Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1 Современные исследования транспорта гомоцистеина в крови в условиях оксидативного стресса, характерного для гипергомоцистеинемии 19
1.2. Исследование эндотоксического действия гомоцистеина 26
1.3. Основные сведения о современных методах определения гомоцистеина 27
Глава 2. Методы исследования 30
2.1. Объекты исследования 30
2.2. Методы анализа гомоцистеина 30
2.2.1. Метод ВЭЖХ - анализа гомоцистеина со спектрофотометрическим детектированием
2.2.2. Количественное определение соотношения общего и восстановленной формы Гци в плазме крови пациентов с различной патологией 38
2.3. Методы биохимического мониторинга эффектов повышения концентрации гомоцистеина 41
2.3.1. Определение ТБК - активных продуктов, включая малоновый диальдегид в плазме крови 41
2.3.2. Определение SH - групп 45
2.4. Моделирование акселерации токсических эффектов на фоне гипергомоцистеинемии различного уровня введением экспериментальным крысам гомоцистина и его смеси с аргинином 46
2.5. Получение очищенных препаратов и анализ содержания альфа-2-макроглобулина 48
2.5.1. Количественное определение альфа-2-макроглобулина 48
2.5.2. Очистка альфа-2-макроглобулина и приготовление образцов, активированных трипсином. 49
2.6. Изучение распределения гомоцистеина во фракциях плазмы крови здоровых доноров и у пациентов с различной степенью гипергомоцистеинемии методом гель - фильтрации 52
2.7.Изучение гидрофобной сорбции гомоцистеина крупно - молекулярными фракциями плазмы крови 52
2.8. Изучение связывания гомоцистеина очищенными препаратами альфа-2-макроглобулина, активированными и неактивированными трипсином. 53
2.9. Вспомогательные общепринятые методики
3.0. Математический анализ и статистическая обработка полученных данных 54
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 55
Изучение свойств аминотиолов и их производных. 56
3.1. Абсорбционные спектры производных аминотиолов 56
3.2. Оптимизация высвобождения гомоцистеина из дисульфидных форм 58
3.3. Усовершенствование процедуры калибровки анализа 62
3.4. Селективность анализа гомоцистеина по отношению к глутатиону при использовании колонок с обращенно - фазными сорбентами типа С8 и С18 66
3.5. Серийный анализ плазмы крови 79
3.6. Исследование эндотоксического действия гомоцистина (окисленного гомоцистеина) при состояниях оксидативного стресса 83
3.6.1. Моделирование акселерации токсических эффектов на фоне гипергомоцистеинемии различного уровня введением экспериментальным крысам гомоцистина и смеси гомоцистина с аргинином
3.6.2. Измерение уровня тиоловых групп и продукта перекисного окисления липидов - малонового альдегида у пациентов с гипергомоцистеинемиями
3.7. Определение соотношения общего гомоцистеина и его восстановленной формы в образцах плазмы крови больных 93
3.8. Изучение связывания гомоцистеина активированным альфа-2-макроглобулином 98
3.8.1. Изучение распределения гомоцистеина при гель - фильтрации плазмы крови у здоровых доноров и у пациентов с различной степенью гипергомоцистеинемии 98
3.8.2. Изучение гидрофобной сорбции гомоцистеина крупномолекулярными фракциями плазмы крови
3.8.3. Изучение связывания гомоцистеина очищенными препаратами альфа-2-макроглобулина, активированными и неактивированными трипсином
Заключение 110
Выводы 113
Литература 114
- Современные исследования транспорта гомоцистеина в крови в условиях оксидативного стресса, характерного для гипергомоцистеинемии
- Определение ТБК - активных продуктов, включая малоновый диальдегид в плазме крови
- Оптимизация высвобождения гомоцистеина из дисульфидных форм
- Определение соотношения общего гомоцистеина и его восстановленной формы в образцах плазмы крови больных
Введение к работе
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1 Современные исследования транспорта гомоцистеина в
крови в условиях оксидативного стресса, характерного для
гипергомоцистеинемии 19
Исследование эндотоксического действия гомоцистеина 26
Основные сведения о современных методах определения гомоцистеина 27
Современные исследования транспорта гомоцистеина в крови в условиях оксидативного стресса, характерного для гипергомоцистеинемии
Метаболизм активных форм кислорода в условиях оксидативного стресса, характерен для ГГци. Гци образуется при использовании в тканях метильных групп незаменимой аминокислоты метионина в нескольких основных биосинтетических направлениях: 1) при синтезе ДНК, РНК, белков; 2) при синтезе фосфатидилхолина, креатинина; 3) синтезе нейротрансмиттеров. Всего три серосодержащих L-аминокислоты связаны метаболическими превращениями, две из которых, метионин и цистеин, являясь кодируемыми, используются для биосинтеза белков (см. строения ниже). Связывание гомоцистеина с белками объясняется образованием смешанных дисульфидов, наряду с этим Гци отличающийся плохой растворимостью может фиксироваться в гидрофобных кластерах белковых молекул, в особенности это относится к гомоцистеину, его окисленной форме -гомоцистину. В настоящее время показано, что основным белком транспортирующим гомоцистеин является альбумин [128,133]. В такой, связанной форме гомоцистеин поступает для утилизации в клетки почек и печени, в которых и протекают два описанных выше основных метаболических пути утилизации гомоцистеина. В условиях патологии при гипергомоцистеинемиях наблюдается повышенное выделение гомоцистеина из организма. Гци в жидкостях организма обнаруживается в окисленном и восстановленном состоянии,а также в виде смешанных дисульфидов с цистеином, глутатионом и альбумином (См. схему) и в виде специфичной для восстановленного гомоцистеина (вГци) форме -тиолактона, образующегося в результате дегидратации гомоцистеина [ 78,79 ]. Это соединение блокирует остатки лизина в белках за счет гомоцистеинилирования по аминогруппе, что приводит к изменению их физико-химических свойств и потере функции, например инактивации ферментов (трипсин, метил-тРНК-синтетаза, лизиноксидаза). Например, блокада NH2 - групп лизиновых остатков коллагена, приводит к нарушению межмолекулярных связей волокон экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) [62].
Описанные выше и многие другие исследования показывают, что наиболее важные последствия ГГци связаны с действием повышенных концентраций Гци в клетках. По - видимому проатерогенные эффекты этого аминотиола в эндотелии и стенке сосуда связаны с избирательным накоплением в клетке. Повышение содержания Гци в клетке может резко усиливаться за счет его эндоцитоза вместе, например, с альбумином - переносчиком Гци.
Связывающая способность белков плазмы крови в отношении Гци составляет 4,88 ± 0,51 и 4,74 ± 0,68 мкмоль/г для здоровых мужчин и женщин соответственно [133]. Связывание Гци белками происходит преимущественно за счет окисления тиоловых групп белков с образованием внутренних дисульфидов. Гомоцистеинилирование белков происходит также по аминогруппам остатков лизина[80]. В отличие от других аминотиолов, Гци в норме содержится в тканях и крови в низких концентрациях достигающих, примерно, ЮмкМ. По данным литературы концентрация Глт в различных клетках высока и составляет, например в эритроцитах, 2,23±035 мМ [34]. Концентрация цистеина (цистин Уг) в крови человека варьирует в пределах примерно 33-117 мкМ [34]. Из всех эндогенных аминотиолов наименьшую реакционную способность при окислении пероксидом водорода, гипохлоритами и супероксидом проявляет Глт [116]. Это позволяет клеткам поддерживать высокие концентрации восстановленного Глт, который используется в качестве кофермента в значительных количествах различными энзимными системами. Примером важнейшей коферментной функции Глт в клетках с активированными механизмами репликации или репарации ДНК является восстановление тиоредоксина, необходимого для синтеза дезоксирибонуклеотидов из нуклеотидов [51].
Гци является недостаточно изученным участником свободно - радикального метаболизма. При патологических состояниях, сопровождающихся повышением концентраций Гци (от 15 до 300 мкМ), могут наблюдаться существенные изменения в тиол - дисульфидных равновесиях, в транспорте и синтезе оксида азота, т.к. этот аминотиол, несмотря на несколько более низкие скорости реакций с окислителями, отличается более полным расходованием в реакциях образования дисульфидов. Глутатион и цистеин быстрее окисляются, чем Гци, однако при взаимодействии тиолат - анионов активных центров энзимов и других белков со смешанными дисульфидами Гци, высвобождается именно тот аминотиол у которого pKa(SH) ниже. Это означает, что при окислении серы в альбумине и других серосодержащих белках в присутствии смешанных дисульфидов происходит в первую очередь связывание остатков Гци из различных дисульфидов [128].
Как отмечалось ранее, Гци (pKa(SH) = 8,70-10,0) имеет значение константы ионизации тиоловой группы более высокое, чем цистеин (pKa(SH) = 8,15) [45,65]. Тиоловая группа цистеинового остатка в 34-ом положении в альбумине имеет необычно низкое значение рКа, приближающееся к 5,00 [31,55,109]. Это является довольно низким значением, в противоположность другим эндогенным аминотолам, включая Гци. При рН 7,4 в плазме крови тиолат - анион альбумина термодинамически более стабилен, чем другие аминотиолы, тем более, что он стабилизируется электростатическим взаимодействием с гистидиновым остатком по 39 положению. Тиолат - анион альбумина гомоцистеинилируется при физиологических рН смешанными дисульфидами и самим Гци. При атаке тиолат -анионом смешанных дисульфидов, уходящим из дисульфидной связи смешанных аминотиолов, является тот, у которого pKa(SH) ниже. Из всех эндогенных аминотиолов самое высокое значение рКа н) отмечается у Гци. В присутствии Гци и кислорода наблюдается генерация АФК. Концентрации АФК в средах организма относительно мала и составляет для супероксиданиона 0{ около 10"11 М, для гидроксильного радикала ОН 10 "11 М, для Н202 около 10"8 М [2]. Гидроксильный радикал характеризуется периодом полужизни, ty2= 10"9 сек [98].
Определение ТБК - активных продуктов, включая малоновый диальдегид в плазме крови
Для мониторинга состояния организма при эндотоксических воздействиях за счет накопления Гци были использованы методы определения ТБК - активных продуктов, включая малоновый диальдегид и количественное определение SH-групп.
Метод определения количеств ТБК - активных продуктов, включая малоновый диальдегид (МДА) в плазме и сыворотке крови, основан на анализе продуктов окисления полиненасыщенных жирных кислот после взаимодействия с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). ТБК - активные продукты образуются в кислой среде при высокой температуре и представляют собой окрашеный триметиновый комплекс, имеющий максимум светопоглощения 532 нм. Молярный коэффициент экстинкции этого комплекса известен и составляет 1,56 105 см"1М"1 [4,27,31,113].
Подготовку исследуемых образцов, приготовление необходимых реактивов и количественное определение ТБК - активных продуктов, включая малоновый диальдегид (МДА) в плазме и сыворотке крови, проводили в соответствии с модификацией общепринятой методики. [11].
Расчет результатов анализа проводили по формуле: содержание МДА (мкМ) = 160,2 Е; где Е - экстинция рабочего образца при 520 нм. Относительно контроля (деионизированной воды). Содержание МДА по ТБК - активным продуктам составляет 9,3 ± 0,44 мМ для плазмы крови здоровых доноров по данным анализа 46 образцов. Границы нормы у мужчин и женщин составляют для жителей Санкт - Петербурга 7,9 -10,7 мкМ. Это показатель интенсивности процессов перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот липидов, сосредоточенных в липопротеидах крови и мембранах клеток [28, 35]. Для специфичного выявления МДА вместо ТБК - активных продуктов была использована одна из модификаций метода анализа по образованию флуоресцентных продуктов МДА и тиобарбитуровой кислоты [66,72,135]. В процессе экспериментальной работы нами применен метод определения ТБК - активных продуктов и собственно МДА с помощью ВЭЖХ - анализа со спектрофотометрическим (А=532 нм) и флуоресцентным детектированием (ЛВозб = 532 нм и АЭмисс.= 553 нм) с методикой пробоподготовки для плазмы крови. Предел детектирования для спектрофотометрического определения МДА при соотношении сигнал:фон = 3:1 составил 0,162±0,102 мкМ. Предел детектирования для флуоресцентного детектора при том же соотношении сигнал: фон составил 0,023+0,011 мкМ. Следовательно, флуориметрический метод детектирования ТБК - продукта МДА в 7,04 раза чувствительнее. Как известно из научных источников [135] нормальное содержание МДА составляет 0,72±0,20 мкМ. В качестве контрольной группы авторы привлекли доноров (п=15) в возрасте 57,8±8,5 лет, которые не курили и не употребляли алкоголь, но уже имели возрастные сердечно-сосудистые изменения. Для анализа МДА кровь у больных забирали в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (поставщик - ЗАО "Вектон", Санкт - Петербург, Россия) и до отделения плазмы кровь не более 30 мин хранили при +4С. Далее, кровь центрифугировали при 2000 g в течение 10 минут. В плазму крови для предотвращения образования новых порций продуктов перекисного окисления липидов добавляли антиоксидант 2,6-дитрет-бутил-4метилфенол (Sigma - Aldrich Chemie GmbH,Germany; поставщик - ЗАО " Химэкс Лимитед", Санкт - Петербург, Россия) до конечной концентрации 18 мМ. Процедуру подготовки проб для анализа проводили как подробно описано в работах Halliwell В., Chirico S., Fulli S. с сотрудниками [66,72]. Хроматографический анализ проводили на колонке Kromasil С8 3,5 мкм; 100 х 4,6 мм. В качестве внешнего стандарта использовался водный раствор тетраэтоксипропана (Sigma - Aldrich Chemie GmbH, Germany; поставщик - ЗАО" Химэкс Лимитед", Санкт - Петербург, Россия) с концентрацией 1 мкМ и 10 мкМ. Полученные хроматограммы калибровочных растворов тетраэтоксипропана и рабочего образца плазмы крови больного представлены на рис. 5. Время удерживания tR, характерное для ТБК - продукта МДА колебалось в диапозоне 4,49-4,53 мин. ВЭЖХ - анализ МДА использовали при моделировании оксидативного стресса у крыс с включением по 8 экспериментальных животных в каждую группу. Экспериментальные данные по этому этапу исследований представлены в главе "Результаты исследования", разд. 3.6.1. Количественное определение концентрации малонового диальдегида у пациентов с различными степенями ГГци проводили по формуле: Ci = С0 Si/So. Где: Со - концентрация тетраэтоксипропана в мкМ (1 мкМ или 10 мкМ); So -площадь пика тетраэтоксипропана в LU - единицы флуоресценции; Сі -концентрация малоновуого диальдегида (МДА) в рабочем образце плазмы крови мкМ; Si - площадь пика МДА в рабочем образце плазмы крови. Обсчет результатов проводили с помощью компьютерной программы, которой обеспечен жидкостный хроматограф Agillent 1100.
Оптимизация высвобождения гомоцистеина из дисульфидных форм
Как уже упоминалось, при активации МГ первичными аминами и другими лигандами, включая различные протеиназы, в молекуле МГ обнаруживают до 4-х свободных тиоловых группировок [106]. Задача настоящего фрагмента работы заключалась в выявлении связывания Гци очищенными препаратами МГ, активированными и неактивированными трипсином
Эти препараты, приготовленные, согласно методики, подробно изложенной в главе "Методы исследования" (Разд. 2.5.2.), качественные характеристики которых представлены в табл. 2, выше указанного раздела диссертационной работы, взятые в объеме 1-2 мл в 5 отдельных опытах, смешивали с 1/10 объема гомоцистина в концентрации 20 мкМ и выдерживали в холодильнике в течение двух часов при 8-10С. После чего проводили гель - фильтрацию для разделения низкомолекулярного и крупномолекулярного материала на колонке с сефадексом G-200, как это было описано ранее. К 1 мл препарата МГ, обработанного трипсином и 1 мл исходного МГ, добавляли по 0,02 мл раствора гомоцистина в концентрации 200 мкМ. В модельном растворе конечная концентрация гомоцистина составила 4 мкМ и концентрация МГ - примерно 0,5 мкМ. Результаты полученного эксперимента при гель - фильтрации на колонке с сефадексом G-200 показаны на рис. 30, 31 (гель - фильтрация солюбилизированного альбумином Гци после инкубации с неактивированным препаратом МГ (Рис. 30), гель -фильтрация солюбилизированного альбумином Гци после инкубации с активированным препаратом МГ (Рис. 31).
Активированный трипсином препарат использовали для анализа образующихся после активации тиоловых групп и связывания Гци методом гель фильтрации на колонке с сефадексом G-200 (Рис. 31). Как показано на рис. 30, основная часть Гци элюирует в составе фракций альбумина. Значительная часть Гци после активации препарата ингибитором протеиназой перераспределяется в крупномолекулярные фракции (Рис. 30, 31). Для оценки достоверности полученных результатов по связыванию Гци альфа-2- макроглобулином после активации трипсином и без активации этим ферментом нами было проведено сравнение этих процессов. В крупномолекулярных фракциях № 10,11, было определено количество Гци, приходящееся на единицу экстинции белка (Гци, мкМ/А28о)- В крупномолекулярных фракциях 200 кДа при изучении связывания Гци альфа-2-макроглобулином, активированным трипсином, эта величина была 30,38±21,96. При изучении связывания Гци неактивированным трипсином альфа-2-макроглобулином эта величина была 1,01±0,52. Полученные экспериментальные данные были оценены на достоверность с помощью независимого t - теста, величина которого составила 0,0011, что позволяет говорить о достоверности полученных экспериментальным данных и утверждать, что у пациентов с различными ГГци большая часть Гци связывается альфа-2-макроглобулином за счет активации тиловых групп протеиназами, в даноом случае трипсином. Полученные экспериментальные данные представлены на рис. 32.
Определение соотношения общего гомоцистеина и его восстановленной формы в образцах плазмы крови больных
Так же как и Гци, другие аминотиолы в плазме крови находятся, главным образом, в связанном с белком состоянии. Соотношения свободного с белком аминотиола составляют 0,2 для Гци, около 0,5 - 0,6 для цистеина и 4-5 для Глт [92]. Позднее было показано, что скорость связывания Гци с белками ниже, чем у цистеина и Глт, но в реакционных смесях с другими аминотиолами Гци, в отличие от других аминотиолов, практически полностью связывался с альбумином [92,93]. Связывающая способность белков плазмы крови в отношении Гци составляет 4,88±0,51 и 4,74±0,68 мкмоль/г для здоровых мужчин и женщин, соответственно [133]. Тиоловая группа цистеинового остатка в 34 положении в альбумине имеет необычно низкое значение рКа, приближающееся к 5,0 [62,140]. В противоположность другим эндогенным аминотолам, включая Гци, это довольно низкое значение. При рН 7,4 в плазме крови тиолат - анион альбумина термодинамически более стабилен, чем тиолаты других аминотиолов, тем более, что он стабилизируется электростатическим взаимодействием с гистидиновым остатком по 39 положению. Тиолат - анион альбумина гомоцистеинилируется при физиологических рН смешанными дисульфидами Гци и гомоцистином. Гци (pKa(SH) = 8,7) имеет более высокое значение константы ионизации тиоловой группы, чем цистеин, pKa(SH) = 8,15. Известно, что при атаке тиолат - анионом смешанных дисульфидов, уходящим из дисульфидной связи смешанных аминотиолов является тот, у которого pKa(sH) ниже. Это означает, что в плазме крови в дисульфидах белков должно обнаруживаться больше Гци, чем в низкомолекулярных дисульфидах. Такое положение полностью соответствует картине наблюдаемой в плазме крови, в которой обнаруживается менее 20% Гци в виде низкомолекулярных дисульфидов и до 1,5-10% восстановленного Гци. При окислении восстановленного Гци в присутствии кислорода наблюдается генерация перекиси водорода. Исходя из имеющихся литературных и представленных в настоящем исследовании данных можно сделать вывод о том, что Гци образует дисульфиды при взаимодействии с тиоловыми группами белков медленнее, чем другие низкомолекулярные эндогенные тиолы. За счет того, что в смешанных дисульфидах гомоцистеинилированных белков связь прочнее, чем в дисульфидах цистеина или Глт, в растворах, содержащих белки, свободного Гци и его низкомолекулярных дисульфидов в растворах содержится относительно небольшое количество (Рис. 10).
В настоящем исследовании для солюбилизации гомоцистина мы использовали сывороточный альбумин человека, с помощью которого моделировали образование дисульфидов с белком. Растворы окисленных Глт и Гци, приготовленные на альбумине, мы использовали в качестве калибровочных при анализе серий образцов плазмы крови. Этот вариант калибровки стал возможен после того, как было доказано, что одинаковое количество Гци и Глт ТНБ - производных может быть получено восстановлением ДТТ в течение 10 минут при +60С (рис. 8 и 9) и получаемые хромофорные аддукты имеют практически идентичные УФ - спектры поглощения с максимумом при ЗЗОнм. Ранее считалось, что продукты модификации различных аминотиолов имеют разные спектры поглощения в аналитическом диапазоне длин волн, при этом ТНБ - производное Гци имеет более низкое светопоглощение, чем производное Глт [121].
В настоящем исследовании показано, что этот эффект следует объяснять более полной модификацией других аминотиолов по сравнению с Гци (видимо из-за особенностей рКа тиоловой группировки). Как описано в разделе "Результаты исследований" (разд. 3.2.), после 10 минутной инкубации пробы при +60С наблюдалась одинаковая хромогенность для Глт и Гци - производных. Смешанные с альбумином дисульфиды типа Тци-Бвзгальбумин более стабильны, чем низкомолекулярные в свободном состоянии. Мы употребляли процедуру калибровки с раствором двух аминотиолов, так как это давало возможность контролировать завершенность модификации обоих типов аминотиолов. Использование для калибровки пеницилламина или Глт совместно с Гци оправдано, так как при этом достигается контроль полноты модификации аминотиолов с различными свойствами тиоловых групп. При анализе серии проб с предложенным вариантом калибровки порядок приготовления и анализа проб построен так, что первую и последнюю пробы анализируют дважды, с прибавлением и без прибавления калибрующего раствора. Разница в площадях пиков анализируемых соединений со стандартом и без него позволяет проверять полноту выхода производных в ходе пробоподготовки. Таким образом, модификация анализируемых аминотиолов 5,5 -дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой) в тандеме с восстановлением дитиотреитолом пригодна для проведения серийных анализов большого количества проб. Около 100 проб с плазмой крови и несколько калибрующих проб внутри серии анализов может быть проанализировано в автоматическом режиме за 21 час. Стандартная смесь из двух аминотилов, введенная в первый и последний образец серии, обеспечивала получение точных и воспроизводимых результатов. Для анализа, занимающего 11-12 мин, могут быть использованы обращенно - фазные колонки Cs и Cie-Преимущества предложенного метода анализа Гци: высокая точность; возможность выявления окисленных и восстановленных форм Гци; одновременный анализ других аминотиолов, включая Глт; быстрота и небольшой расход дорогостоящих реактивов в процессе пробоподготовки; высокая производительность анализа в режиме последовательности.
В результате проведенных экспериментов показано, что предложенный метод ВЭЖХ - анализа пригоден для серийных анализов оГци плазмы крови в диагностической практике и научных исследованиях. В соответствии с полученными данными при ГГци значительная доля Гци переносится крупномолекулярными фракциями. Количество транспортируемого этими фракциями Гци при гипергомоцистеинемии коррелирует с уровнем активированного МГ плазмы крови. Известно, что при активации, т.е. связывании протеиназ и некоторых других молекул, в активном центре этого поливалентного ингибитора экспрессируются свободные тиоловые группировки [13,68,76,123]. По - видимому, эти тиоловые группировки являются центрами связывания Гци. Таким образом, связывающая способность крупномолекулярных фракций плазмы крови зависит от тиоловых групп белков, в том числе активированного МГ. Экспрессия тиоловых группировок в молекуле МГ in vivo, в свою очередь, обусловлена активацией протеолитических систем крови, задействованных в регуляции свертывания и фибринализа, регуляции сосудистого тонуса [68,76,123]. После активации МГ быстро связывается с рецепторами макрофагов [91,129]. Видимо, при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолитических систем, происходит увеличение доли Гци, транспортируемого в составе активированного МГ (Рис. 32). Известно, что активированный МГ быстро извлекается из кровотока макрофагами, экспрессирующими рецептор LRP (Lipoprotein-Related-Protein-receptor) [13,68,76]. Макрофаги являются носителями этого рецептора и в большом количестве обнаруживаются при развитии атеросклероза в субэндотелиальном пространстве.
