Содержание к диссертации
I. ВВЕДЕНИЕ 8
П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
2.1. Липиды головного мозга. Состав, содержание и их функции 12
2.2. Гипоксия и ее воздействие на биохимические процессы в нервной ткани 18
2.2.1 Современные представления о гипоксии 18
2.2.2. Некоторые особенности метаболизма в нервной ткани при гипоксии 22
2.2.3 Влияние кислородной недостаточности на липидный обмен в головном мозге 29
2.3. Аутолиз и его биологическое значение 32
2.3.1. Современные представления об аутолизе 33
2.3.2. Биохимические механизмы развития смерти и аутолиза нервной ткани 37
2.3.2.1. Изменения энергетического статуса, углеводного и азотистого обменов в переживающем мозге , 38
2.3.2.2. Особенности обмена липидов в мозге при умирании и аутолизе 41
2..4. Роль ионов кальция при умирании и кислородной недостаточности мозга 45
2.4.1 Участие ионизированного кальция в гипоксических повреждениях и деструктивных процессах клеток переживающего мозга 46
2.4.2. Блокирование кальциевых каналов - один из способов коррекции гипоксических состояний 51
2.4.3. Действие верапамила на липидный компонент и кальций-зависимые процессы в клетках 53
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 56
3.1. Объекты исследования 56
3.2. Организация исследований 56
3.2.1. Создание модели острой гипобарической гипоксической гипоксии 56
3.3. Исследование аутолитических изменений липидов в тканевых срезах серого и белого вещества мозга 56
3.3.1. Получение исследуемого материала 56
3.3.2. Выбор сроков инкубации 57
3.4. Методы анализа липидов 58
3.4.1. Получение и очистка общего липидного экстракта 58
3.4.2. Анализ общих липидов и их отдельных фракций 59
а) количественное определение общих липидов 59
б) микроанализ липидных фракций с помощью микротонкослойной хроматографии 60
3.4.3. Микрометоды определения общих фосфолипидов и их фракций... 62
а) количественное определение общих фосфолипидов , 62
б) микротонкослойная хроматография фосфолипидов и их
количественное определение 63
3.5. Изучение влияния верапамила на липиды мозга 65
3.5.1. Исследование влияния верапамила на состав и содержание липидов белого и серого вещества мозга при аутолизе в условиях острого гипоксического воздействия 65
3.6. Статистическая обработка результатов исследований 66
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 67
4.1. Изменения липидного компонента ткани серого и белого вещества головного мозга крыс в процессе аутолиза в обычных условиях и после острой гипобарической гипоксической гипоксии 68
4.1.1. Изменения содержания общих липидов и их фракций в белом и сером веществе мозга при аутолизе in vitro 68
4.1.2. Аутолитические изменения общих липидов и их фракций в ткани серого и белого вещества мозга крыс после острой гипоксии 72
4.1.3. Динамика изменений содержания общих фосфолипидов и их фракций в сером и белом веществе при аутолизе in vitro 76
4.1.4. Изменения содержания общих фосфолипидов и их отдельных классов в ходе аутолиза серого и белого вещества головного мозга крыс после острой гипобарической гипоксической гипоксии 80
4.2. Влияние верапамила на изменения липидных показателей серого и белого вещества головного мозга крыс в процессе аутолиза in vitro в обычных условиях и при последующем воздействии гипоксического фактора 84
4.2.1. Влияние верапамила на аутолитические изменения общих липидов и их фракций ткани серого и белого вещества мозга крыс 84
4.2.2. Изменения фосфолипидных показателей серого и белого вещества головного мозга крыс при аутолизе под действием верапамила... 88
4.2.3. Динамика изменений липидных показателей серого и белого вещества мозга крыс при аутолизе in vitro после действия верапамила и острой гипобарической гипоксической гипоксии 91
4.2.4. Влияние верапамила и острой гипобарической гипоксической гипоксии на аутолитические изменения фосфолипидного компонента серого и белого вещества головного мозга крыс 95
V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 99
5.1. Характеристика и возможные молекулярно-биохимические механи змы влияния острой гипобарической гипоксии на липидные показатели серого и белого вещества головного мозга крыс при аутолизе in vitro 99
5.1.1. Молекулярно-биохимические механизмы аутолитических изменений общих липидов и их отдельных фракций в сером и белом веществе головного мозга крыс после острой гипобарической гипоксической гипоксии 100
5.1.2. Особенности изменений общих фосфолипидов и их отдельных фракций в сером и белом веществе головного мозга крыс в процессе аутолиза in vitro после действия гипоксического фактора 107
5.2. Молекулярно-биохимические механизмы влияния верапамила и последующей острой гипобарической гипоксической гипоксии на аутолитические изменения липидного компонента серого и белого вещества головного мозга крыс 116
5.2.1. Действие верапамила на динамику изменений общих липидов и их фракций в ткани серого и белого вещества головного мозга крыс при аутолизе in vitro 116
5.2.2. Особенности аутолитических изменений фосфолипидных показателей в белом и сером веществе мозга под действием верапамила.. 120
5.2.3. Характеристика влияния верапамила и острой кислородной недостаточности на изменения липидных показателей серого и белого вещества головного мозга крыс при аутолизе in vitro 123
5.2.4. Влияние верапамила и последующей ОГГГ на аутолитические изменения фосфолипидного компонента ткани серого и белого вещества головного мозга крыс 128
VI. ВЫВОДЫ 133
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 136
Введение к работе
Актуальность исследования: Центральное место при развитии деструктивных изменений в переживающих структурах нервной системы в условиях ишемии, гипоксии и других энергодефицитных состояний могут занимать аутолитиче-ские процессы [Лушников Е.Ф., Шапиро Н.А., 1974, Ikuta F. et al., 1993]. На основе многочисленных исследовании [Ребров Л.Б. и др., 1983, Грибанов Г.А., 1977-2003], посвященных изучению биохимических аспектов аутолиза в различных органах и тканях, было предложено следующее его современное определение «Аутолиз - это выработанное в процессе эволюции свойство биологических объектов разлагать ферментативным и неферментативным путем собственные структуры разного уровня с преимущественным участием гидролазных, а также трансферазных и других реакций биодеградации и биотрансформации их молекулярных компонентов» [Грибанов Г.А., 1986]. В настоящее время опубликовано немного работ по изучению изменений липидного компонента головного мозга в процессе аутолиза in vitro в норме и при различных экспериментальных воздействиях [33, 34, 35].
Наиболее распространены поражения нервных клеток при гипоксии, что связано во многом со структурными и функциональными изменениями липи-дов различных биологических структур. Одним из существенных деструктивных факторов в развитии постгипоксических повреждений липидного компонента в нервных и других тканях является увеличение содержания внутриклеточной концентрации кальция, что приводит к активации Са2+-зависимых процессов липолиза в клеточных мембранах, нарушению структуры и функций биомембран и гибели клеток [196, 241, 258]. В качестве средств антигипоксиче-ской защиты мозга часто используются блокаторы кальциевых каналов, которые воздействуют на основные звенья патогенетической цепи, возникающей при ишемии и гипоксии органов [158, 259, 234]. Одним из широко применяемых антагонистов кальция, используемых при коронарной недостаточности и обладающих кардиопротекторными свойствами, является верапамил, антиги поксическое действие которого показано и для ткани мозга [12, 72, 152]. Однако остаются по-прежнему мало изученными вопросы влияния верапамила на метаболические превращения липидов головного мозга как в обычных условиях, так и при дефиците кислорода и аутолизе. Очевидно, что оценка действия широко применяемого блокатора кальциевых каналов верапамила на изменения липидного компонента серого и белого вещества головного мозга в процессе аутолиза в обычных условиях и при последующем воздействии гипоксии может представлять определенный теоретический интерес и практическую значимость, поскольку в динамике аутолитических изменений могут отражаться не выявляемые при жизни метаболические нарушения, обусловленные различными внешними и внутренними факторами, воздействиями.
1. Цель и задачи исследования: Целью настоящего исследования явилось изучение влияния острой гипобарической гипоксической гипоксии и верапамила на характер изменений липидного компонента серого и белого вещества головного мозга крыс в ходе аутолиза in vitro. Перед исследованием были поставлены следующие задачи: Изучить характер метаболических перестроек различных групп липидов и фосфолипидов на разных сроках аутолиза серого и белого вещества головного мозга после действия острой гипобарической гипоксической гипоксии.
2. Исследовать действие верапамила на изменения липидных показателей серого и белого вещества головного мозга крыс при аутолизе in vitro.
3. Оценить влияние верапамила на характер и динамику аутолитических превращений липидов исследуемых структур мозга при последующем воздействии острой кислородной недостаточности.
Научная новизна: В работе представлены приоритетные данные о влиянии острой гипобарической гипоксической гипоксии на динамику аутолитических изменений липидного компонента ткани серого и белого вещества головного мозга крыс. На основании полученных результатов установлено участие верапамила в регуляции содержания липидов и их отдельных представителей в ткани серого и белого вещества мозга в обычных условиях и при кислородной недостаточности. Проведено сравнительное изучение аутолитических изменений липидного спектра в сером и белом веществе головного мозга крыс в условиях предшествующей острой гипобарическои гипоксии, введения верапамила и действия верапамила с последующей острой гипоксией. Дан анализ возможных метаболических превращений отдельных групп липидов серого и белого вещества головного мозга крыс при указанных воздействиях. Использование модели аутолиза может быть полезным для выяснения не выявляемых прижизненных нарушений биохимических процессов в тканях организма при действии как неблагоприятных факторов (гипоксии), так и лекарственных препаратов. Теоретическое и практическое значение: Проведенные исследования способствуют более глубокому пониманию молекулярно-биохимических механизмов влияния кислородной недостаточности, а также антагонистов кальция (верапамила) на изменения липидов мозговой ткани, а также их превращения при аутолизе in vitro. Результаты исследования могут быть использованы для прогнозирования посмертных процессов в мозговой ткани как в обычных условиях, так и после действия кислородной недостаточности. Полученные экспериментальные данные необходимо учитывать при выборе способов коррекции постгипоксических состояний мозга, а также в ребиотизационных, реанимационных мероприятиях и при трансплантации нервной ткани. Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Острая гипобарическая гипоксическая гипоксия видоизменяет липидный состав в сером и белом веществе головного мозга крыс. В процессе аутолиза в исследованных мозговых структурах гипоксическое воздействие усиливает гидролиз ФЛ, ФЭА и ФХ, способствует трансацилазным перестройкам в системе ФЛ-ДГ-ТГ в белом веществе мозга, а также стимулирует трансферазные превращения в системах ФЭА— ФС, ФХ— СФМ (в сером веществе) и ФЭА— ФХ, ФХ— СФМ (в белом веществе).
2. Однократная инъекция верапамила в дозе 0,6 мг/кг видоизменяет липидный и фосфолипидный состав тканей исследуемых структур мозга. Аутолитические перестройки липидов в сером и белом веществе под действием верапамила происходят на поздних сроках и сопровождаются гидролизом ФЛ с накоплением СЖК. При этом на ранних сроках инкубации серого вещества верапамил индуцирует реакции биотрансформации фосфолипидов (в системе ФИ ...— ФХ), а через 24 ч в обеих структурах мозга способствует гидролизу ФХ. 3. Введение верапамила (в дозе 0,6 мг/кг) перед ОГГГ не препятствует развитию количественных изменений липидных показателей исследуемых структур головного мозга крыс, происходящих под действием острой гипоксии. В процессе последующего аутолиза наблюдаются близкие к контрольным значениям изменения относительного содержания большинства липидных фракций серого и белого вещества головного мозга крыс.
Апробация работы: Материалы диссертационного исследования докладывались и обсуждались на X Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации», Москва, 2001; III Областной научно-практической конференции молодых ученых «Химия и химическая технология», Тверь, 2001; научной конференции аспирантов и студентов ТвГУ, Тверь, 2001; научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы современной медицины», Тверь, 2001; I Международном конгрессе «Новые медицинские технологии», Санкт-Петербург, 2001; Научной конференции «Организация и пластичность коры больших полушарий головного мозга», Москва, 2001; 5-ой, 6-ой и 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», Пущино, 2001, 2002, 2003; HUPO 2nd Annual & IUBMB XIX World Congress, Montreal, 2003.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 15 работ, 1 принята в печать (журнал «Биомедицинская химия»).
Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 276 источников, из которых 162 иностранных. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 24 рисунками.
