Введение к работе
Актуальность проблемы. Для метаболизма липидов мозга, как и других биохимических соединений, характерно сочетание процессов их синтеза и распада (Ansell О.В., Hawthorne J.N., 1964, Прохорова Н.И., 1979, Дин Р., 1981, Хухо Ф., 1990. Vance J.E. et al., 1991).
Одним из весьма широко распространенных биологических явлений, где реакции распада превалируют над синтетическими япляется яутоліп (автолиз). Если ранее в 60 - 70 годах текущего столетия под аутолнзом понимали выработанное в процессе зполюннн свойство Сиочогичсскнх объектов разлагать гидролитическим путем собственные структуры разного уровня (Лушников Е.Ф., Шапиро НА., 1974), то в настоящее время, благодаря использованию новых современных методов биохимического анализа, а также на основе многочисленных исследований аутентических процессов в различных органах, тканях и их ультраструктурах (Грибанов Г.А., 1977-1994, Ребров Л.Б.. Козельцев В.Л. и др., 1983, Мссрсон Ф.З., 1990) была выявлена некоторая односторонность имевшихся ранее представлений о биохимии аутглнза. На современном этане аутолнз определяют как "выработанное в процессе эволюции свойство биологических объектов разлагать ферментативным и неферментатнвным путем собственные структуры разного уровня с пренмущестг :нным участием гндролазных, а также трансфераэных и других реакций биодсірадации и бнотрансформации их молекулярных компонентов" (Грибанов Г.А., 1986).
Однако, в отечественной и зарубежной литературе имеется крайне мяло сведений об аутолнтнчесхом распаде такого важного в структурном и функциональном отношении компонента центральной нервной системы, каким являются липида. Вместе с тем, проведены многочисленные исследования, посвященные изучению поведсння липидного компонента мозга при различных патологических состояниях (ишемия, гипоксия и др.), в которых установлена достаточно высокая лабильность ряда липидных фракций (Bazan N.C., Rodriguez de Тнгсо Е„ 1980, Гастева СВ., Райэе Т.Е., 1984, Замурцев О.Н., 1984, Путнлнна Ф.Е., Осадчая Л.М. и др., 1986,
Ншшскнй В.A., 1987, Moto A., Hiroshima Y. et al., 1989, Fisrum E., Charderbhan R. et al., 1990, Логинопа М.П., Ассур M.B., Швец H.A., 1994). Липиды сшіаптических мембран мозга, как показано современными исследованиями, не только участвуют в передаче информации, но и служат уникальной матрицей для ее хранения (Бурлакова Е.Б. и др., 1990).
D связи с этим актуальность исследования определяется важной ролью аутолиза в деградации различных структур мозга, его липидного компонента при патологических состояниях н особенно в посмертном пергчде как на ранних, близких к клинической смерти, так и на более поздних этапах умирания.
Цель и задачи исследовании. Целью настоящей работы явилось изучение изменений липидов различных отделов и ультра структур головного мозга крыс в ходе посмертного аутолиза.
Основными задачами иыли:
-
Изучение изменений содержания общих липидов, общих фосфолнпидов головного мозга крыс при посмертном аутолизе в условиях in vitro на тканевом уровне (серое и белое вещество);
-
Исследование характера изменении основных групп эндогенных липидов серого и белого вещества мозга в динамике аутолнтнческого процесса in vitro;
-
Изучение изменений содержания общих липидов и общих фосфолипидов в некоторых ультраструктурах головного мозга (синаптосомы, миелин, митохондрии) в ходе аутолиза как в условиях /л vitro, так и при нахождении мозга в трупе животного (НМТ);
-
Выяснение общих закономерностей и специфических особенностей аутолнтической деградации и трансформации основных групп эндогенных липидов в ультраструктурах мозга в условиях in vitro и НМТ.
Научная новизна, В работе впервые проведено комплексное сравнительное изучение изменений липидного компонента разнофуикциональных тканевых и ультраструктур головного мозга крыс при различных моделях посмертного аутолиза (в условиях in vitro и при НМТ)- В результате
проведенных исследовании установлено, что уже на ранних, близких к клинической смерти этапах посмертного аутолша (6 - 7 мин, 10 мин, 40 мин) практически по всех изученных структурах мозга отмечаются существенные изменения содержания ОЛ, ФЛ (см. список сокращении), и ряда линидных фрнкцнп (X, ТГ, СЖК, ФЭЛ, ФХ, ФК и др.). Показано, что с увеличением времени аутолнза (! и 4 ч) как на тканевом уровне, так и в ультраструктурах (миелин, митохондрии) наблюдается феномен "возврата" относительного содержания р>.да линидных фракции к своим исходным значениям. Однако, через 21 і аутолнза вновь наблюдается усиление гидролитического распада лнпндов.
"Установлено, что в условиях нахождения мозга в трупе животного изменения липидов ультраструктур по q>aencHiiio с аутолнзом in vitro имеют как сходный, так и различный характер в зависимости от сроков аутолнза. Отмечено, что в условиях НМТ значительные перестройки Некоторых лнпндиых фракций происходят раньше, чем в условиях in vitro.
В работе проанализированы возможные пути метаболических взаимоотношений отдельных групп липидов на основе не только гидрелазнмх, но и грянсферазных, а также иных механизмов бнодеградапин и биогрансформации лнпидного компонента головного мозга крыс в динамике аутолнза.
Теоретическое и практическое значение работы. Проведенные Исследования способствуют более глубокому пониманию мопекулярно-бнохимнческнх механизмов аутолнза и таиатогенеза мозга, дополняют и расширяю! представления.!) роли и значении лнпидного компонента в процессах гибели тканевых и субклеточных структур мозга. Полученные экспериментальные данные открывают возможность" поиска путей контроля и даже предупреждения развивающейся уже в раннем посмертном периоде лсіралации важнейших лнпндиых компонентов в различных отделах И структурах мозга.
Результаты исследований могут быть полезными не только в области биохимии термттлышх состояний, в том числе для корнн и практики ряда реанимационных мероприятий, но и иметь важное значите в оцеже
молекудярио-биохимических парамеїрои мозговой тканії в условиях ее консервации и трансплантации, а также в судебно-медицинских, геронтолої ических її палеобиохішических исследованиях.
В процессе работы был разработан метод быстрого и качественного получения образцов ткани мозга, а также модифицирован высокочувствительный способ анализа содержания Рлип. с помощью малахитового зеленого отечественного производства, по которым оформлено 2 рацпредложения и получены акты на внедрение в Тверской государственной медицинской академии. Разработанные методы' применяются также в учебной и научно-исследовательской работе студентов кафедры биохимии и биотехнологии Тверского государственного университета. Новые данные об особенностях биохимических перестроек липидов в различных структурах мозга используются автором при .іроведешш занятий со студентами кафедры, выполнении ими курсовых и дипломных работ, связанных с изучением изменений липидов мозга в ходе аутолгаа.
Апробация работы. Основные положения диссертации и отдельные фрагменты работы докладывались и обсуждались на научной конференции профессорско-преподавательского состава и сотрудников Тверского государственного университета. ~ Тверь., 1993; VI симпозиуме по биохимии липидов. - Санкт-Петербург., 3 - 6 октября, 1994; научной конференции Тверской государственной медицинской академии "Современные вопросы диагностики и лечения". - Тверь.; 1994.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописної о текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и списка литературы, включающего 159 источников, из которых 65 иностранных. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 14 рисунками и схемами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Опыты проводились на беспородных белых крысах-самцах массой 170 - 250 г и на крысах-самцах липни Вистар массой 140 -160 г. Животных забивали деканнтаиисй. Аутолнз тканевых срезов (серое и белое вещество) проводили п асептических условиях при Т = +37 Сив условиях 100% относительной влажности в течение 6 - 7 мин, 1 ч, 4 ч и 24 ч. Выделение субклеточных фракций мозга (синаптоомы, миелин, митохондрии) проводили по общепринятым методикам (Dj Robertis Е., 1973, Прохорова Н.И., 1982). Исследования по ауголизу ультра структур Проводились в 2-х вариантах: a) in vitro и б) после нахождения мозга в теле умерщвленного животного. Полученные суспензии ультраструктур инкубировали в перильных плотно закрытых пробирках при Т = +37 С в течение 10 мин, 40 мин, 4 и 24 ч. Во втором варианте головы животных оставляли в кювете при Ткомн. и извлекали мозг спустя 10 и 40 мин с последующим выделением субклеточных фракций.
Выбор указанных сроков обусловлен следующими причинами: а) 0 ч (1,5 - 2 мни после дскапнтацнн) - исходное состояние ткани мозга; б) 6 - 7 мин, 10 мин - нреднолаї аемое время клинической смерти; в) 40 мни, 1 и 4 ч - начальные этапы развития биологической смерти; г) 24 ч - развитие глубоких (как правило, необратимых) деструктивных процессов (Иегоискнй В.Л., 1987).
Экстракцшо общих лниидов из ткани мозга проводили по методу Фолча и др. (Folch J. ct at., 1957), а из субклеточных фракций по методу Блайя и Дайсрп (Bligh Е., Dyer W., 1959). Содержание ОЛ и их фракций, ОФЛ и их отдельных представителей определяли экспрессными микро- и ультрамнкромстодями с применением одномерной тонкослойной хроматографии на силнкагеле (Грибанов Г.А. и com., 1975 - 1977). Разделение фракций фосфолипндов субклеточных структур проводили модифицированным хроматографнческнм методом (Кейтс М., 1975, Молочкнна Е.М., 1992). Результаты обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдсита (Терентьсл И.В., Ростова И.С., 1977).
