Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы 9
ГЛАВА I. Энкефалияы: современные представления о биосинтезе, высвобождении, механизме действия и функциях 9
ГЛАВА 2, Ферментная инактивация энкефалинов 32
ГЛАВА 3. Эякефалинергическая система мозга и этанол... 47
3.1. Некоторые аспекты действия этанола на ВДС... 47
3.2. Фармакологические доказательства вовлечения опиоидных пептидов в патогенез алкоголизма ... 50
3.3. Нарушение этанолом компонентов ШП .55
Часть 2. Экспериментальная часть 64
ГЛАВА I. Материалы и методы исследования. б^
1.1. Экспериментальные животные и уоловия проведения опыта.
1.2. Подготовка биологического материала для исследований
1.3. Радиоизотопяые методы исследования 68
1.4. Другие методы 72
ГЛАВА 2. Исследование активности энкефалияазы А в неочищенном мембранном материале мозга крыс 76
ГЛАВА 3. Ферментная инактивация энкефалинов и ее роль в механизме действия этанола на ШП 89
3.1, Активность энкефалияазы А у крыо о различным предпочтением к этанолу и воде 89
3.2. Влияние острого и хронического введения этанола на активность энкефалияазы А мозга крыс.. 90
3.3. Исследование механизма активации энкефалияазы А этанолом 97
3.4. Исследование способности конденоагов ацетальдегида с энкефалинами модулировать активность энкефалияазы А
ГЛАВА 4. Влияние этанола на энкефалинергичеокую опиоидную систему мозга крыс 106
4.1.Содержание энкефалинов и связывание с опиоидными рецепторами мозга крыс при остром введении этанола 108
4.2. Нейрохимические показатели состояния энкефалинергической опиоидной системы мозга при экспериментальном алкоголизме у крыс... 112
Часть 3. Обсуждение результатов 122
Выводы 138
Литература
- Энкефалияы: современные представления о биосинтезе, высвобождении, механизме действия и функциях
- Фармакологические доказательства вовлечения опиоидных пептидов в патогенез алкоголизма
- Исследование активности энкефалияазы А в неочищенном мембранном материале мозга крыс
- Исследование механизма активации энкефалияазы А этанолом
Введение к работе
В числе'первостепенных задач, стоящих перед современной медициной, одно из главных мест занимает проблема разработки эффективных способов терапии алкоголизма на основании знания патогенеза этого заболевания (Г.В.Морозов, 1976, 1981).
Согласно существующим представлениям ведущая роль в развитии алкоголизма принадлежит расе тройотвам функций мозга, вызванным нарушениями функциональной активности, нейромедиаторных систем, из которых особо выделяют катехоламиновые системы мозга (Г.В.Морозов, И.П.Анохина, 1983). Однако, низкая эффективность существующих средств и методов лечения алкоголизма (Ю.В. Буров, 1982) делает необходимым дальнейшее изучение патогенеза этого заболевания.
Предпосылки для развития исследований в этом направлении были созданы после открытия опиоидных пептидов мозга - нового класса биологически активных соединений, способных выполнять нейромедиаторную, нейрогуморальную и нейромодуляторную функции (И.П.Ашмарин, 1982, Miller Д98І). В настоящее время можно полагать установленным существование в нервной системе позвоночных животных и человека опиоидных систем, включающих в себя специфические опиоидные рецепторы, эндогенные лиганды опиоидных рецепторов (энкефалины и эндорфины), ферменты их синтеза и катаболизма и характеризующиеся морфофуякциояальным единством своих частей (И.П.Анохина и соавт., 1981). Опиоидные системы регулируют нейрогуморальний ответ, ряд вегетативных функций и способны влиять на эмоциональную сферу человека. Полагают, что такой широкий спектр физиологического действия эндогенных опиоидных пептидов является следствием их модулирующе-
.-7-го влияния на функционирование других нейромедиаторных систем
( Atwen, Kuhar, І983).
В связи с этим было высказано предположение о том, что этанол оказывает свое дейогвие на аминергические структуры мозга посредством влияния на опиоидные системы (И.П.Анохина и соавт., 1982)» Эту точку зрения поддерживают, в частности, данные, свидетельствующие о вовлечении последних в патогенез алкоголизма. Так, показано, что стимуляция опиоидных рецепторов экзогенным мет-энкефалияом и морфином снижает добровольное потребление этанола животными (Но, Eossi , 1982). Наоборот, потребление этанола возрастает в состоянии опиатяой абстиненции и при введении антагонистов опиоидных рецепторов животным с этаяоль-ной зависимостью (Й.П.Анохина и соавт., 1982, Но ,1980). Обнаружено, также, что налоксоя (антагонист опиоидных рецепторов)пре-дотвращает снижение болевой чувствительности, возникающее при введении этанола, а этанол снимает гиперальгезию, вызванную яа-локсоном ass et ai. , 1978, Boada et ai. ,1981). Имеются сведения об однонаправленном влиянии этанола и энкефалияов на обмен кальция и ц-АМФ в мозге (И.А.Сытинский,1980, Blum et al., 1977, west, Miller, 1983). В пользу участия опиоидных систем мозга в патогенезе алкоголизма свидетельствуют и данные о возможности взаимодействия ТГЙХ алкалоидов с опиоидяыми рецепторами мозга (Л.Ф.Паяченко и соавт., 1982).
Таким образом, становится все более очевидным, что воздействие на опиоидные оиотемы мозга с целью устранения влечения к этанолу, является одним из перспективных направлений поиска средств и методов лечения алкоголизма. К сожалению, эти исследования в зяачительяой степени сдерживаются отсутствием конкретных сведений о биохимических механизмах влияния этанола на эн-
- 8 -кефалинергическую опиоидную систему мозга, в том числе на синтез, высвобождение и катаболизм энкефалинов. Возможно, это связано с тем, что до настоящего времени не проведено комплексного исследования основных нейрохимических параметров энкефалинерги-ческой системы на одной модели животных в условиях воздействия этанола
В соответствии со всем вышеизложенным целью настоящей работы явилось изучение влияния этанола на эякефалинергическую яей-ропередачу в эксперименте на крысах. В качестве критериев функциональной активности ЗНП было изучено связывание %-мсрфина, и %-ДАДЛЭ с опиоидными рецепторами, содержание мет- и лей-эн-кефалина и активность энкефалиназы А в стриатуме и среднем мозге (включая гипоталамус) животных.
- 9 -ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Энкефалияы: современные представления о биосинтезе, высвобождении, механизме действия и функциях
Открытие в начале 70-х годов специфических мест связывания морфина, опосредующих его фармакологическое действие ( Pert, Snyder, 1973), поставило перед исследователями вопрос о биологическом значении рецепторов к алкалоиду растительного происхождения в нервной системе позвоночных. Было высказано предположение о существовании эндогенных лигандов этих рецепторов ( Collier, 1973, Goldstein et al. ,1975), которое вскоре получило экспериментальное подтверждение. В экстрактах ткани мозга была обнаружена субстанция с морфиноподобными свойствами, которая представляла собой смесь двух пептапептидов, тир-гли-гли-фен-мет и тир-гли-гли-фен-лей, названных мет- и лей-энкефалинами, соответственно (Hughes ,1975 а,б, Hughes et al., 1975). Аминокислотная последовательность мет-энкефалина оказалась идентичной последовательности 61-65 е -липотропного гормо--на гипофиза ( ЬіД964). Вскоре было показано, что опиоидной активностью обладает целое семейство пептидов, представляющих с обой ра з личные учас тки аминокис ло тяой пос ледова те льнос ти б--липотропина: фрагменты 61-76, 61-91, 61-77, названные -, &-, у-ЭНДОрфинами, соответственно (Bradbury et al. ,1976, Сох et al. ,1976, Guillemin et al.,I976, Ling et al. ,1976). Это послужило основанием для предположения об образовании мет-энкефалина и эндорфинов из одного предшественника - ПОМК (Chre _ tien et al. ,1980). В последующем, исследование эндогенных пептидов о опиатоподобными биологическими свойствами, получивших поэтому название опиоидных, привлекло всеобщее внимание и за короткий промежуток времени оыло накоплено большое количество сведений об этих соединениях. Изменились и представления об их процессинге. В настоящее время известно около двадцати опиоидных пептидов, которые условно объединены в пять групп (по классификации J.S.Morley (1983)). В первую группу входят мет- и лей-энкефалины. Во вторую группу включены пептиды, образующиеся из тех же предшественников, что и энкефалины (см. ниже). В третью группу входят пептиды, образующиеся из ПОМК. Четвертую группу составили прояазо-устойчйвые пептиды физиологических жидкостей: ь-казоморфин-5 и -7 и анодинин. Наконец, пятая группа опиоидных пептидов включает в себя все остальные пептиды, чьи опиатоподобяые свойства не являются следствием прямого взаимодействия с опиоидными рецепторами. Единственный известный представитель этой группы - киоторфин, который, по-видимому, действует на высвобождение эякефалинов. Необходимо отметить также наличие в тканях мозга опиатоактивных веществ непептидной природы, так называемых "морфиноподобных" соединений ( Killian et al., 1981).
Однако, из всей совокупности известных на сегодняшний день опиоидных пептидов одними из наиболее изученных остаются энкефалины.
Распределение эякефалинов в организме. Для обнаружения и количественной оценки содержания эякефалинов используют отличающиеся большой чувствительностью РИА и иммуногистохимические методы. Их применение, однако, не исключает возможности искажения получаемых результатов за счет перекрестной иммунореак-тивности с неидентифицированными.родственными.молекулами, в частности, с предшественниками эякефалинов ( cueiio,i983)
Распределение энкефалинов в организме изучено достаточно подробно. Йммуногистохимическими методами показано, что ЖР содержится в двух типах клеток, К первому относятся нейроны ОДС, нейрогипофиза, периферической нервной системы, клетки симпатического ганглия и родственные им клетки мозгового вещества надпочечников. Второй тип клеток представляет собой эндокринные клетки желудочно-кишечного тракта ( Miller ,1982), Установлено, что некоторые эякефалияовые нейроны, а также эндокринные клетки ЖКТ содержат моноамины (Alumets et al., 1978, Burnstock et al., 1979).
Исследование распределения лей- и мет-энкефалинов по отделам мозга с помощью РИА показало, что эти пептиды имеют сходную локализацию. Наибольшая концентрация энкефалинов отмечена в стриатуме, гипоталамусе, сером веществе вокруг сильвиева водопровода, образованиях лимбической системы. В коре и гиппо-кампе содержание энкефалинов значительно меньше. Самое низкое содержание этих пептидов в мозжечке ( Yan& et а1# ,1977,MiL -ler et al. # 1978, Dupont et al. , 1980). При этом содержанимет-энкефалина во всех иоследоваяных отделах мозга превышает содержание лей-эякефалияа. Однако, соотношение между количеством этих пептидов значительно отличается в различных отделах мозга. Так, в гипоталамусе отношение мет-энкефалин/лей-энке-фалин по данным fi.J.Miller et al. (1978) равно 11:1, в коре - 1,5:1, а для целого мозга составляет 4:1. Возможное объяснение этому факту предложил A.c.Cuello (1983), предположив,что в разных отделах мозга предшественники энкефалинов содержат эти пептиды в разной пропорции.
Цитохимическое исследование энкефалияовых нейронов позволило установить, что энкефалины содержатся в нервных оконча - 12 -ниях, нервных волокнах (аксонах) и перикарионе. Наибольшая плотность ЭИР была отмечена в окончаниях аксонов, а присутствие энкефалинов в перикарионе удалось заметить лишь при подавлении аксонального транспорта пептидов колхицином, что свидетельствует о возможности осуществления энкефалияами медиатор-ных функций в ШС (Elde et al.,I976, Sar et al.f 1978). Все нервные окончания эякефалиновых нейронов содержали 3-4 больших везикулы (75-100 мкм) и большое количество везикул малого размера (40-60 мкм). При этом лишь 25% нервных окончаний образовывали синаптические контакты с немечеными дендритами, пе\/-рикарионами Или с аксонами ( Pellefcier, Le Clerc, 1979, Pickel et al., 1979). Следует отметить, что большинство нейронов содержащих моноамины, которые считаются классическими нейромедиаторами, также не образуют синаптических контактов ( Descarries et al., 1975» 977)
Биосинтез энкефалинов. Энкефалияы образуются из высокомолекулярных предшественников, которые синтезируются в рибосомах при участии HIP (обзоры Hollt ,1983, Hughes ,1983).Вместе с тем, есть единичные указания на возможность синтеза энкефалинов из аминокислот ( Tan , Yu ,1980), который, по-видимому, имеет ограниченное значение. Исследование структуры высокомолекулярных предшественников энкефалинов (ПЗА и ПЭБ по классификации V.Ноlit (1983) стало возможным лишь в последнее время благодаря развитию методов молекулярной биологии, в том числе методов обратной транскрипции информации с м-РНК и клонирования комплементарной ДНК (обзор Hughes , 1983).
Фармакологические доказательства вовлечения опиоидных пептидов в патогенез алкоголизма
В 1979 г. W.JJ effcoat et al. обнаружили, что опиатный антагонист налокоон предотвращает развитие острой алкогольной интоксикации у людей. Вскоре L.J.Lyon et al. (1982) подтвердили эти данные, сообщив, что налокоон выводит пациентов из алкогольной комы. J.M.Khanna et al. (1982) подобные данные получили в опытах на крысах. Ими было показано, что при высоких дозах налоксона, которые сами по себе вызывали конвульсивный эффект, значительно снижалось время этаис лового наркоза. На этом основании они предположили, что эффект налоксона - следствие его аяалептического действия. Однако, J.M. Guerin,G.ixiedberg (1982) обнаружили, что налоксон не эф фективен в случае сочетанной алкогольно-барбитуратовой или алко-гольно-бензодиазепиновой интоксикации, что позволило им отвергнуть предположение о простом аналептическом действии налоксона. Другими исследователями было показано, что налоксон эффективен не во всех олучаях (Lignian efc al., -1-982, Catley et al., І98І, Gilleman, Lightigfeeld, 1982). Идвестно также, что налокоон предотвращает снижение болевой чувствительности при введении этанола, а этанол снимает ги-перальгезию, вызванную налоксоном (Boada et al., І98І, Bass et al., 1978). В настоящее время нет единого мнения о механизме антаго низма налоксона и этанола. Большинство исследователей полагают, что обнаруженные эффекты свидетельствуют о вовлечении в возник новение алкогольного опьянения опиоидных пептидов (Editorial, 1982, Whalley et al., 1981, Boada et al.,1981, Bass et al.,I97, Jeftcoat et aL,I979»Lyon et al.,1982,Guerin,Exiedberg,1982) или ТГИХ-овых алкалоидов (Editorial ,1982). При 3T0M,M.A.Gil leman,F.J.Lightigfeeld (1982), C.D.Kimball et al. (1980) подчеркивают, что эффект налоксона зависит не только от его дозы, но и от исходного состояния опиоидных сие тем,что,возможно, и обуславливает индивидуальную реакцию на этанол или на введение налоксона. Однако, имеются сведения о том, что в эффект налокоона на алкогольную интоксикацию вовлечены не только центральные, но и периферические механизмы. Так, сначала в опытах на крысах ( Вобааду,Evans Д98І), а затем и в экспериментах на людях (Bodawy t EvansД983) было показано, что Налоксоя снижает концентрацию этанола в крови и изменяет метаболизм нико-тинамид-адениновых динуклеотидов. Тем не менее имеющиеся сведения литературы позволяют уверенно полагать, что ведущая роль в механизме антагонизма этанола и налоксояа принадлежит опиоидным системам. К вопрооу о механизме действия ТГИХ-нов. ТГИХ-ны-продукты конденсации ацетальдегида и других альдегидов с биогенными аминами. Так, оальсолинол - продукт конденсации ДА и ацетальдегида, ТШ - ДА и диоксифенилаце та льде гида, тетрагидро-б-карболи-ны (триптолины) - ацетальдегида или формальдегида о производными триптамина. Структурное сходство ТГИХ-овых алкалоидов с опиатами и способность некоторых из них вызывать симптомы зависимости послужили основой для предположения, что алкогольная зависимость и морфинизм могут иметь общие звенья (И.А.Сытинский, 1980, Blum et а1.Д977). Впоследствии эта гипотеза получила существенную поддержку (см.ниже). Сальсолинол и триптолины были обнаружены в ткани мозга ( Holman ,1983), при этом уровень сальсолинола изменялся при хроническом введении этанола и зависел от его концентрации в крови, проявляя отрицательную корреляцию с концентрацией этанола ( Sjoquist efc al. Д982 а, б). Недавно было показано, что оальсолинол в высоких концентрациях содержится в некоторых алкогольных напитках (Duncan , Smithe Д982). Сальсолинол, 5-гидрокситриптолин и 5-метокси-триптолин при их введении в мозг стимулировали добровольное потребление этанола животными, причем эффект сохранялся в течение нескольких месяцев после прекращения введения алкалоидов. 5НМТ и 5ММТ, наоборот, снижали добровольное потребление этанола ( Myers, Oblinserfi977, Tuomisto et al. Д982, а также обз. Holman Д983). Показано также, что при введении некоторых ТГИХ-вых алкалоидов людям и животным у них возникают симптомы, сходные с появляющимися в состоянии алкогольной абстиненции ( Airaksinen, Каті, 1981). До недавнего времени полагали, что ТГИХ-ны оказывают свое фармакологическое действие, изменяя функциональную активность амияергических нервных проводников посредством нарушения метаболизма медиаторов и/или функционируя в качестве фальшмедиа-торов (обз. Holman Д983). Однако, было показано, что яалок-сон, налтрекоон и морфия нарушают добровольное потребление этанола, индуцированное хроническим введением ТТЛ. При этом, морфин снижал потребление этанола, а его антагонисты увеличивали потребление этанола в низких дозах и уменьшали в высоких ( Gri tcher et al» ,1983, Myers, Critcher ,1982). При этом, яалоксон не нарушал потребление этанола крысами линии Донг-Эванс - генетически предпочитающими этанол ( Gaucher et аі.д983). Авторы предположили, что ТГЙХны, возможно, взаимодействуют с опио-идными рецепторами, функционируя либо как агонисты-антагонисты ч -рецепторов, либо как агояисты d-рецелторов. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные Я.Ф.Панченко и соавт. (1982) о том, что сальсолинол, 5НМТ и 5ММТ способны взаимодействовать с опиоидными рецепторами м и о типов. При этом, сальсолинол обладает свойствами антагониста м -рецепторов, а исследование 6- карболияы относятся к разряду агонистов-антагояистов. К близким выводам пришли также T.Berger et al.(i982) при исследовании влияния микроаппликаций этанола и сальсолшола на активность отдельных нейронов. Ими было показано, что этанол и сальсолинол оказывают свое действие активируя опиоидные рецепторы или высвобождая опиоидные пептиды. Однако, было установлено, что в механизм действия сальсолинола вовлечены и мускари-новые рецепторы.
Таким образом, накоплено достаточное количество данных о вовлечении опиоидных структур в механизм действия ТШХовых алкалоидов, однако, полностью механизм их действия до сих пор не ясен. Учитывая, что опиоидные оистемы выполняют в ЦНС роль регуляторних, можно полагать, что, по крайней мере час тично, эффекты ТГИХнов на аминергические системы могут быть опосредованы ошюидными рецепторами.
Другие фармакологические доказательства вовлечения опиоидных систем в механизм действия этанола. При исследовании влияния опиатов и опиоидов на потребление этанола было показано, что опиатные агонисты и мет-энкефалии снижают добровольное потребление этанола ( Но, 1980, Но , Rossi ,1982), эффект мет-энкефа-лина частично обращался налтрексоном ( Но , Bssi Д982). Добровольное потребление этанола возрастало в состоянии опиат-ной абстиненции (Но ,1980),
Исследование активности энкефалияазы А в неочищенном мембранном материале мозга крыс
Для решения поставленных задач было необходимо освоить метод определения активности энкефалиназы А, который позволил бы исследовать активность этого фермента у больших групп экспериментальных животных и одновременно обладал бы достаточной точностью. Немаловажное требование с точки зрения стандартизации условий изучения основных нейрохимических параметров ШП — возможность проведения исследования как активности энкефалиназы А, так и состояния опиоидных рецепторов (исследование содержания энкефалинов требует использования всего участка мозга) в одних и тех же отделах мозга у одного и того же животного. Существующие в настоящее время методы (см. Обзор литературы) рассчитаны на использование в качестве ферментного препарата обогащенной фракции синаптосом, очищенных синаптосом или частично очищенного фермента. Применение указанных ферментных препаратов, несомненно оправданное для исследования физико-химических свойств фермента,в рассматриваемом случае (вследствие увеличения трудоемкости метода) существенно затруднило бы проведение массовых определений активности фермента у большого количества животных и сделало бы невозможным совместное исследование активности энкефалиназы А и функционального состояния опиоидных рецепторов. Удовлетворить поставленным условиям можно было лишь подобрав условия определения активности энкефалиназы А в неочищенном мембранном материале. Препараты мембран получали ме - 77 -тодом с.Gorensfcein,S.H.Snyder (1980), заключающемся в интенсивной отмывке гомогената ткани мозга трис-буфером с низкой ионной силой (см.Методы исследования). Этот метод позволяет избавиться от присутствия в препаратах мембран растворимых белков,в том числе от пептидгидролаз широкого спектра действия (Schwartz et al., 1981), а также от различных низкомолекулярных соединений, включая морфиноподобяые вещества, образующиеся в мозге при введении этанола животным (A.M.Балашов,1983), действие которых на энкефалиназу А не изучено. Для определения активности энкефалиназы А в неочищенном мембранном материале нами был модифицирован метод, описанный M.C.Fournie-Zaluski et al. (1979). В основе этого метода - использование конкурентного ингибитора энкефалиназы А для определения доли -тир-гли-гли, образованного за очет гидролиза радиоактивного субстрата этим ферментом и применение тонкослойной хроматографии для разделения продуктов гидролиза %-лей-энкефалина . Особенность описанной нами модификации этого метода (см. Методы исследования) заключается в том, что (I) с целью повышения удельной активности энкефалиназы А в реакционной смеси увеличена в 30-60 раз концентрация меченого субстрата; (2) с целью более полного подавления активности аминопептидазы (К.Ф.3.4.ІІ.2) в реакционной смеси увеличена в 10 раз концентрация конкурентного ингибитора этого фермента - пуромицинаС Schwartz et al. Д98І). Благодаря внесенным модификациям была получена возможность определения активности энкефалиназы А в неочищенном мембранном материале,что несколько снизило трудоемкость метода и позволило увеличить количество определений в одной серии опытов. Ниже описаны результаты исследования активности энкефалиназы А в неочищенном мембранном материале, которые позволили подобрать оптимальные кониентрации в реакционной смеси некоторых инградиен тов и времени реакций и, таким образом, выяснить область адекватного применения метода и повысить его точность.
На рисунке 3 приведены результаты тонкослойной хроматографии продуктов гидролиза Н-лей-энкефалина мембранной суспензией,полученной из ткани среднего мозга и гипоталамуса крыс, в зависимости от концентрации мембранного белка (0,25-4,0 мг/мл)в реакционной смеси. Хроматограмму разрезали на кусочки длиной по 0,5 см и измеряли их радиоактивность,как описано в Методах исследования.Видно,что по мере уменьшения пика радиоактивности,соответствующего лей-энкефалину,увеличиваются пики радиоактивности,соответствующие тир,тир-гли,тир-гли-гли. Пик радиоактивности, соответствующий тир-гли-гли-фен,не претерпевает существенных изменений.Поэтому, в дальнейшем просчитывали не всю хроматограмму, а лишь измеряли радиоактивность зон совпадающих с положением хроматографических маркеров: тир, тир-гли, тир-гли-гли и лей-энкефалина.
Как видно из рисунка 4,скорость образования Н-тир-гли-гли пропорциональна количеству мембранного белка в реакционной смеси до концентрации 2 мг/мл, при которой достигается прибли-зительно 10% ферментативный гидролиз Н-лей-энкефалина за время инкубации. Для получения стабильных результатов в дальнейших экспериментах нами была выбрана концентрация мембранного белка в реакционной смеси, равная 0,5 мг/мл. (Точка, соответствующая этой концентрации, расположена в средней части линейной области графика).
Исследование механизма активации энкефалияазы А этанолом
В предыдущей главе выявлены некоторые механизмы влияния этанола на ферментную деградацию энкефалинов. Эти результаты дополняют имеющиеся в литературе сведения о действии этанола на другие компоненты энкефалинергической опиоидной системы -энкефалины и рецепторы к ним (см. Обзор литературы). Однако, противоречивый характер имеющихся по этому вопросу данных литературы не позволяет придти к определенному заключению о нейрохимических механизмах нарушения ЭНП этанолом и, следовательно, вскрыть основные механизмы адаптации этой системы к этанолу при формировании алкогольной зависимости. Возможно, что такое состояние изучаемого вопроса связано с тем, что большинство исследований посвящено изучению какого-либо одного параметра ШП (опиоидных рецепторов или энкефалинов)(см. Обзор литературы). При этом условия проведения экспериментов в аналогичных работах разных авторов трудно сопоставимы друг с другом. Это касается как выбора модели для исследования (разными авторами используются различные виды и линии животных, различное время экспозиции животных от момента однократного введения этанола до момента забоя, различные способы и сроки хронической алкоголизации), так и собственно оценки изучаемого параметра. Последнее относится в основном к исследованию опиоидных рецепторов: для их изучения в разных работах применены радиоактивные метки, отличающиеся по селективности к разным типам опиоидных рецепторов.
В оложившейся ситуации очевидна необходимость проведения комплексного исследования основных нейрохимических параметров ЗЕЛІ на одной модели животных в условиях воздействия этанола. Такой подход позволяет не только охарактеризовать изменения каждого из исследуемых компонентов ЭНП по отдельности в одинаковых условиях, но и предоставляет возможность для обобщающего заключения о биологическом значении обнаруженных изменений для функционирования ЭНП как целого.
Единственная попытка исследования такого рода была предпринята лишь недавно (Р.Ю.Юхананов,1983). Однако, в этой работе изучены лишь отдельные стороны влияния этанола на ШП. В частности, автор не коснулся вопроса о ферментной деградации энкефалияов - в работе были исследованы содержание эякефалинов и состояние опиоидных рецепторов мозга (см. Обзор литературы).
При этом для характерно тики опиоидных рецепторов был попользован высокоеелективний антагонист опиоидных рецепторов ум-типа, -налоксон, что не позволяет с достаточной точностью исследовать (5-тил опиоидных рецепторов. Другой особенностью является то, что при исследовании влияния острой алкогольной интоксикации на изучаемые параметры выбрана достаточно продолжительная экопозиция крыс от момента введения этанола до момента забоя, за время которой, вследствие краткосрочной адаптации, система способна придти в равновесие. Однако, определение содержания энкефаяинов в мозге, которое отражает соотношение между синтезом пептидов и их поступлением in si (см. Обзор литературы), является наиболее показательным до установления равновесия между этими двумя процессами. Наконец, соотояяие исследуемых параметров не изучено в отдаленные сроки после отнятия этанола у хронически алкоголизированных крыс, что особенно важно с точки зрения оценки вовлечения опиоидных систем в формирование алкогольной зависимости (Методические рекомендации.., 1980).
В связи с вышеизложенным нами было проведено изучение связывания %-морфина и %-ДАДЯЭ с опиоидными рецепторами, содержания мет- и лей-энкефаяинов и активности эякефалиназы А в тканях мозга крыс при однократном введении этанола, а также на модели экспериментального алкоголизма.
Для исследования влияния однократного введения этанола на указанные параметры ШП животных забивали по достижении мак - 109 -симальной концентрации этанола в изучаемых отделах мозга (см.
Методы исследования), в момент, когда, по нашему мнению, изменения должны быть наиболее выраженными (см. выше). Результаты определения специфического связывания %-ДАДЛЭ и %-морфи-яа и содержание энкефалинов в стриатуме и среднем мозге (вкляь чая гипоталамус) интактяых крыс при однократном введении им этанола представлены в таблицах 8 и 9. (Данные об активности энкефалиназы А при остром введении этанола - см. Главу 3, рисунок 7). Из таблицы 8 видно, что однократное введение этанола в дозах 1,5 -4,5 г на I кг массы животного приводит к сяи 3 жению специфического связывания Н-ДАДЛЭ как в стриатуме, так и в ореднем мозге (включая гипоталамус). При этом величина спе з пифического связывания Н-морфина не отличается достоверно от контрольных значений. Эти результаты подтверждают полученные I«P.Anokhina et ai. ,(1983) и Р.Ю.Юхаяовым (1983) данные об изменении связывающих характеристик шиоидных рецепторов мозга крыс при остром введении этанола, а также сведения J.M.Hiller efc al. (1981), A.Pfeiffer et al. (1981) И B.Tabakoff, P.L.Hoffman (1983) о том, что опиоидные рецепторы о-типа более лабильны к действию этанола.
