица, не страдающие соматическими заболеваниями на момент обследования (N=20). Пациенты были сопоставимы по возрасту и полу между группами А и группой К1, группой В и группой К2.
Средний возраст больных в группе А1 составил 57,1+1,9 (8,7) , в том числе у мужчин 55,2+2,6 (9,4); у женщин 60,6±2,4 (6,3) года. Средний возраст больных группы А2 составил 60,2+2,4 (10,4), у мужчин 59,9±3,0 (10,6), у женщин 60,8+4,4 (10,8) года. Средний возраст больных группы В
Здесь и далее в Главе 2 запись такого вида представляет «выборочное среднее ± стандартная ошибка среднего (стандартное отклонение)». составил 49,2+4,0 (19,6), в том числе у мужчин 43,8+3,3 (11,5); у женщин 50,4+6,3 (20,8) года. Средний возраст контрольной группы К1 составил 58,8±1Д (5,1), в том числе у мужчин 60,0+1,1 (4,0); у женщин 56,8±2,3 (6,4) года. Средний возраст контрольной группы К2 составил 48,6±1,4 (6,4), в том числе у мужчин 45,3±1,6 (5,2); у женщин 51,8±1,9 (6,0) года. Статистически значимых различий по возрасту пациентов между сравниваемыми группами не отмечено (тест значимости различий между соотношениями: А1:К1 р=0,44; А2:К1 р=0,58; В:К2 р=0,90).
Соотношение женщин и мужчин в группе А1 составляло 1:1,9; в группе А2 - 1:2,2; в группе В - 1:1,1; в группе К1 - 1:1,8 и в группе К2 -1:1 (Табл. 4). Среднее по группам соотношение женщин и мужчин составило 1:1,5. Для коррекции имеющегося дисбаланса соотношения полов в группах с осложнениями синдрома диабетической стопы (А1 и А2) в группе К1 сформирована идентичная модель соотношения мужчин и женщин. Статистически значимых различий по соотношению полов между сравниваемыми группами не отмечено (тест значимости различий между соотношениями: А1:К1 р=0,85; А2:К1 р=0,52; В:К2 р=0,25).
Степень тяжести и компенсированность сахарного диабета косвенно оценивалась по уровню глюкозы в крови на момент госпитализации (Табл. 5). Статистически значимых различий между уровнем глюкозы в крови сравниваемых групп не отмечено (тест значимости различий средних арифметических: А1:К1 р=0,15; А2:К1 р=0,28).
Тяжесть состояния больного на момент поступления в отделение гнойной хирургии оценивалась по следующим критериям: шкале SAPS II [J.LeGall и соавт., 19931, лейкоцитарному индексу интоксикации Островского [В.К.Островский и соавт., 1983] и лимфоцитарно-гранулоцитарному индексу интоксикации [Ж. Г. Мустафина и соавт., 1999].
Тяжесть общего состояния на момент поступления больного по шкале SAPS II (высота столбца - баллы , ширина - прогнозируемая летальность). Шкала SAPS характеризует тяжесть состояния пациента и позволяет оценить вероятность летального исхода при поступлении в клинику. Средний балл по шкале SAPS II составил (рис. 1): в группе А1 - 18,2±0,9 (3,9) баллов, в группе А2 - 17,0±1,3 (5,9) баллов и в группе В - 20,1±1,9 (8,9) баллов. В соответствии с приведенными значениями баллов тяжести состояния пациента по шкале SAPS II прогнозируемая летальность составила (рис. 1): в группе А1 - 32,5±0,3 (1,5) %о; в группе А2 - 3,1±0,5 (2,3) %о и в группе В - 20,1±1,9 (8,9) баллов.
Величина индексов интоксикации на момент поступления больных в клинику (ЛИИ - лейкоцитарный индекс интоксикации и ЛГО - лимфоцитарно-гранулоцитарное отношение). Лейкоцитарный индекс интоксикации Островского характеризует уровень эндогенной интоксикации и степень активизации процессов тканевого распада. Нормальное значение лейкоцитарного индекса интоксикации Островского составляет 1,6 усл. ед. [В. К. Островский и соавт., 1983]. Средняя величина лейкоцитарного индекса интоксикации Островского на момент поступления пациента в клинику составила (рис. 2): в группе А1 - 2,3±0,3 (1,2) единиц; в группе А2 -1,9±0,2 (0,7) единиц; в группе В - 3,8+0,2 (0,9) единиц. Лимфоцитарно-гранулоцитарное отношение характеризует характер и степень интоксикации. Нормальное значение лимфоцитарно-гранулоцитарного отношения составляет 4,0 усл. ед. [Ж.Г.Мустафина и соавт., 1999]. Средняя величина лимфоцитарно-гранулоцитарного отношения на момент поступления пациента в клинику составила (рис. 2): в группе А1 - 3,2±0,4 (1,9) единиц; в группе А2 - 3,2±0,2 (0,9) единиц; в группе В - 1,3±0,2 (0,8) единиц.
При поступлении в клинику пациентам выполнялась адекватная хирургическая обработка гнойного очага по традиционной методике [Б.М.Костюченок и соавт., 1986]. В дальнейшем осуществлялись ежедневные перевязки с санацией раны водным р-ром антисептика (хлоргексидина биглюконат). Использовались повязки с мазью «Левомеколь» на протяжении всего исследования (при переходе раны в фазу грануляций забор биологического материала прекращался). Индивидуально для каждого пациента фиксировался момент перехода раны из гнойно-некротической в фазу грануляций (классификация фаз раневого процесса Б.М. Даценко, 1995). Средние сроки момента смены фаз в различных группах составили: в группе А1 — 12±0,4 (1,5) сутки, в группе А2 — 10±0,4 (1,7) сутки, в группе В — 7±0,2 (1,1) сутки. Переход раны во вторую фазу в группах А1 и А2 отмечен в более поздние сроки в сравнении с группой В в связи с наличием такого фонового заболевания как СД, которое негативно влияет как на скорость течения раневого процесса, так и на его прогнозируемый исход.
Максимум быстрой вспышки хемилюминесценции раневого экссудата
Одним из современных методов диагностики нарушений прооксидантно-антиоксидантного статуса является измерение параметров люминол-зависимой ШОг-индуцированной хемилюминесценции, основанное на определении количества продуцируемых радикалов при индукции свободнорадикальных реакций внесением пероксида водорода.
В группах А1 и А2 хирургических больных с осложненным синдромом диабетической стопы отмечены следующие изменения показателя максимума БВХЛ раневого экссудата в динамике раневого процесса. Наибольшее значение показателя максимума БВХЛ раневого экссудата достигается к четвертым суткам и составляет 1,839±0,107(0,262) усл. ед. в группе А1 и 1,508±0,071(0,174) усл. ед. в группе А2 (рис. 15). В дальнейшем отмечается спад этого показателя до окончания периода наблюдения. На четырнадцатые сутки максимум БВХЛ достигает абсолютного минимума за период наблюдения и составляет в группе А1 0,805±0,099 (0,242) усл. ед или 43,8% от максимального значения, отмеченного на четвертые сутки в этой группе (тест Wilcoxon W = 400, р = 1,45-10"11), и в группе А2 1,171 ±0,082(0,201) усл. ед. или 77,7% в сравнении с максимальным значением, отмеченным на четвертые сутки в этой группе (тест Wilcoxon W = 315,5, р = 8,6-10 5).
Здесь и далее в Главе 3 запись такого вида представляет «выборочное среднее ± стандартная ошибка среднего (стандартное отклонение)».Динамика максимума быстрой вспьпики хемилюминесценции раневого экссудата (жирная горизонтальная линия - медиана, верхняя и нижняя границы четырехугольника - 75 и 25 процентили соответственно, амплитуда прерывистой линии до поперечного ограничителя -стандартное отклонение, отдельные точки - значения, выходящие за пределы стандартного отклонения). В группе В у хирургических больных без фонового заболевания в динамике раневого процесса показатель максимума БВХЛ раневого экссудата достигает наибольшего значения уже на вторые сутки 1,055±0,049(0,098) усл. ед. (рис. 15), а наименьшее значение этого показателя за период наблюдения отмечается уже на десятые сутки и составляет 0,249±0,053(0,106) усл. ед. или 23,6% в сравнении с максимальным значением, отмеченным в этой группе на вторые сутки (тест Wilcoxon W = 529, р = 2,4-10-13).
Очевидно, что зарегистрированное во всех группах на вторые-четвертые сутки повышение максимума БВХЛ раневого экссудата является результатом активации прооксидантных систем в тканях раны в первой фазе раневого процесса как побочного эффекта интенсификации окисления при «окислительном взрыве» в фагоцитах и с резорбцией в кровь токсических веществ из раны. Активация свободнорадикального окисления является изначально защитным механизмом, но может привести к истощению эндогенных антиоксидантов вплоть до дополнительного повреждения клеток и тканей организма. Поэтому зачастую требуется коррекция прооксидантно-антиоксидантного баланса у таких пациентов с помощью антиоксидантных и детоксицирующих средств.
Установлено наличие статистической значимости различий максимума БВХЛ между выделенными в исследовании группами на вторые сутки (тест Kruskal-Wallis Н = 42, р = 7,7-10"10) и на десятые сутки (тест Kruskal-Wallis Н = 49, р = 2,3 -10"11). При анализе различий по парам групп на вторые сутки в паре А1/А2 значимых различий не выявлено (тест Wilcoxon W = 223,5, р = 0,354), в паре А1/В (тест Wilcoxon W = 459, р = 4,2-Ю-12) и в паре А2/В (тест Wilcoxon W = 432, р = 8,5-10 11) выявлены статистически значимые различия. При анализе различий по парам групп на 10 сутки в паре А1/А2 (тест Wilcoxon W = 49, р = 2,6-10"5), в паре А1/В (тест Wilcoxon W = 460, р = 2,1-10 12) и в паре А2/В (тест Wilcoxon W = 437, р = 4,5-10"12) выявлены статистически значимые различия.
При верификации статистически значимых различий максимума БВХЛ между первой и второй фазами раневого процесса последние обнаружены во всех группах: в группе А1 (тест Wilcoxon W = 280, р = 0,03), в группе А2 (тест Wilcoxon W = 379, р = 1,2-10-7) и в группе В (тест Wilcoxon W = 484, р = 1,2-Ю"7).
Подводя итог проведенному статистическому анализу, можно утверждать, что определение прооксидантно-антиоксидантного баланса в ране с помощью метода измерения максимума БВХЛ демонстрирует достаточную чувствительность (позволяет достоверно диагностировать момент перехода раны из гнойно-некротической фазы в фазу грануляций) и специфичность (дает возможность различать характер течения раневого процесса, что продемонстрировано на примере статистически значимых различий максимума БВХЛ между пациентами групп Al, А2 и В).
При анализе показателей, отмеченных у больных группы А1 в динамике развития раневого процесса, к четвертым суткам площадь быстрой вспышки хемилюминесценции (БВХЛ) раневого экссудата достигает 1,9±0,11(0,269) усл. ед. (рис. 16). В дальнейшем отмечается спад площади БВХЛ до окончания периода наблюдения. На четырнадцатые сутки площадь БВХЛ достигает абсолютного минимума за период наблюдения и составляет 0,988±0,093 (0,229) усл. ед. или 52% от максимального значения, отмеченного на четвертые сутки (тест Wilcoxon W = 400, р = 6,8-108).. Динамика площади быстрой вспышки хемилюминесценции раневого
Экссудата (жирная горизонтальная линия - медиана, верхняя и нижняя границы четырехугольника - 75 и 25 процентили соответственно, амплитуда прерывистой линии до поперечного ограничителя -стандартное отклонение, отдельные точки - значения, выходящие за пределы стандартного отклонения). В группе А2 в динамике развития раневого процесса максимальная площадь БВХЛ раневого экссудата была отмечена уже на вторые сутки и составила 1,653±0,08 (0,195) усл. ед. (рис. 16), а абсолютного минимума этот показатель также достиг на четырнадцатые сутки и составил 1,325±0,102 (0,249) усл. ед. или 80,2% от максимального значения, отмеченного на вторые сутки (тест Wilcoxon W = 311, р = 5,8-10"5).
Схожая динамика в начале наблюдения отмечена и в группе В. Так, наибольшая площадь БВХЛ раневого экссудата была отмечена уже на вторые сутки и составила 2,172±0,104 (0,208) усл. ед. (рис. 16). В более поздние сроки динамика несколько отличалась - абсолютный минимум описываемого показателя был достигнут в более короткие сроки и на десятые сутки площадь БВХЛ составила 0,637±0,117 (0,234) усл. ед. или 29,3% от максимального значения, отмеченного на вторые сутки (тест Wilcoxon W = 529, р = 2,5-Ю13).
Отмечаемое до вторых-четвертых суток повышение площади БВХЛ раневого экссудата является результатом активации прооксидантных систем в первой фазе раневого процесса в поврежденных тканях раны как побочного эффекта интенсификации окисления при «окислительном взрыве» в фагоцитах, который сопровождается избыточным образованием свободных радикалов и приводящих к уменьшению резервов АОС организма.
Максимум быстрой вспышки хемилюминесценции плазмы крови
Максимум БВХЛ плазмы крови у добровольцев в группе К1 составляет 0,832±0,086 (0,392) усл. ед., а в группе К2 - 0,236±0,021 (0,090) усл. ед.. Максимум БВХЛ в группе К1 превышает аналогичный показатель в группе К2 в 3,5 раза, что связано с наличием у представителей группы К1 сахарного диабета и нарушениями в системах специфической и неспецифической защиты организма. Анализируя показатели БВХЛ у больных в группе А1 в динамике развития раневого процесса (рис. 21) можно отметить, что ко вторым суткам максимум БВХЛ плазмы крови достигает 1,205±0,061(0,162) усл. ед., что отражает его повышение на 44,8% в сравнении с контрольной группой К1 (тест Bartlett К2 = 13,7, р = 0,0002). В последующем отмечается продолжительный рост показателя уровня прооксидантной нагрузки в виде максимума БВХЛ до восьмых суток, когда он достигает абсолютного максимума за время наблюдения и составляет 1,544+0,097(0,256) усл. ед. или 185,6% в сравнении с контрольной группой К1 (тест Bartlett К2 = 3,7, р = 0,055). В дальнейшем отмечается медленный неявный спад. К четырнадцатым суткам максимум БВХЛ составляет 1,307±0,055(0,147) усл. ед. или 157,1% от контрольной группы К1 (тест Bartlett К2 = 16,4, р = 5,2-Ю 5). Здесь и далее в Главе 4 запись такого вида представляет «выборочное среднее + стандартная ошибка среднего (стандартное отклонение)». . Динамика максимума быстрой вспышки хемилюминесценции в плазме крови (жирная горизонтальная линия - медиана, верхняя и нижняя границы четырехугольника - 75 и 25 процентили соответственно, амплитуда прерывистой линии до поперечного ограничителя -стандартное отклонение, отдельные точки - значения, выходящие за пределы стандартного отклонения). В группе А2 в динамике развития раневого процесса (рис. 21) ко вторым суткам максимум БВХЛ плазмы крови достигает 1,233±0,085 (0,227) усл. ед, что отражает его повышение на 48,2% в сравнении с контрольной группой К1 (тест Bartlett К2 = 5,2, р = 0,02). В дальнейшем отмечается непродолжительный рост показателя максимума БВХЛ до четвертых суток, когда он достигает абсолютного значения за время наблюдения и составляет 1,266±0,094(0,248) усл. ед. или 152,2% в сравнении с контрольной группы К1 (тест Bartlett К2 = 3,7, р = 0,05). В последующий период отмечается продолжительный спад максимума хемилюминесценции с небольшими флюктуациями. Минимальное значение максимума БВХЛ достигается на десятые сутки и составляет 1,175±0,082(0,217) усл. ед. или 141,3% от контрольной группы К1 (тест Bartlett К2 = 6,0, р = 0,015).
Динамика показателя БВХЛ в группе В отличается от его динамики в группах А1 и А2 (рис. 21). Так, уже ко вторым суткам максимум БВХЛ плазмы достигает 0,737±0,056(0,125) усл. ед., что отражает его повышение на 212,3% в сравнении с контрольной группой К2 (тест Bartlett К2 = 1,9, р = 0,17). Рост максимума БВХЛ продолжается до четвертых суток, когда он достигает абсолютного максимума за время наблюдения и составляет 0,798±0,06(0,134) усл. ед. или 238,1% в сравнении с контрольной группой К2 (тест Bartlett К2 = 2,9, р = 0,08). В дальнейшем отмечается быстрый спад максимума БВХЛ до значений, близких к аналогичному показателю контрольной группы К2. К десятым суткам БВХЛ составляет 0,365±0,053(0,119) усл. ед. или 153,8% от контрольной группы К2 (тест Bartlett К2 = 1,3, р = 0,25). Описываемое во всех группах повышение максимума БВХЛ плазмы крови является результатом активации факторов прооксидантной направленности крови как системного ответа макроорганизма на микробную агрессию, проявляющуюся развитием флегмоны. Обращает на себя внимание, что изменение максимума БВХЛ в группе В имеет значительные отличия от изменений в первые сутки аналогичного показателя групп А1 и А2. Так, в группах А1 и А2 изначально показатель максимума БВХЛ был выше и увеличение его в последующем периоде наблюдения отмечалось относительно медленнее и с меньшей амплитудой, чем в группе В. Это может быть связано с тем, что у пациентов с сахарным диабетом отмечается развитие эндотоксикоза, в том числе повышение концентрации в крови продуктов азотистого обмена (обладающих антиоксидантными свойствами), и снижение напряженности иммунных реакций, которое может предопределять уменьшение прооксидантной нагрузки, что в комплексе детерминирует фиксацию прооксидантно-антиоксидантного баланса на более высоком уровне с тенденцией к дисбалансу в сторону прооксидантного звена.
Установлено наличие статистической значимости различий максимума БВХЛ между выделенными в исследовании группами на вторые сутки (тест Kruskal-Wallis Н=40,7, р=1,5-10"9) и на десятые сутки (тест Kruskal-Wallis Н = 45,1, р = 1,7-10"10). При анализе различий по парам групп на вторые сутки в паре А1/А2 значимых различий не выявлено (тест Wilcoxon W = 173, р = 0,6429), в паре А1/В (тест Wilcoxon W = 459, р = 4,2-10 12) и в паре А2/В (тест Wilcoxon W = 427, р = 1,5-10"7) выявлены статистически значимые различия. При анализе различий по парам групп на десятые сутки в паре А1/А2 (тест Wilcoxon W = 276, р = 0,016), в паре А1/В (тест Wilcoxon W = 460, р = 2,3-10-8) и в паре А2/В (тест Wilcoxon W = 437, р = 3,6-10"8) выявлены статистически значимые различия.
Подводя итог проведенному анализу, следует отметить, что качественных различий максимума БВХЛ между различными группами не обнаружено. Тренд динамики сходен, меняется лишь срок достижения ключевых значений и количественное выражение этих значений. Это объяснимо: динамика максимума БВХЛ отражает уровень ответа АОС организма на локальное воспаление (гнойную рану) в зависимости от исходного состояния этой системы, которая определяется наличием СД, и степенью прооксидантной нагрузки, которая связана с интенсивностью воспалительной реакции.
Площадь БВХЛ плазмы крови в группе К1 составляет 0,978±0,02 (0,095) усл. ед., а в группе К2 - 0,723±0,049 (0,215) усл. ед. Площадь БВХЛ в группе К1 превышает аналогичный показатель в группе К2 в 1,4 раза, что в первую очередь обусловлено метаболическими расстройствами и снижением защитных механизмов у представителей группы К1, страдающих сахарным диабетом. При сравнении с максимумом БВХЛ у этих же групп отмечается значительное снижение различия показателей. Это может быть связано с тем, что при СД страдает преимущественно низкомолекулярное звено АОС, отвечающее за быструю утилизацию прооксидантных факторов, а имеющиеся в крови у больных СД эндотоксины нивелируют показатель максимума БВХЛ, который отражает уровень продуктов свободнорадикального окисления. В тоже время достаточно адекватное функционирование всей АОС находит отражение в умеренном повышении площади БВХЛ в группе К1 в сравнении с группой К2. Показатель площади БВХЛ не склонен реагировать на изменения в прооксидантно-антиоксидантной системе настолько быстро как максимум БВХЛ, так как он обладает большей степенью интегральности и комплексно отражает имеющиеся ресурсы АОС.
