Введение к работе
Актуальность исследования Медь необходима для жизни всех организмов, так как участвует в осуществлении широкого круга клеточных процессов от образования трансмиттеров до синтеза гема Она входит в состав простетических групп ключевых ферментов, участвующих в окислительном фосфорилировании, формировании соединительной ткани, антиоксидантной защите, двунаправленном транспорте железа (Karlm, 1993) С другой стороны, ионы меди могут индуцировать образование активных форм кислорода, которые, действуя по механизму, сходному с ионизирующей радиацией, разрушают биополимеры (Lmder, 2001) Поэтому в клетках всех типов существуют эволюционно консервативные системы для безопасного импорта, распределения и экскреции меди (Puig, Thiele, 2002) Любые, даже незначительные, сдвиги в их работе, вызванные генетическими или эколошческими факторами, становятся причиной отдаленного развития тяжелых нейродегенеративных заболеваний (Gaggelh et ul, 2006) Системы носят органоспецифический характер и изменяются в течение онтогенеза {Пучкова, Платонова, 2004), они особенно уязвимы у новорожденных (Madsen, Githn, 2007, Penland, Prohaska, 2004, Prohaska etal, 2005)
В Отделе молекулярной генетики ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН было показано, что церулоплазмин (ЦП, мулътимедная голубая оксидаза, выполняющая также роль донора меди для клеток негепатоцитарных рядов (Bielli, Cabbrese, 2002)), входящий в состав молока является регулируемым пищевым источником меди (Платонова и dp, 1999, Платонова и dp, 2004) Новорожденные, вскармливаемые молочными смесями, которые, как правило, обогащены солями меди, получают избыток свободных ионов меди (Пучкова и др, 1997, Lonnerdal, 2005) У новорожденных крыс, вскармливаемых молочными смесями, в печени происходит преждевременная смена эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый тип (Платонова и др, 2005, Platonova et aL, 2007) Одновременно в СМЖ этих животных 7-кратно повышается концентрация меди и ЦП Показано, что ш vitro ЦП в концентрации выше, чем она поддерживается в СМЖ, вызывает гибель нейронов В то же время для дифференцировки молодых нейронов требуется ЦП (Maltais et al, 2003) Вместе эти данные указывают на важность поддержания гомеостаза меди в мозгу в период новорожденности Однако механизмы, контролирующие баланс меди в мозгу новорожденных, не изучены К тому же плохо понято воздействие сдвигов метаболизма меди в целом организме на сбалансированную функцию генов, обеспечивающих гомеостаз меди в мозгу Поэтому исследование связи между обменом меди в организме и экспрессией генов белков, обеспечивающих гомеостаз этого микроэлемента в мозгу, является актуальным
Цель работы заключалась в изучении т. vivo обмена меди в отделах мозга крыс при
различных состояниях метаболизма меди
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи
1 Осуществить мониторинг распределения меди в отделах мозга крыс в течение
онтогенеза Сравнить уровень активности генов медьтранспортных белков и
купроэнзимов в отделах мозга новорожденных и взрослых крыс
-
Изучить влияние искусственного дефицита связанной с церулоплазмином меди в крови взрослых крыс, индуцированного кормлением солями серебра, на метаболизм меди в мозгу.
-
Исследовать влияние серебра, получаемого с кормом крысой-самкой с первого дня лактации, на метаболизм меди в печени и мозгу вскармливаемого ею потомства в течение первых десяти дней жизни
4 Определить основные параметры обмена меди в отделах мозга крыс с
экспериментально индуцированным фибриллогенезом (модель болезни
Альцгеймера, БА)
5 Сопоставить уровень экспрессии генов медьтранспортных белков в
культивируемых клетках линии НС 11 до и после их малигнизации, провести
аналогичные исследования на Арс^" мышах (Mm мыши)
В работе исследовали кору, мозжечок, гшшокамп, миндалевидное тело, гипофиз, гипоталамус и сосудистое сплетение Эти структуры мозга отличаются друг от друга по удельному содержанию меди, уровню и профилю экспрессии генов медьтранспортных белков (Платонова и др, 2005) В качестве маркеров состояния метаболизма меди в работе использованы концентрация меди, относительная активность генов медьтранспортных белков, а также секреторных и внутриклеточных купроэнзимов
Научная новизна полученных результатов. Все полученные данные - новые Показано, что особенностью метаболизма меди в мозгу крыс в период дифференцировки нейронов является высокий уровень мРНК, кодирующей секреторный ЦП Напротив, у взрослых животных преимущественной молекулярной формой является мРНК, кодирующая церулоплазмин, связанный с клеточной мембраной через гликозилфосфатидилинозитоловьш якорь (ГФИ-ЦП) Так как обе мРНК образуются из общего транскрипта в ходе альтернативного сплайсинга, очевидно, что этот процесс строго регулируется в течение развития мозга Также показано, что в различные периоды онтогенеза, при широких, колебаниях концентрации меди и ЦП в крови, в СМЖ она поддерживается на постоянно низком уровне У крыс в течение развития в мозгу повышается концентрация меди В работе показано, что это повышение связано с увеличением содержания в них купроэнзимов
Продемонстрировано, что дефицит церулогшазминовой меди, искусственно вызванный добавлением в пишу AgCl, подавляет в мозгу экспрессию генов медьтранспортных белков, но мало влияет на формирование холо-купроэнзимов и концентрацию меди в клетках Впервые продемонстрировано, что ионы серебра, поступающие в организм новорожденных с молоком, всасываются из ЖКТ, поступают в кровь и накапливаются в печени Показано, что на всех этапах переноса, распределения и выведения атомы серебра остаются в обмениваемой форме Высказано предположение, что ион серебра(1), изоэлектронный меди(1), использует внеклеточные и внутриклеточные транспортеры последней Поэтому модель Ag-крыс может оказаться удобной для изучения транспорта ионов меди и механизмов включения их в активные центры купроэнзимов, за которыми можно следить по серебру Именно этот раздел биологии меди плохо изучен, так как медь не имеет долгоживущих радиоактивных изотопов
Важные результаты получены на модели крыс с индуцированным фибриллогенезом (модель БА) Показано, что у опытных крыс в отделах мозга снижается концентрация меди и нарушается гомеостаз цинка При этом падает активность генов медьтранспортных белков и купроэнзимов Таким образом, нарушение метаболизма меди, наблюдаемое при нейродегенеративных заболеваниях, может быть следствием фибриллогенеза. До сих пор нарушения обмена меди рассматрившотся как причіша фибриллогенеза Возможно, что оба процесса имеют место при различных формах этих заболеваний В работе впервые продемонстрировано, что развивающиеся опухоли, нуждающиеся в меди de novo, как для клеточного роста, так и для ее васкуляризации, возможно, транс-активируют метаболическую систему меди в печени
Научно-практическое значение полученных результатов. Данные, получешгые и разделе, посвященном исследованию онтогенетических особенностей метаболизма меди в мозгу новорожденных, дополнительно указывают на возможное негативное влияние избытка меди, получаемого новорожденными при вскармливании их молочными смесями Данные о влиянии пищевого серебра на метаболизм меди в мозгу взрослых и новорожденных млекопитающих могут учитываться при разработке применения серебра в качестве агента, препятствующего метаболизму меди, при лечении нейродегенеративных и раковых заболевашш К тому же, данные о локальной аккумуляции серебра в гипоталамо-гипофизарной системе и изменении в ней статуса железа и меди однозначно указывают на необходимость дополнительных исследований для получения научно-обоснованных рекомендаций по употреблению воды, обеззараженной обработкой серебром, особенно во время беременности и кормления Положения, выносимые на защиту
-
В течение первою месяца жизни в клетках нервной ткани головного мозга крыс происходит увеличение активности генов, кодирующих купроэнзимы В результате концентрация меди в мозгу повышается В клетках сосудистого сплетения в этот период жизни происходят изменения статуса меди, сходные с таковыми в печени
-
В мозгу в течение онтогенеза изменяется соотношение изоформ ЦП-мРНК, формирующихся путем альтернативного сплайсинга. У новорожденных образуется преимущественно мРНК секреторного ЦП, у взрослых - мРНК ГФИ-ЦД
-
Отсутствие церулоплазминовой меди в крови взрослых крыс, вызванное потреблением с кормом ионов серебра, индуцирует в мозгу подашіение экспрессии генов медьтранспортных белков и гена ЦП Относительный уровень экспрессии генов внутриклеточных купроэнзимов не меняется, но доля митохондриальной СОДІ увеличивается Через гематоэнцефалический барьер ионы серебра переносятся в незначительном количестве, однако, они избирательно аккумулируются в гипофизе и вызывают изменения в обмене меди, железа и щшка в гипоталамо-гипофизарной системе
-
Серебро, добавляемое в корм лактирующей самки, поступает в организм новорожденных, накапливается в печени в тех же компартментах, в которых аккумулируется медь и вызывает снижение оксидазной активности ЦП В мозгу этих животных интенсивность образования секреторного ЦП снижена
-
Фибриллогенез, вызванный прямым введением нейротоксического пептида в желудочки мозга крыс, провоцирует снижение концентрации меди и подавление активности генов медьтранспортных белков во всех рассмотренных отделах мозга, кроме сосудистого сплетения
-
Развитие опухолей в кишечнике у Mm мышей активирует в печени экспрессию генов медьтранспортных белков, участвующих в изменении уровня ЦП в крови В опухолях повышается уровень активности только гена CTR1, белковый продукт которого участвует в импорте меди
Апробация результатов работы. Результаты работы доложены на Пущииской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (2005, 2006 и 2007 гт), на 17-ой Европейской конференции студентов и молодых ученых (Берлин, Германия, 2006), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, май, 2008), на международной конференции Европейской программы «Геном человека» (Барселона, Испания, 2008), на 38-ой международной конференции по координационной химии (Иерусалим, Израиль, 2008), а также на ежегодных собраниях «Неделя науки» в СПбГПУ Устное сообщение 2006 г в Пущино отмечено жюри как лучшее
Личный вклад соискателя. Соискатель участвовала в получении экспериментальных данных, их обработке, обсуждении и описании всех разделов работы Антитела к CTR1 получены аспирантами Кгатченко С А и Затуловским ЕА, измерение концентрации металлов произведено на Физико-механическом факультете ГОУ СПбГПУ Крысы с экспериментальным фибриллогенезом в мозгу получены в Отделе нейрофармакологии ГУ НИИЭМ РАМН Данные о связи между неопластической трансформацией и метаболизмом меди получены соискателем в группе Dr Giorgio Merlo, ассистентаDulbecco Telethon Institute CNR. ITB,Милан, Италия, и в группе проф М Мутанен на кафедре биохимии питания, факультета сельского и лесного хозяйства, Университет Хельсинки, Финляндия Структура диссертации. Диссертация содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы, включаюшцй 260 иностранных и 13 отечественных источников Она изложена на 142 страницах Результаты представлены в 7 таблицах и иллюстрированы 34 рисунками
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Лабораторные живогные и клеточные линии
В работе использованы крысы линии Вистар и белые беспородные крысы, полученные из питомника «Рашюлово»
/ Онтогенетическая модеіь В качестве модели эмбрионального типа метаболизма меди были использованы новорожденные крысы
-
Крысы с дефицитом оксидазного ЦП в крови Самцы линии Вистар с массой тела около 250 г получали в течение 4-х недель корм, содержащий 50 мг AgCl наї кг массы тела крыс в сутки Корм и воду животные получали без ограничения О развитии дефицита меди судили по исчезновению оксидазной активности в сыворотке крови
-
Крысы с индуцированным фибриъюгенезои (модель деменпии альцгеймеровского типа, МДАТ) Самкам крыс линии Вистар массой 180 - 200 г в латеральный мозговой желудочек вводили 5 мкл водной взвеси, содержащей 15 мкг агрегированного пептида, который соответствует по
последова цельности нейротоксичсскому пептиду (З-амилоида (I0YEVHHQKLVFFAEDV1'i, "Sigma", США), на глубину 3,8 мм через операционное отверстие, сделанное над правым боковым желудочком в координатах А = 0,8, L = - 1,5 по атласу мозга крысы (Ftfkova and Магьаіа, 1967) Крыс контрольной группы подвергали такой же операции, но в полость желудочка вводили по 5 мкл стерильной бидистшишровашюи воды В опытах использовали животных через 21 день после операции О развитии у них МДАТ судили по появлению на гистологических препаратах выраженных нейрональных повреждений и замедлению скорости выработки условного пищевого рефлекса {Stepaiiov and Sapronov, 2005)
4 Мыши линии Арс?ы были предоставлены проф М Муганен в рамках работы по стипендии СВМО Часть работы выполнена на клетках линии НС11, первично полученных из эпителия молочной железы мышей на среднем сроке беременности (Merio et al, 1995) Материалы, использованные в работе
Реактивы для проведения электрофореза в полиакриламидном и агарозном гелях, сахароза, детергенты, реагешы для ферментативных реакций, смесь ингибиторов протеаз приобретены у фирмы «Sigma» США неорганические сот;', у фиршш «Mcick», Германия, кислоты, щелочи и хлороформ - у фирмы «Вектон», Россия Реагешы для проведения хемилюминесцентного иммуноблотиига приобретены у фирмы «Amersham», Великобритания Для выделения тотальной РНК использован реактив "TRlzol Reagent", "Invitrogen" (Ветикобриташія) Ферменты, буферные смеси, растворы солей и праймеры для обратной транскрипции приобретены у фирмы «Амплисенс» (Москва) Реактив для определения концентрации белка по Брэдфорду, твердый Си-хелашругощии агент CheIex-100 и белковые маркеры для электрофореза произведены фирмой ' BioRad" (США), ДНК-маркеры - фирмой «Сибэнзим» (Новосибирск)
Антитела. Моновалентные поликлональные кроличьи антитела к Ції сьшоротки крови крысы получены к высокоочищенному препарату ЦП крысы Для получения антител к CTR1 был использован 15-членный пептид, по последовательности соответствующий участку "TMQPSHHHPTTSASH1' Пептвд синтезирован ООО «НПФ Верта», СПб, Россия Кролики породы шиншилла иммунизированы коныопггом пептида с гемоцианином из гемолимфы камчатского краба по общепринятой схеме Специфичность антител проверена методом конкуренции с пептидом и по их связыванию P15/BSA Антитела к ілицеральдегад-3-фосфат дегидрогеназе (ГЗФД), (З-актину и к полноразмерной рекомбинантной СОДІ приобретены у фирмы "Abeam", США
Методы исследования Извлечение отделов моха крыс Крыс подвергали анестезии фенобарбиталом, бОмг/кг массы тела, проводили интракардиальную перфузию 50 мл теплого PBS, содержащего 10 Ед/мл гепарина Мозг помещали на охлажденную чашку Петри и иссекали отделы в соответствии с атласом (Мию, PalLovits, 1981) Материал хранили при температуре-70 С Забор спинномозговой жидкости (СМЖ) производили под эфирным наркозом из затылочной цистерны, в которую вводили полиэтиленовый капилляр, соединенный с микрошприцом системы Гамильтон Кровь собирали из шейных или хвостовых сосудов После образования сгустка сыворотку отделяли центрифугированием Растворимые белый из содержимого желудков экстрагировали следующим образом 100 мг содержимого желудка гомогенизировали в 200 мкл PBS, содержащего коктейль ингибиторов протеаз, гомогенат инкубировали на льду 30 мин, центрифугировали 10000xg 5 мин Для исследования использовали надосадочную жидкость
Субклеточные фракции выделяли методом дифференциального и равновесного цешрифугарования, как описано ранее (Васин и др, 2005) Тотальную РНК изолировали с использованием реактива "TRlzol Reagent" в полном соответствии с инструкцией производителя Полученные препараты РНК (Ауе/Зю = 1,9) по данным электрофореза в 1 % агарозном геле не содержали примесей ДНК и продуктов деградации РНК.
Гель-электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 1% агарозном геле, гели оіфапшвали бромистым этидием В качестве маркеров использовали ДНК-маркеры молекулярных весов длиной 250— 10000 п и фирмы «Сибэнзим», Новосибирск
Синтез кДНЖ проводили в реакции обратной транскрипции (ОТ) на тотальной РНК со случайными праймерами Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) на полученных кДНК использовали уникальные праймеры, подобранные по программе Gene Runner 3 0 Детали проведения анализа описаны ранее (Платонова и dp, 2005)
Иммунойпопшнг Электрофорез белков проводили в 10% или 8%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) с или без додецилсульфата натрия (SDS) по методу Laemmli (1970) Перенос белков из ПААГ на нитроцеллголозную мембрану осуществляли полусухим методом В качестве вторых антител использовали антикроличьи (или антимышиные) козьи гамма-иммуноглобулины, конъюгированные с пероксидазой хрена. Иммунные комплексы визуализировали хемилюминесцеїгшьім методом Количественный (ракетный) иммуноэлектрофорез. Концентрацию полипептидов ЦП определяли методом количественного иммуноэлектрофореза, как подробно описано ранее (Платонова и dp, 2005) Выявление ЦП окрашиванием геля орто-дианюидином, специфическим хромогенным агентом, проводили в соответствии с методом, предложенным Owen и Smith (1961) Определение активноспш СОДІ проводили в геле Активные зоны выявляли в соответствии с ранее описанным методом (Vives-Bauza et ai, 2007) Измерение концентрации металлов. Кусочки ткани взвешивали, гомогенизировали 1 4 в смеси 5% SDS и 5% NaOH, нагревали до потного растворения Во фракции градиента сахарозы добавляли по 100 мкл лизирующеи смеси и прогревали до полного растворения материала. Биологические жидкости использовали без подготовки Концентрацию металлов определяли методом агомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и зеемановской коррекцией неселективного поглощения на спектрометре фирмы «Perkm-Elmer», Model 4100ZL, США Концентрацию белка определяли по методу Лоури или Брэдфорда. В качестве количественного стандарта использовали BSA Статистическую обработку данных проводили по программе ANOVA, значимыми различиями считали различия Р <0 05
