Введение к работе
Актуальность проблеми.
Исследование закономерностей формирования фонда нейроак-тивных аминокислот и биогенных аминов в головном мозге представляет большой научный и практический интерес и является частью одной из важных проблем современной биохимии, связанной с целенаправленной регуляцией метаболических процессов биологически активными .природными соединениями [К.С.Раевский, В.П.Георгиев, 1986? F.E.Bloom, 1984].
Известно, что алкогольная интоксикация и зависимость сопровождайся выраженными наруиениями в функционировании ряда нейротрансмиттерных систем. Существует ряд предпосылок, позволяющих предположить возможные механизмы влияния этанола на нейротрансмиттерные системы головного мозга: наруиения транспорта аминокислот в мозг, нарушения обмена триптофана при хроническом алкоголизме (дефект пирродазнсго пути), конкурентные взаимоотноиении между ацетальдегидом при алкогольной интоксикации и биогенными альдегидами в отноиеикк альдегидметабслизируи-йих ферментов; образование эндогенных алкалоидов, связмьакие биогенных альдегидов с мембранными структурами. Очевидно, нейротрансмиттерные системы при алкоголизме функционируют на ином уровне адаптации, чем з норме, и ряд сдвигов в содержании медиаторов , их предшественников и родственных соединений может иметь приспособительный характер.
Ряд исследователей считают ответственной за формирование неврологических расстройств при алкоголизме преимуцественно одну из систем - дофаминовую [И.П.Анохина, Б.М.Коган, 19S4] или серотонииозуге [YJ.O.MsBride єі al.,1389]. Кроме этого, в последние годы далзгатся попытки объяснить некоторые нарушения деятельности мозга при алкоголизме .изменением функциональных и функционально-метаболических -азайноатноиений между различными
Принятие сс::ропешш:. ГБЛ - ^-бутиролактои; гам, gaba -у-аминоыасляная кислота; ГСЙК - у-оксимасляная кислота; Агр -аспарагиновая кислота; Glu - глутзмнноная кислота; Gin - глут-смин; Gly - глицин; Таи - таурин; Туг - тирозин; Тгр - триптофан; НЕ - норадреиалнн; DA -"дофамин; 3-МТ - 3-ыетокситирамин; DOPAC - 3,4-дпоксифэкилуксуская кислота; HYA - З-метокси-4-оксифеиилуксусмая (гсмованилнновая} кислота; 5-НТ - 'еротонин; 5-Н5АА - 5-оксииндолукеусная кислота.
системами [K.Hellevao,l990, А.И.Балаклеевский и соавт. ,19881. В целом же взаимосвязи между системами биогенных моноаминов и нейротрансыиттерных аминокислот остаются невыясненными. Это не позволяет корректно объяснить механизмы действия некоторых биологически активных соединений на процессы формирования фонда неНроэхтивных аминокислот и биогенных аминов, а такие вести целенаправленный поиск новых антиалкогольных средств.
Исследование, действия этаноламина, являющегося естественным метаболитом в центральной нервной системе, при алкогольной интоксикации привело к представлению об антагонистических отношениях между этанолом и этаноламином: для этаноламина было продемонстрировано ингкбирующее действие на алкогольметаболиэи-руюїдие системы [Ю.М.Островский и соавт., 1986]; зтаноламин способен влиять на фармакокинетику этанола [l.L.Byfcov et аі., 1S89], а при синдроме отмены этанола, по полученным нами в предварительны}!, экспериментах данным, он полностью предотвращал
. развитие аудиогенно'-о судорожного синдрома.
Поскольку в патогенезе судорожного синдрома, являющегося одним из проявлений синдрома отмены этанола, существенная роль отводится нарушениям в ГАМК-ергической системе [D.B.Goldstein, 1973, F.Fadda, 1989], и были продемонстрированы эффекты модулирующего активность этой системы ди-п-пропилацетата (вальпроевой
7 кислоты) при этом патологическом состоянии [M.Hillbom, 1989], актуальным является исследование также влияния вальпроата натрия на уровни нейроактивных аминокислот и биогенных аминов.
Известно, что г-бутиролактон - структурный аналог ГАМК -способен угнетать функциональную активность дофаминаргических структур мозга [F.Fadda ot al., 1983], что позволяет предположить его модулирующее _ воздействие одновременно на несколько нейротрансмиттерных систем, функционирование которых нарушается при синдроме отмены этанола.
Комплексное изучение этих процессов и их анализ как единого информационного целого позволяет выявить наиболее существенные патогенетические моменты воздействия этанола на нейротранс-миттерные системы, а также обосновать применение при синдроме отмены этанола биологически активных веществ, выявить новые аспекты в механизмах воздействия на нейротрансмиттерныз системы известных и практически применяющихся или исследуемых в экспе-
рименте нейротропных препаратов.
Цель и задачи псслздованпя. Целью исследования было: охарактеризовать изменения а фонде нейрозктивных аминокислот, биогенных аминоа и их производных при алкогольной интоксикации и синдроме отмены этанола, а такие при действии на этом фоне некоторых перспективных для лечения алкоголизма препаратоз.
Для этого были сформулированы следующие задачи:
-разработать адекват!?ук> методическую основу, обеспечивающую одновременное и корректное определение показателей, наиболее полно характеризующих системы биогенных моноаминов и нейро-активных аминокислот;
-охарактеризовать изменения в содержании исследуемых соединений в отделах головного мозга при острой и хронической алкогольной интоксикации;
-охарактеризовать функционально-метаболические взаимосвязи между исследуемыми показателями при введении структурного аналога этилового спирта этаноламина на фоне острой алкогольной интоксикации;
-охарактеризовать формирование фонда нейроактивных аминокислот и биогенных аминов при отмене этанола после хроническсї! алкоголизации и введении на этом фоне этаноламина, а также вальпроевой кислоты и }—бутиролактона - препаратов, влияюцих одновременно на различные нейротрансмиттерные системы и перспективных в качестве антиалкогольных средств;
-исследовать возможность реализации механизма действия этаноламина на исследуемые системы через его метаболические превращения до фосфоэтаноламина и глицина - соединений, обладающих, соответственно, свойствами нейромодулятора и истинного трансмиттера;
-на основании проведенных исследований разработать подходы для целенаправленной коррекции ,нарушекий в фонде нейроактивных соединений при отмене этанола..
Научная новизна. Впервые проведена комплексная биохимическая оценка широкого круга показателей., составляющих фонд нейроактивных соединений -аминокислот, биогенных аминов и их метаболитов - как единого целого, на основании современных аналитических методов опреде ления указанных соединений и методов математического анализа.
Впервые установлено, что станояамин при острой алкогольной интоксикации способен снижать сккаптический выброс дофамина и повышать уровень медиатора в дофаминосоП система при отмене этанола.
S.-іерпь» установлен характер влиянии этаноламина на соотношение возбуждающих и тормозных медиаторов при острой алкогольной интоксикации.
Вперьые описаны но-ГАМК-ергичосхие эффекты вальпроата натрия при синдроме отмены этанола: снижение уровня возбузкдаюцего медиатора - аспартата и активация серотонинергической системы, опосредованная повышением уровней предшественников. ОСКОВІШе ПОЛОКеїПІЯі ВШЮКШЫО дял защита.
1. Разработаны методы, позволяющие одновременно и коррект
но определять б отделах голодного мозга и биологических ЖИДКО
СТЯХ уровни нэЛроактиБКШ' аминокислот і биогенных слипов, иг:
предшественников и метаболитов.
-
Острая и хроническая алкогольная интоксикация приводят к выраженному дисбалансу в фонде нейроактивных аминокислот и биогенных аминов в стриатуые, стволе мозга и гипоталамусе крыс.
-
В исследованных отделах мозга при острой алкогольной интоксикации влияние этаноламина, но но фосфоэтаноламина, на формирование фонда нейроактивных соединений включает в себя повышение уровней "тормозных" аминокислот-медиаторов и снижение интенсивности синоптического выброса дофамина.
-
Действие вальпроата натрия при отмене этанола Еключает в себя нс-ГАМК-ергические механизмы: снижение уровня аспараги-новоЯ кислоты и активирующее влияние на показателя серотонино-пой системы, опосредованное повышением уровней предаественни-коз.
Научио-практнчегсгса значение работи.
Результаты, полученные при разработке громатографических методов определения исследованных соединения, могут быть использованы в экспериментальной и клинической практике.
Обоснована с точки зрения модулирующего влияния на показатели дофаминовой системы и систем нейроактивных аминокислот целесообразность использования этаноламина при остр эй алкогольной интоксикации, а такие для купирования проявлений синдроме отмены этанола.
Обоснована рациональность совместного применения зтанол--акина и вальпроата натрия при синдроме отмены зтаислаї исходя «з их влияний на различные кеПротрансмиттерные системы.
Установлено, что острая и хроническая алкогольная интоксикация, приводящие к нерусениям функционально-метаболических рзаимосвяэей между неЯротранс.миттер.чими системами, характеризуйся различное направленностью изменения в исследуемых показателях, в частности, соотношении "возбуждающих" (аспартзт, глутамат) и "тормозных" (глицин, таурия, ГАТЛК> трансмиттеров в гипоталамусе. Б обоих случаи: действие этанола заключается в изменении уровней "возбуждающих" трансмиттеров. Метаболическая ситуация а исследованиях отделах мозга при отмене этанола отличается от таковоЯ при хронической алкогольноА интоксикации.
Показано, что этанолзмин при его введении на фоне острой алкогольной интоксикации способен снижать интенсивность синап-тического выброса дофамина в стриатуме, в то время как при* отмене этанола его действие включает в себя снижение деградации ГЛМК и повышение уроЕней дофамина и его основного метаболита -Д,4-диоксифенмлуксусноП кксаоты. Как в случае сстроП алкогольной интоксикации, так и при отмене этанола эффекты этанола мина т опосредуются его фосфорилироваиием.
Установлено, что зальпроат натрия при введении на фоне отмены этанола снижает уровень аспаргата по всех исследованных отделах мозга, а также оказывает активирующее влияние на серо-тонннергнческую систему, опосредованное повышение!.», уровней предшественников, т.е. действие вальпроата на.рия не исчерпывается известными для него ГАМК-ергическими механизмами.
Апробация работы я публикации. Результаты диссертационной работы обсуждены на: IV Конференции Итальянского Общества науки о мозге, Палермо, 1950; v Конгрессе Всемирной федерации обществ биологической психиатрии, Флоренция, 199t; IV Научном съезде специалистов по лабораторной клинической диагностике Республики Беларусь, Гродно, 1Э9Э; Симпозиуме Международного общества по биомедицинским исследованиям алкоголизма "Генетика и заболевания, связанные с алкоголем", Бордо, 19Э2; IV Конгрессе Европейского общества по биомедицинским исследованиям алкоголизма, Генуя, 1ЭЭЗ; Конференции "Новые достижения в лечгнии алкоголизма", Триест, 1ЭЭЗ; 13-Я
6 ' ч
Конференции Международной ассоциации судебной медицины, Дюссельдорф, 1993; Международной конференции, посвященной 35-летию Гродненского медицинского института, Гродно, 1393; VI Конгрессе Европейского сообщества нейрофапмакологов, Будапеит, 1993. По материалам диссертации опубликовано 12 работ. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из езедения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатоп собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 165 работ. Робота изложена на 133 страницах маиикописного текста, содержит 13 рисунков и 18 таблиц.
Экспериментальные подели. В опытах использованы белые крысы-самцы массой 140-160 г из питомника АМН СССР "Рапполово", содержавшиеся на стандартном рационе вивария.
При выборе экспериментальных моделей исходили из необходимости обеспечения минимального объема воздействий, способных индуцировать патофизиологические проявления моделируемого состояния, оказывающие влияние на определяемые показатели (например, судорожный синдром при отмена этанола) [L.CV/ard, 1987].
Остру» алкогольную интоксикацию моделировали однократным внутрибрюшинным введением 3,5 г/кг этанола на 30 мин (для этого срока ранее были продемонстрированы основные противоалкогольные эффекты этаноламииа [И.Л.Быков и соавт., 198Э]). На такой же срок вводили этаноламин в дозе 100 мг/кг [M.Krsiak et al., 1971] или фосфозтаноламин в эквимолекулярной дозе 230 мг/кг.
Хроническую алкогольную интоксикацию моделировали путем 3-х месячного потребления животными растворов этанола возрастающей концентрации (10-20 %) [L.'C.Ward, 1987] в качестве единственного источника жидкости, после чего отменяли этанол. Срок отмены этанола - 12 ч - характеризуется максимальной выраженностью её патофизиологических проявлений [E.Majchrowicz, W.A.Hunt, 1980]. Этаноламин, фосфозтаноламин, ГБЛ (250 мг/кг) [F.Fadda, 1983) и вальпроат натрия (400 мг/кг) [F.Crespi et al., 1ЭЧ6] вводили за 30 мин до декапитации; дозы этаноламина И фосфоэтг.ноламина соответствовали таковым при острой алкогольной интоксикации. В этом эксперименте для контроля неспецифических факторов (пите:і/.е, стресс) определяли, помимо основных показателей, также уровни амінокислот и метаболитов биогенных аминог
в плазме крови и надпочечниках, а такяе содержание в надпочечниках и плазме крови кортшсоетероидов.
Содержание гидрокортизона и кортикостерона определяли в хлороформных экстрактах методом обращенно-фазной ВЭЖХ с УФ-детектированием (А.М.Хозса, 1ЭЗЭ, в собственной модификации).
Математическую обработку данных (Т-статистика, корреляционный и дискриминантный анализ) проводили на ПЭВМ AT3SG/7 с помощью программ 3d и 7т*из пакета для многомерного статистического анализа BMDPC.
В работе использовали жидкостный хроматограф Waters (Minipore-Waters, США), хроматографические колонки производства МНПП "Элсико" (Россия), хроматографическн чистые стандарты аминокислот, биогенных аминов и их производных фирм Sigma, Serva, Fluka, Reanal, другие реактивы, удовлетворяющие требованиям чистоты для жидкостной хроматографии.
