Введение к работе
Актуальность исследования. Медь, после железа, является самым распространенным микроэлементом Она входит в активные центры купроэнзимов, которые у млекопитающих участвуют в окислительном фосфорилировании, детоксикации активных радикалов, синтезе коллагена и эластина, образовании окиси азота, нейромедиаторов и нейропептидов, а также контролируют двунаправленный перенос ионов железа через мембраны (Karlm, 1993, Torres, Wilson, 1999, De Freitas et al, 2003) Одновременно ионы меди являются высокотоксичными агентами, так как способны индуцировать образование радикалов, разрушающих все типы биомолекул (binder, 2001) Безопасное поступление ионов меди в клетки, перенос их к местам образования купроэнзимов и выведение из клеток обеспечивает специальная система белков (метаболическая система меди, МСМ) (Репа et al, 1999)
В последние годы некоторые гены этой системы клонированы и изучены основные принципы ее работы Общий план организации МСМ прокариотов и эукариотов одинаков — она включает интегральные мембранные и растворимые цитозольные белки, гены этих систем ортологичны, их структура характеризуется высокой консервативностью, а функции сохраняются в эволюции В этой системе важную роль играют два семейства белков, участвующих в транспорте меди через мембраны родственные медьтранспортные АТФазы Р1 типа - АТФаза Менкеса (Atp7a) и АТФаза Вильсона (Atp7b) (Сох, Moore, 2002) и белки семейства CTR1, включающие высокоафинные импортеры меди (Sharp, 2003) К неклеточным компонентам МСМ млекопитающих может быть отнесена секреторная форма церулоплазмина (ЦП), медь содержащего гликопротеина сыворотки крови, которая, помимо транспорта меди, вместе с изоформой ЦП, связанной с клеточной мембраной через гликозил фосфатидил инозитоловый якорь (ГФИ-ЦП), участвует и в метаболизме железа (Patel et al, 2000 Fortna et al, 1999)
Перенос ионов меди белками этой системы к местам образования купроэнзимов происходит однонаправлено и последовательно при прямых белок-белковых взаимодействиях, благодаря которым в клетках нет свободных ионов меди (Rae et al, 1999) У млекопитающих баланс меди поддерживается согласованной работой тканеспецифических МСМ,
центральным звеном которых является МСМ печени Общее число участников МСМ у млекопитающих увеличивается за счет паралогичных генов, и МСМ клеток различных органов отличаются друг от друга комбинацией белков, входящих в эту систему, уровнем экспрессии кодирующих их генов и хронологией активации в течение развития (Пучкова, Платонова, 2003)
У человека мутации в генах МСМ являются причиной целого ряда тяжелых моногенных рецессивных наследственных заболеваний (болезнь Вильсона, болезнь Менкеса, ацерулоплазминемия) (Сох, Moore, 2002) Более того, гетерозиготное носительство мутаций в этих генах играет существенную роль в развитии нейродегенеративных болезней пожилого возраста (Johnson, 2001) Также показано, что болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и прионовые болезни тесно связаны с нарушением метаболизма меди и зависимого от него транспорта железа (Brown, 2003) К тому же даже незначительные нарушения метаболизма меди как экологичекого, так и наследственного характера, приводят к развитию нейродегенеративных заболеваний (Gaggelhet al, 2006)
Все это привлекает пристальное внимание к механизмам, обеспечивающим круговорот меди в мозгу, многие стороны которого остаются не понятыми Это в первую очередь касается регионспецифических особенностей метаболизма меди в мозгу, общей организации автономной системы поддержания баланса меди за гематоэнцефалическим барьером и связи между статусом меди отдела мозга и его физиологическими функциями
Цель работы - сравнительное изучение статуса меди и профиля экспрессии генов медьтранспортных белков в различных отделах головного мозга взрослых крыс Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи
Определить статус меди в различных отделах мозга (кора, гипофиз, мозжечок, миндалевидное тело, гипоталамус, гиппокамп и сосудистое сплетение) взрослой крысы
В отделах мозга крыс, взятых в рассмотрение, методом полуколичественного ОТ-ПЦР определить квазистационарную концентрацию мРНК, кодирующих медьтранспортные белки МСМ ЦП, ГФИ-ЦП, Atp7a, Atp7b и CTR1
Установить внутриклеточную локализацию белковых продуктов генов Ср, Atp7anAtp7bB этих отделах мозга
Определить тип клеток нейрональной ткани, в которых экспрессируются изучаемые гены МСМ
Положения, выносимые на защиту.
1 Метаболическая система меди мозга состоит из ряда
регионспецифических МСМ
МСМ различных отделов мозга отличаются профилем экспрессии генов, поддерживающих в них гомеостаз меди
Внутриклеточная локализация медьтранспортных белков отличается в различных отделах мозга
Нейроны, клетки глии и эпендимы отличаются набором белков МСМ, синтезирующихся в них
Научная новизна полученных результатов. В работе показано, что отделы мозга крысы отличаются друг от друга по содержанию меди и баланс меди в них поддерживается регионспецифическими МСМ На это указывает то, что 1) активность генов, участвующих в переносе меди, существенно отличается в разных отделах мозга, 2) в нейронах, глиальных клетках и клетках эпендимы экспрессируются разные комбинации белков, транспортирующих медь Полученные данные позволили разделить изучаемые отделы мозга по свойствам их МСМ на три группы 1. Отделы мозга, характеризующиеся глиальным индексом примерно 1 В этих отделах практически одинаковая концентрация меди и содержание Ctrl-мРНК, ГФИ-ЦП-мРНК и Atp7a-MPHK В тоже время в них очень низкий уровень Atp7b-MPHK и не найдена ЦП-мРНК При этом в глиальных клетках экспрессируется ГФИ-ЦП-мРНК, а в нейронах - Atp7a-MPHK В эту группу входят кора, миндалевидное тело, мозжечок и гиппокамп
Отделы, характеризующиеся высокой концентрацией меди, выраженной активностью генов Atp7a и Atp7b, а также присутствием ЦП-мРНК В эту группу входят специализированные железы нейросекреции гипоталамус и гипофиз
Третья группа представлена одним отделом - сосудистым сплетением Этот отдел мозга практически не содержит ионов меди, но характеризуется
самым высоким содержанием мРНК всех изученных медьтранспортных белков
Научно-практическое значение полученных результатов. Данные о содержании и распределении ионов меди, а также об уровне и месте экспрессии изучаемых генов МСМ крысы в различных отделах мозга будут способствовать пониманию механизма, обеспечивающего баланс меди в мозгу млекопитающих Эти результаты при сопоставлении с регионспецифическими изменениями, наблюдаемыми при различных нейродегенеративных заболеваниях, могут помочь понять роль нарушений гомеостаза меди в развитии этих заболеваний
Апробация результатов работы. Результаты работы были доложены в форме устных и стендовых сообщений на 10-ом Международном Конгрессе по генетике человека, Вена, Австрия, 15-19 мая 2001 г, III Съезде биохимического общества России, Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 г, Конференции молодых ученых Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины-2002 Санкт-Петербург, 6-ой, 7-ой, 8-ой и 9-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века, Пущино-на-Оке, 2002 - 2005 г г, Международной Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, Киев, Украина, 25-27 сентября, 2003 г, на 12-ом Международном Конгрессе по генетике человека, Бирмингем, Великобритания, 2003 г, Пятом съезде российского общества медицинских генетиков, Уфа, май 2005г
По результатам диссертации опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах, которые входят в перечень изданий рекомендованных ВАК для публикации результатов, представляемых в диссертациях
Личный вклад соискателя. Соискатель принимал участие во всех экспериментах Получение субклеточных фракций, экстракция мРНК, электрофоретический анализ, иммуноблоттинг и подготовка образцов для измерения концентрации ионов меди проводились лично соискателем ОТ-ПЦР анализ проведен соискателем вместе с Платоновой Н А Иммуногистохимический анализ проведен совместно с Барабановой С В на базе Отдела общей паголоіии и патологической физиологии ГУ НИИЭМ РАМН Измерение концені рации меди проводилось в Санкт-Петербургском
Государственном Политехническом Университете Соискатель принимал участие в планировании экспериментов, обработке результатов, их анализе и в подготовке публикаций
Структура и объем диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы", "Список
