Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. CLASS Обзор литератур CLASS ы
1.1. Фонд аминокислот головного мозга и его регуляция , 8
1.2. Состояние аминокислотного пула мозга при низких температурах ,..21
ГЛАВА П. Материалы и методы исследования 38
2.1. Обоснование выбора объекта исследования 38
2.2. Моделирование зимней спячки у сусликов 38
2.3. Биохимические методы исследования 40
2.3Л. Выделение фракции свободных глутаминовой, аспарагиновой и ГАМК 40
2.3.2 Выделение фракции связанных глутаминовой, аспарагиновой и ГАМК.40
2.3.3. Количественное определение свободньїх и связанных аминокислот методом электрофореза на бумаге 41
2.3.4. Количественное определение N-ацетилглутаминовой и N-ацетиласпарагиновой аминокислот 42
2.4 Статистический анализ результатов исследования 43
ГЛАВА III. Результаты и их обсуждение 44
3.1. Содержание свободных и связанных аминокислот в различных отделах мозга сусликов при зимней спячке 44
3.2. Содержание свободных и связанных аминокислот в различных отделах мозга сусликов при гипотермии 60
3.3. Соотношение свободных и связанных аминокислот в мозге сусликов при зимней спячке и гипотермии 65
3.4 Содержание ацетилированных производных аминокислот в мозге сусликов при зимней спячке 72
Заключение 77
Выводы 84
Список литературы 86
- Состояние аминокислотного пула мозга при низких температурах
- Количественное определение свободньїх и связанных аминокислот методом электрофореза на бумаге
- Содержание свободных и связанных аминокислот в различных отделах мозга сусликов при зимней спячке
- Содержание ацетилированных производных аминокислот в мозге сусликов при зимней спячке
Введение к работе
Актуальность проблемы В последние годы внимание исследователей привлекает изучение компенсаторно-приспособительных механизмов, обеспечивающих устойчивость центральной нервной системы к повреждающим воздействиям и стрессорным состояниям. В этом плане весьма перспективным является анализ феномена природной адаптации мозга гибернантов к низким температурам. Уникальные механизмы, лежащие в основе деятельности ЦНС во время зимней спячки млекопитающих при температурах, даже близких к нулю, а также при переходе к нормотермии, позволяют каждый раз полностью восстанавливать функции нейронов мозга.
Изучение механизмов естественной адаптации к низким температурам имеет большое теоретическое и практическое значение, поскольку связано с выяснением фундаментальных основ функционирования мозга и может быть применено в медицинских и биотехнологических целях (Марченко и др., 1992).
Очевидная важность проблемы гипобиоза обеспечивает постоянный интерес исследователей к центральным механизмам терморегуляции, связанных в основном с активностью двух отделов гипоталамуса: преоптической областью переднего гипоталамуса, где находятся центры регуляции теплоотдачи и терморецепции, а также заднего гипоталамуса, где находятся центры регуляции продукции тепла (Проссер, 1977).
Не меньший интерес представляют собой исследования еще одной древней структуры мозга- мозжечка, который также является важным звеном поддержания устойчивости мозга при гибернации, поскольку участвует в постоянном поддержании необходимой в данный момент позы животного, для оптимальной теплоотдачи (Калабухов, 1985).
Удивительная приспособленность гетеротермов к перенесению низких температур в естественных условиях зимней спячки ставит еще одну интересную задачу перед исследователями — выяснить как может реагировать мозг ги-
бернантов на охлаждение вне сезона спячки, то есть на принудительную гипотермию.
Учитывая решающую роль ЦНС в механизмах переносимости гипотермии, весьма детально исследуются различные функциональные и метаболические особенности мозга и его отделов (Палладии и др. , 1972; Майстрах, 1975; Крепе и др., 1981; Тимофеев, 1983; Эмирбеков, Львова, 1985; Бабийчук, Шиф-ман, 1989).
Центральным звеном влияния гипотермии на теплокровный организм, являются белки, мембраны, нейроактивные компоненты. В ответ на снижение температуры тела гомойотермного животного в мозгу развивается сложная метаболическая реакция, которая отражает патологическое влияние гипотермии, а также регуляторную компенсаторную функцию. В механизмах приспособления, адаптации к экстремальным факторам ведущее место занимает посттрансляционная модификация белков нервных клеток. Обладая полифункциональ-ними свойствами ряд аминокислот (Basic Neurochemistry, 1999), такие как ди-карбоновые, активно участвует в процессах контролирующих функции нервных клеток: кроме выполнения индивидуальной функции, могут играть нейро-медиаторную и модуляторную роль. Именно эти, так называемые аминокислоты глутаминовой группы преимущественно находятся в нервных тканях в больших количествах и в связанной (ассоциированной с белками и нейрональ-ными структурами) форме (Кричевская, 1983).
В последнее время возобновился интерес к связанным формам аминокислот, обнаруженным Эллиотом (Elliott et al., 1965). Открыты и активно изучаются связанные формы всех аминокислот мозга, их N-ацетшгароизводных, некоторых нейропептидов. Выяснено, что роль связанных аминокислот заключается не только в их нейромедиаторных функциях, но и в модификации белков, а также регуляции метаболических процессов, обеспечивающих адаптацию мозга (Пашаева, 2001).
Цель и задачи исследования В связи с вышеизложенным, целью нашей работы явилось изучение реакции аминокислотного пула отделов головного
б мозга (коры больших полушарий, стволовой части, мозжечка и гипоталамуса) типичного гибернанта- суслика малого на состояние зимней спячки и принудительной гипотермии.
Для достижения этой цели были поставлены задачи:
Изучить содержание свободных и связанных глутаминовой, аспараги-новой и у-аминомасляной кислот в коре больших полушарий и стволовой части мозга сусликов на разных стадиях баута.
Изучить содержание свободных и связанных глутаминовой, аспараги-новой и у-аминомасляной кислот в мозжечке и гипоталамусе сусликов на разных сроках гибернации.
Определить содержание вышеперечисленных аминокислот в мозжечке и гипоталамусе сусликов при гипотермии 20 и 10 С0.
Определить содержание N-ацетилйрованных производных аминокислот в мозге при состоянии зимней спячки.
Выяснить характер изменения соотношения свободных и связанных форм аминокислот при всех изученных состояниях и его роль в адаптации мозга к низким температурам.
Научная новизна Несмотря на большое количество работ по изучению состояния аминокислотного пула при гибернации и гипотермии, мало внимания было уделено изучению связанных форм аминокислот мозга за исключением нескольких работ (Пашаева, 2001; Эмирбекова, Шейхова, 2001), которые были посвящены в основном изучению коры больших полушарий мозга и других отделов (средний, промежуточный мозг).
Основные положения, выносимые на защиту.
Мозг гетеротермов содержит значительные резервы связанных форм нейроактивных аминокислот.
Связывание аминокислот в состоянии зимней спячки и гипотермии является неспецифическим процессом, отражающим изменения макромолекул и мембранных структур, направленным на поддержание функций мозга.
3. Процессы связывания аминокислот имеют температурную регуляцию и сходный характер, как при гибернации, так и при принудительной гипотермии, что свидетельствует об их адаптивной роли.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные представляют интерес для понимания механизмов устойчивости мозга гетеротермов к низким температурам как в условиях естественного гипобиоза, так и при искусственной гипотермии. Практическая значимость данной работы определяется возможностью использования данных о содержании свободных и связанных аминокислот, а также их N-ацетилированных производных для прогноза по-стгипотермических последствий в условиях моделирования гипобиотических состояний в медицинских и биотехнологических целях.
Материалы, полученные при выполнении данной диссертации, используются в учебном процессе кафедры биохимии Дагестанского госуниверситета и Махачкалинского филиала Ростовского госуниверситета, при чтении ряда спецкурсов и проведении больших практикумов.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на XXXVIII научной международной конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2000 г.); 5-ой Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2001 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Химия в технологии и медицине» (Махачкала, 2001), на совместном заседании кафедры биохимии и биофизики ДГУ (Махачкала, 2004).
Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 6 работ.
Состояние аминокислотного пула мозга при низких температурах
Важнейшей проблемой является исследование сложной динамики аминокислот- неиромедиаторов, причем неодинаковой в разных отделах головного мозга перед впадением животного в зимнюю спячку, в процессе ее развития, в период пробуждения, а также процессы регуляции гибернации посредством аминокислот. (Демин, Шортанова, Эмирбеков, 1988).
Изучение адаптационных приспособлений зимоспящих животных представляет огромный интерес, поскольку пока не существует достаточно физиологического способа получения состояния искусственного гипобиоза у обычных теплокровных и, возможно, раскрытие адаптационных механизмов зимоспящих будет способствовать разрешению этой проблемы. В последние годы наметился определенный прогресс в этом направлении. Так, для пролонгирования состояния искусственного гипобиоза используют биологически активные вещества, выделенные из тканей гибернирующих животных (Сухова и др., 1990). Такие приобретенные свойства организма в условиях искусственного охлаждения, как повышенная устойчивость тканей к недостатку кислорода, существенное понижение метаболизма и сердечно-сосудистой деятельности, пролонгирование наступления субстратного истощения, позволили ученым многих стран широко применять в клинике гипотермию для лечения острых отравлений, а также тяжелых мозговых осложнений, связанных с гипоксией, выраженной сердечной слабостью у оперированных по поводу врожденных и приобретенных пороков сердца и других состояний, сопровождающихся отеком мозга, гипертермией, нарушением метаболизма, гемодинамики (Бонитенко, 1982; Миротворчий, Кирсанова, 1983).
При потере тепла нормальный температурный баланс в организме поддерживается за счет функционирования гипоталамического терморегуляторного механизма. При изменении температуры окружающей среды у гомойотерм-ных животных развиваются как специфические терморегуляторные изменения, направленные на сохранение температурного гомеостаза, так и неспецифические стрессорные изменения, обусловленные действием холода как чрезвычайного раздражителя (Майстрах, 1975). Прямые доказательства нарушения функции головного мозга получены в исследованиях его электрической активности при охлаждении ненаркотизированных животных (Лабахуа, 1974; Майстрах, 1975; Сааков, 1957). У млекопитающих головной мозг наиболее чувствителен к снижению температуры тела и нормально функционирует в более узком диапазоне температур, чем другие ткани (Проссер, 1977). Выраженное расстройство поведения и другие неврологические нарушения при охлаждении гомойотермного животного в своей основе имеют метаболические сдвиги в соответствующих отделах головного мозга. У гетеротермов же температурный диапазон сохранения жизнедеятельности и определенной активности биохимических процессов гораздо шире и даже при температуре тела 3-Ю С во время зимней спячки, когда интенсивность метаболизма снижается в 20 и более раз, ЦНС у гетеротермов сохраняет активность.
Известно, что даже при глубокой гипотермии (ректальная температура 20 -17С) головной мозг животных не испытывает недостатка в энергетическом субстрате, кислород находится в избытке и резкое уменьшение его потребления связано не с уменьшением доставки, а понижением потребности мозга в энергии (Иванов, 1972).
В условиях гипотермии около 75% энергетических потребностей обеспечивается окислением жирных кислот и примерно 10% -окислением глюкозы (Minaire et al., 1973). Высокие концентрации жирных кислот блокируют фосфо-рилирование глюкозы и ннгибируют последующий гликолиз, поэтому глюкоза периферическими органами и тканями утилизируется мало.
При умеренной гипотермии (30 С) в мозгу крыс возрастает интенсивность гликолиза, о чем свидетельствуют снижение концентрации ЛТФ (на 21%) и креатинфосфата (на 39%) и уменьшение количества гликогена и глюкозы, сопровождающееся значительным увеличением содержания молочной кислоты (Атабегова, Мишина, 1969). Напротив, содержание глюкозы, креатин фосфата, АТФ в головном мозгу крыс, гипотермированных до 28-30 С, повышается после 3-х часового пролонгирования (Эмирбеков и др., 1976). При глубокой гипотермии (20- 19С) интенсивность анаэробного и аэробного гликолиза в мозгу крыс снижается, а уровень глюкозы, молочной кислоты и макро-эргических фосфатов увеличивается (Векслер, Атабегова, 1975; Львова, 1971; Эмирбеков и др., 1976). Изменение в содержании компонентов энергетического обмена в мозгу крыс при гипотермии, по-видимому, определяется активностью окислительных ферментов (Волжина, 1982), АТФ-азы (Амирсаидов, Атабегова, 1972; Эмирбеков и др., 1976), а также степенью сопряженности фюсфорилиро-вания с дыханием (Львова, 1973).
Глубокая гипотермия (20-19 С) сопровождается равномерным снижением количества амидных групп обеих фракций белков мозга (Абашилова, 1978; Му-саев, 1972), что увеличивает атакуемость белков протеолитическими ферментами (Лукаш, Пушкина, 1979) и, следовательно, уменьшает время полужизни белков (Robinson, 1974). Действительно, активность кислых пептидгидролаз в мозгу при гипотермии значительно повышается (Эмирбеков, Нурмагомедова, 1979), что влечет за собой снижение содержания белка (Эмирбеков и др., 1993).
При искусственной и естественной (зимняя спячка) адаптации к низкой температуре тела подобная картина не наблюдается, поэтому можно думать, что в этих условиях в основе температурной модификации большинства белков лежит не процесс изменения гибкости и подвижности, а влияния модуляторов.
Имеются данные о влиянии таких модуляторов, являющихся естественными метаболитами мозга, как гомокарнозин, путресцин, мочевина, аргинин, спермин. Оказалось, что при их предварительном введении животным гипотермия вызывает такие изменения в динамике метаболизма белков, ферментов, амидных групп белков, интенсивности ПОЛ, которые характерны для природной адаптации к холоду - зимней спячке. В опытах in vitro обнаружено модулирующее влияние этих нейроактивных веществ на биохимические процессы в мозге при гипотермии (Мтоидж, 1990). Также показано, что при зимней спячке и вызванной адаптации к холоду изменение содержания описанных низкомолекулярных нейроактивных веществ является неотъемлемой частью реакции организма на гипотермию.
При гипотермии происходит снижение синтеза белка. Интенсивность обмена белков мозга при гипотермии теплокровного организма снижается прямо пропорционально снижению температуры тела (Lajtha, Sershen, 1975): снижениє температуры тела на 10 С сопровождается снижением скорости обновления белков мозга крыс приблизительно на 62%.
Как следствие изменения скорости биосинтеза белков и активности про-теолитических ферментов при низких температурах тела обнаружено изменение аминокислотного состава суммарных белков мозга (Эмирбеков, Абдуллаев, 1978). При гипотермии крыс белки мозга переходят из одной фракции в другую вследствие изменения физико-химических свойств. Снижение интенсивности включения аминокислот в белки мозга при гипотермии, по-видимому, обусловлено изменением структуры и функции полирибосом (Gainulin, Naranesik, 1978), а также структуры белков-ферментов, катализирующих процессы синтеза белковых молекул (Коникова и др., 1969). Следствием глубоких изменений свойств белков-ферментов при гипотермии являются сдвиги в уровне многих низкомолекулярных азотсодержащих соединений, в том числе моноаминов и аминокислот, нарушения метаболизма которых в мозге при гипотермии неизбежно приводят к расстройствам функций ЦНС, поскольку именно эти соединения помимо нейромедиаторных функций принимают активное участие о процессах терморегуляции.
Количественное определение свободньїх и связанных аминокислот методом электрофореза на бумаге
Количество свободных и связанных аминокислот определяли по методу Эллиота и сотр. (Бунятян, Казарян, 1967) с некоторыми изменениями, внесенными нами.
Навеску отделов мозга переносили в стеклянные гомогенизаторы с 3 мл холодной физиологической средщ Рингера (в модификации Кребса) для млекопитающих (рН 7,4) (Досон, Эллиот и др., 1991). Ткань измельчали на гомогенизаторе типа Потерра с тефлоновым пестиком в течение 1 мин. в погруженном в лед гомогенизаторе. Гомогенат центрифугировали при 15000 об/мин в охлажденной центрифуге в течение 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую свободные аминокислоты, переносили в пробирки с 3-кратным объемом 96 этанола. Осадок промывали в 1мл среды Рингера, повторно центрифугировали и супернатант добавляли к первой порции. После часового стояния спиртовой раствор центрифугировали, надосадочную жидкость выпаривали в плоскодонных стеклянных пробирках в сушильном шкафу. Сухой остаток аминокислот использовали для количественного определения с помощью электрофореза на бумаге.
К осадку, полученному после центрифугирования добавляли среду Рин-гера в первоначальном объеме, размешивали стеклянной палочкой и полученную суспензию нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 мин, затем охлаждали, центрифугировали. Полученный супернатант переносили в пробирки с 3-кратным объемом этанола и далее обрабатывали так же, как описано в 2.3.1.
Сухой остаток свободных и связанных аминокислот растворяли в 0,2 мл бидистиллированной воды. Из этого раствора брали по 0,02 мл и наносили на бумажные полоски хроматографической бумаги марки «быстрая» размером 2,5 X 26 см. Разделение аминокислот проводили в пиридин-ацетатном буфере (рН 4,0) (8 мл пиридина, 30 мл ледяной уксусной кислоты, 962 мл дистиллированной воды).
Электрофорез проводили в камерах ЭФА-1 при напряжении 600 В и силе тока 2 мампер/см ширины бумаги в течение 3 часов.
По окончании электрофореза полоски бумаги просушивали в токе теплого воздуха, затем проявляли 0,5 % раствором нингидрина в ацетоне. Проявленные электрофореграммы сушили и помещали на 20 мин в термостат при 70-80С для четкого выявления пятен.
Окрашенные пятна аминокислот вырезали и элюировали в 5 мл 0,005% раствора сернокислой меди в 75% этаноле. Через 1 час стояния в темноте измеряли оптическую плотность элюатов при длине волны 530 нм на спектрофотометре СФ-46.
Содержание аминокислот устанавливали по калибровочным кривым (рис. 1), построенным для каждой изучаемой аминокислоты, учитывали разбавления.
Из надосадочной жидкости, полученной для определения свободных аминокислот (см. 2.3.1.), отбиралась половина объема в пробирку с 6Н НС1 в соотношении 2:1. В течение 30 мин проводился гидролиз в кипящей водяной бане в пробирках с обратным холодильником. При этом N- ацетилпроизводные аминокислот гидролизуются с образованием эквивалентного количества соответствующих аминокислот.
Полученные гидролизаты выпаривали без предварительной нейтрализации щелочью. Полученный осадок растворяли в 0,2 мл бидистиллята и использовали для количественного определения методом электрофореза (см. 2.3.3.).
О количестве N-ацетилированных аминокислот судили по разнице в содержании глутаминовой и аспарагиновой кислот до и после гидролиза (см. 2.3.1.). 2,4. Статистический анализ результатов исследования
Полученные экспериментальные данные были обработаны по методу малой выборки (Лакин, 1990) с использованием компьютерной программы Statisica 5.0. Достаточным считали уровень достоверности при р 0,05. Соотношение свободных и связанных аминокислот определяли делением содержания свободных форм соответствующих аминокислот на содержание связанных.
Содержание свободных и связанных аминокислот в различных отделах мозга сусликов при зимней спячке
Несмотря на многочисленные работы в области изучения аминокислотного обмена, в том числе и при зимней спячке, в научной литературе существуют расхождения и противоречивые сообщения разных исследователей метаболизма низкомолекулярных азотистых веществ в мозгу (Демин и др., 1988), что связывается со сложностью самого состояния гибернации, неодинаковыми методическими подходами и т.д. В связи с открытием феномена связанных аминокислот (Elliot et al., 1965) и их изучением при разных функциональных состояниях, можно предположить, что объяснение наблюдаемых различий должно учитывать наличие феномена связанных аминокислот.
Как показывают исследования, связанные формы свойственны почти всем аминокислотам, встречающимся в мозгу в свободном состоянии (Бунятян, Казарян, 1967). В связи с этим изучение количества свободных и связанных форм аминокислот в целом мозгу и в его отделах при разных функциональных состояниях является актуальной проблемой.
Нами исследовано содержание свободных и связанных глутамата, аспар-тата и ГАМК в коре больших полушарий, стволовой части головного мозга мозжечке и гипоталамусе суслика малого в различные периоды зимней спячки. Интерес к этой проблеме вызван тем, что сдвиги в содержании нейромедиатор-ных аминокислот глутаминовой группы при зимней спячке не всегда адекватны активности ферментов участвующих в их метаболизме. По-видимому, изменение содержания аминокислот может быть вызвано не только изменением скорости их транспорта и направления метаболизма, но и действием на взаимоотношения связанной и свободной формы аминокислот.
Полученные данные свидетельствуют о наличии в головном мозгу гете-ротермов значительного пула связанных дикарбоновых аминокислот и ГАМК, который, по-видимому, играет важную роль в функционировании мозга при зимней спячке.
Контрольные значения содержания обеих форм аминокислот в больших полушариях и стволовой части мозга сусликов свидетельствуют (табл. 1,2), что связанные аминокислоты составляют до половины содержания свободных аминокислот, а в некоторых случаях и превышают содержание последних (например, ГАМК). Таким образом, в мозге гетеротермов, в отличие от мозга строгих гомойотермов- крыс (Пашаева и др., 1996) процессы связывания аминокислот идут более интенсивно.
Установлено, что содержание свободных и связанных аминокислот в коре больших полушарий мозга сусликов подвергается значительным изменениям в разные периоды гибернации (табл. 1, рис2).
Так, в начале баута (t тела 18-20С) содержание свободной формы глу-таминовой кислоты снижается на 19% по сравнению с контролем, в то время как количество связанного глутамата достоверно не увеличивается. Сходным образом изменяется и содержание обеих форм аспарагиновой кислоты, при этом содержание свободного аспартата снижается на 14%, а связанного увеличивается на 44%. Содержание свободной ГАМК, наоборот увеличивается на 11%, в то время как содержание связанной формы этой аминокислоты остается неизменным.
В середине баута, когда температура тела сусликов достигает минимальных значений содержание свободных глутамата и аспартата снижается соответственно на 26 и 55% по сравнению с контролем. Содержание связанного глутамата снижается на 19%, а содержание связанной аспарагиновой кислоты возвращается к норме. При этом наблюдается дальнейший рост содержания свободной ГАМК на 66% на фоне незначительного (11%) уменьшения содержания связанной формы.
Выход из баута сопровождается некоторым повышением свободной глу-таминовой кислоты, хотя ее содержание остается ниже на 12% по сравнению с контролем и снижением связанной формы глутаминовой кислоты на 39%. На блюдается снижение уровня свободного аспартата на 45% и повышенное, хотя и не так сильно, как в середине баута содержание свободной ГАМК (табл. 1).
Динамика содержания исследованных аминокислот в целом согласуется с данными других авторов (Демин и др., 1988, Пашаева, 2001). Вместе с тем в количественном отношении, содержание этих аминокислот имеет разную амплитуду. Так, например, содержание свободного аспартата подвержено значительно большему снижению в течение баута, чем содержание глутаминовой кислоты. Особо следует отметить, что содержание свободного аспартата остается низким и при выходе из баута. Снижение содержания свободного аспартата возможно связано с использованием его как эффективного субстрата окисления в мозге, на что указывают и другие авторы (Розанов и др., 1990).
Содержание ацетилированных производных аминокислот в мозге сусликов при зимней спячке
Несмотря на многочисленные работы в области изучения аминокислотного обмена, в том числе и при зимней спячке, в научной литературе имеется мало работ по исследованию содержания N-ацетилированных аминокислот при зимней спячке.
Результаты исследования показывают, что содержание N-AA в коре больших полушарий мозга бодрствующих сусликов превышает содержание свободной аспарагиновой кислоты, а содержание N-АГК меньше, чем глутама-та в сравнении с литературными и нашими данными (табл.7, табл. 1). Эти данные подтверждаются и другими авторами (Baslow, 2000).
В состоянии вхождения в баут наблюдается снижение содержания N-AA на 24%, которое продолжается и в середине баута (- 27%), а при пробуждении сусликов приходит в норму (рис.13).
Содержание N-АПС, напротив растет на 5% в начале спячки, на 24% в середине баута и при выходе из баута остается немного выше контрольных значений на 2%, изменяясь в противоположном направлении.
Стволовая часть мозга характеризуется меньшей концентрацией N-AA. В этом отделе наблюдается тенденция к снижению содержания исследуемой аминокислоты в начале и середине баута, а при выходе происходит его достоверное повышение на 12%. Содержание N-АГК в стволе мозга более высокое и изменяется сходным с большими полушариями образом. Так, в начале баута рост составил 3%, в середине баута уже 30%, а при выходе из сна содержание N-АГК остается на 14 % выше контроля (рис 13).
Обнаруженные нами изменения в содержании N-AA в среднем + промежуточном отделах мозга, интересно сопоставить с данными о роли эпифизарно-го гормона мелатонина в формировании баутов и всего цикла спячки. Метаболизм мелатонина подвергается обратной отрицательной регуляции под действием света, таким образом регулируя суточные ритмы обычного сна. Вместе с тем и при зимней спячке обнаружено, что при пробуждении после баута количество мелатонина резко повышается, а в середине баутов, наоборот остается пониженным (Демин и др, 1988). Эти данные согласуются с полученными нами, так как лимитирующей стадией синтеза.мелатонина является реакция, катализируемая серотонин-Ы-ацетилазой, а сам мелатонин является N-ацетилпроизводным серотонина (Ашмарин и др., 1996). Поскольку одной из функций N-AA является поставка ацетильных групп в реакциях ацетилирова-ния (Кричевская и др., 1983), то можно предположить связь между содержанием N-AA в отделах, тесно связанных с эпифизом, и мелатонином в динамике баута. Так, в начале и середине баута содержание N-AA не изменяется, а при выходе из баута повышается (рис. 13), что коррелирует с высоким содержанием мелатонина в промежутках между баутами. Известно, что до 70% времени периодического пробуждения от спячки суслик проводит в состоянии, подобном обычному суточному сну млекопитающих (Мейланов, 2001), который регулируется мелатонином. Очевидно, рост содержания мелатонина при пробуждении обеспечивается повышенным содержанием N-AA. Поскольку мелатонин действует на структуры, связанные с промежуточным и средним мозгом, то в больших полушариях не наблюдается аналогичной картины, а напротив, происходит снижение содержания N-AA вначале и середине баута, прекращающееся при пробуждении.
Еще одной причиной изменений в содержании N-AA в обоих отделах мозга может быть перераспределение ионных градиентов, имеющее у зимос-пящих животных адаптивный характер и приводящее к разным изменениям морфологии нейронов, имеющих функциональное значение (Демин и др., 1988). Известно, что N-AA является важным источником анионов в клетках мозга (Проссер, Браун, 1977; Baslow, 2000). ,
В целом полученные данные нельзя интерпретировать однозначно, поскольку функции ацетилпроизводных аминокислот как уже отмечалось весьма многообразны, поэтому сдвиги в содержании этих кислот отражают лишь их суммарные изменения, разнонаправленные в различных компартментах мозга.
Так, известно, что для ацетилированных аминокислот существует цикл перераспределения их между нейронами, дендроцитами и астроглиеи, и цикл этот имеет триггерный характер (Baslow, 2000).
Можно выделить некоторые основные моменты. Концентрация N- ацетилированных аминокислот при выходе из баута стремится к контрольным значениям (а в стволе и превышает ее). Содержание исследованных аминокислот у сусликов при зимней спячке не подвергается значительным колебаниям, в отличие от искусственных состояний понижения температуры тела, например у крыс при гипотермии (Шейхова, 1998). Исходя из этого, можно сделать вывод о важности этих нейроспецифичных производных аминокислот для мозга, в том числе и при функционировании в условиях зимней спячки.
Учитывая, что ацетилированные аминокислоты играют важную роль во множестве метаболических процессов, это факт можно расценивать как повышение уровня общего метаболизма при выходе из спячки, что отмечается и другими авторами (Эмирбеков, Львова, 1985). Изменение содержания ацетилированных аминокислот отражает разнонаправленные изменения азотистого метаболизма мозга при гибернации. Так, например, установлено, что N-AA участвует в регуляции обмена глутамина и глутамата через активирование глутаминазы, а N-АГК является положительным модулятором карбамилфосфатсинтетазы (Кричевская и др., 1983). Таким образом, можно говорить об адаптивном характере наблюдаемых в головном мозге сусликов изменений в содержании ацетилпроизводных дикарбоновых аминокислот при зимней спячке.
