Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Метаболическая реакция тканей теплокровных животных на сни
жение температуры тела и её химическая коррекция 14
1.2. Мембранные механизмы адаптации при зимней спячке 27
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
-
Обоснование выбора объекта исследования 42
-
Постановка эксперимента 43
-
Искусственное снижение температуры тела млекопитающих 43
-
Условия гибернации..... 45
-
Методы инъекции животным 47
2.3. Методы исследования 48
2.3.1. Препаративные методы исследования 48
-
Приготовление гомогенатов мозга 48
-
Выделение из коры головного мозга синаптосом и их плазматических мембран 48
-
Получение плазмы, сыворотки крови, гемолизатов и эритроцитов.. 49
-
Выделение мембран эритроцитов 49
-
Определение величины гематокрита и подсчёт эритроцитов 50
2.3.2. Биохимические методы исследования 50
-
Определение активности Na, К-АТФазы 50
-
Определение активности ацетилхолинэстеразы 51
-
Определение содержания малонового диальдегида 52
-
Определение интенсивности перекисного окисления липидов 52
-
Определение содержания первичных продуктов ПОЛ 53
-
Определение окислительной модификации белков 54
-
Количественное определение SH-групп в белках и низкомолекулярных тиолах 55
-
Определение содержания дисульфидных связей в белках и низко-
молекулярных тиоловых соединениях 56
2.3.2.9. Определение антиокислительной активности гидрофильных
компонентов 57
-
Определение общей антиокислительной активности 58
-
Определение активности супероксиддисмутазы 59
-
Определение активности каталазы 60
-
Исследование кинетики кислотного гемолиза 60
-
Определение перекисной резистентности эритроцитов 61
-
Анализ интенсивности внутрисосудистого гемолиза 61
-
Определение содержания холестерина, триглицеридов, белка, аль-
бумина, мочевины, кальция и железа 62
2.3.2.17. Количественное определение неэстерифицированных жирных
кислот 62
-
Определение содержания среднемолекулярных пептидов 63
-
Определение содержания ионов натрия и калия в плазме крови и
эритроцитах 64
2.3.3. Биофизические методы исследования 64
2.3.3 Л. Определение поверхностного заряда мембран эритроцитов 64
2.3.3.2. Определение структурных параметров мембран эритроцитов 64
2.4. Статистический анализ данных 65
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Метаболические изменения в крови и головном мозге сусликов
при зимней спячке и искусственной гипотермии 66
3.1.1. Влияние зимней спячки и искусственной гипотермии на процес
сы перекисного окисления липидов и активность компонентов
антиоксидантной защиты крови и коры головного мозга сусли
ков 66
-
Интенсивность перекисного окисления липидов и активность компонентов антиоксидантной защиты крови сусликов в динамике гибернации и искусственной гипотермии 66
-
Интенсивность перекисного окисления липидов коры головного мозга сусликов в динамике гибернации и искусственной гипо-
4
термин 72
-
Интенсивность окислительной модификации белков и содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови сусликов в динамике зимней спячки 81
-
Интенсивность кислотного и внутрисосудистого гемолиза эритроцитов сусликов в динамике зимней спячки и при искусственной гипотермии 88
-
Тиол-дисульфидная редокс-система мембран эритроцитов и синапто-сом сусликов при зимней спячке и искусственной гипотермии 95
-
Содержание сульфгидрильных групп и дисульфидных связей в белках мембран эритроцитов сусликов при зимней спячке и гипотермии.. 95
-
Содержание сульфгидрильных групп и дисульфидных связей в белках мембран синаптосом коры головного мозга сусликов при зимней спячке и гипотермии 97
3.1.5. Влияние зимней спячки и искусственной гипотермии на ацетилхоли-
нэстеразу мембран эритроцитов и синаптосом коры головного мозга
сусликов 99
-
Температурная зависимость активности ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов в динамике зимней спячки 99
-
Температурная зависимость активности ацетилхолинэстеразы синап-тических мембран коры головного мозга сусликов в динамике зимней спячки и искусственной гипотермии 108
3.2. Метаболические изменения в крови и коре головного мозга крыс при
гипотермии и введении даларгина 116
3.2.1 Содержание белковых и липидных компонентов в сыворотке крови
при гипотермии и введении даларгина 116
3.2.2. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов крови и
коры головного мозга при гипотермии и введении даларгина 121
3.2.2.1. Влияние гипотермии и введения даларгина на интенсивность процес
сов перекисного окисления липидов и активность компонентов анти-
оксидантной защиты крови 121
5
3.2.2.2. Влияние гипотермии и введения даларгина на интенсивность процес
сов перекисного окисления липидов и активность компонентов анти-
оксидантной защиты коры головного мозга 135
-
Влияние гипотермии и даларгина на интенсивность окислительной модификации белков и содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови крыс 143
-
Динамика кислотного и внутрисосудистого гемолиза эритроцитов крыс при гипотермии и введении даларгина 149
-
Тиол-дисульфидная редокс-система мембран эритроцитов и синапто-сом головного мозга крыс при гипотермии 157
-
Содержание сульфгидрильных групп и дисульфидных связей в белках мембран эритроцитов крыс при гипотермии 157
-
Содержание сульфгидрильных групп и дисульфидных связей в белках мембран синаптосом коры головного мозга крыс при гипотермии 159
3.2.6. Влияние гипотермии на Na, К-АТФазу мембран эритроцитов и синап
тосом головного мозга крыс 162
-
Влияние гипотермии HaNa, К-АТФазу мембран эритроцитов крыс 162
-
Влияние гипотермии HaNa, К-АТФазу мембран синаптосом коры головного мозга крыс 170
3.2.7. Влияние гипотермии на ацетилхолинэстеразу мембран эритроцитов и
синаптосом коры головного мозга крыс 177
-
Температурная зависимость активности ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов крыс при гипотермии 177
-
Температурная зависимость активности ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом коры головного мозга крыс при гипотермии 181
3.2.8. Влияние гипотермии и введения даларгина на поверхностный заряд и
структурно-динамические характеристики мембран эритроцитов
крыс 185
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 191
ВЫВОДЫ 213
ЛИТЕРАТУРА 215
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ АОА - антиокислительная активность АНС -1- анилинонафталин-8-сульфонат АТФ - аденозинтрифосфат АТХ - ацетилтиохолин АФК - активные формы кислорода АХЭ - ацетилхолинэстераза 2,4-ДНФГ - 2,4-динитрофенилгидразин Кт - константа Михаэлиса
ЛПОНП — липопротеины очень низкой плотности ЛПНП - липопротеины низкой плотности ЛПВП - липопротеины высокой плотности МАО - моноаминоксидаза МДА - малоновый диальдегид
НАДН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный НАДФН — никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный НЭЖК - неэстерифицированные жирные кислоты ПОЛ - перекисное окисление липидов Рн - неорганический фосфат СМП - среднемолекулярные пептиды СОД - супероксиддисмутаза ТБК - тиобарбитуровая кислота ТХ - тиохолин
ТХУ - трихлоруксусная кислота ЦНС - центральная нервная система ЭДТА - этилендиаминтетрацетат ЭПР - электронный парамагнитный резонанс ЯМР - ядерный магнитный резонанс Vm - максимальная скорость
Введение к работе
Актуальность проблемы. Выяснение молекулярных механизмов температурных адаптации у млекопитающих является одной из актуальных проблем современной экологической биохимии и физиологии. Температура - один из важнейших экологических факторов, определяющих скорость химических, физических и биологических процессов. От температуры зависит также стабильность биологических структур и, прежде всего, стабильность молекулярных структур. Уже поэтому изменение температуры окружающей среды требует выработки адаптивных механизмов в живых организмах. Температурные адаптации характеризуются значительным разнообразием в соответствии с теми реальными ситуациями, с которыми сталкиваются живые организмы в природе. С современной точки зрения существуют две качественно различающиеся стратегии адаптации - резистентная и толерантная (Кулинский, Ольховский, 1992; Hochachka, Somero, 2002).
Зимняя спячка млекопитающих является ярким примером толерантной стратегии адаптации, которая сопровождается значительными изменениями физиологического состояния организма. Температура тела, уровень метаболизма, сердечный ритм и другие параметры падают во время оцепенения до уровня, который может быть летальным для строгого гомойотерма (Калабухов, 1985; Carey et al., 2003; Geiser, 2004). При этом биохимические процессы, работа органов и систем организма гибернаторов перестраиваются так, что даже при очень низкой температуре тела поддерживается определенный гомеостаз (Wang, Lee, 1996; Carey et al., 2003; Storey, Storey, 2004).
Считалось, что у гетеротермов адаптация к низким температурам на уровне мембран достигается за счет повышения доли ненасыщенных жирных кислот в липидах. Однако детальные исследования, выполненные с использованием биохимических и биофизических методов, не обнаружили существенного повышения уровня ненасыщенных липидов и снижения вязкости мембран при гибернации (АІоіа, 1986; Montaudon et al., 1984, 1986; Репин, Репина, 1990). В настоящее время во многом неясно, каким образом модифицируется структу-
8 pa и функции мембран, обеспечивая их адекватное функционирование, как при низких, так и при высоких температурах тела, какие молекулярные механизмы лежат в основе низкотемпературной адаптации клеток и органов гибернаторов.
Примером стратегии резистентности является реакция гомойотермов на острое охлаждение. Эту стратегию гомойотермы используют и на начальных этапах гипотермии, однако, длительное и жесткое холодовое воздействие приводит к истощению энергетических резервов организма, дальнейшему падению температуры тела, развитию дискоординации метаболических процессов (Покровский и др., 1984; Эмирбеков, Львова, 1985; Тимофеев, Прокопьева, 1997). Глубокая гипотермия является опасным для жизни гомойотермного организма состоянием; пролонгирование глубокой гипотермии увеличивает риск летального исхода. Механизмы, ведущие к летальному исходу при глубокой гипотермии, многообразны и до сих пор не вполне ясны. Ряд данных указывает на возможную роль свободнорадикальных процессов в развитии патологии при гипотермии (Шепелев, Юфит, 1974; Львова и др., 1993, 2002; Erecinska et al., 2003). Однако в настоящее время не установлены механизмы активации свободнорадикальных процессов в тканях при низких температурах тела, пусковые и доминирующие факторы этих процессов, а также их роль в изменении структурно-функциональных характеристик мембран клеток различных тканей, знание которых позволит выработать стратегию защиты тканей от активных метаболитов кислорода.
Гипотермия находит широкое применение в различных областях клинической медицины (Мешалкин, Верещагин, 1985; Kataoka, Yanase, 1998). В связи с этим практическое значение имеет поиск веществ, защищающих организм от этого патологического воздействия. В нашей лаборатории в качестве протекторных веществ при гипотермии использовались мочевина, аргинин, полиамины, а-токоферол (Эмирбеков, Львова, 1985; Эмирбеков и др., 1991). Важную роль в сдерживании стресс-индуцированных свободнорадикальных процессов играют эндогенные регуляторные пептиды и их синтетические аналоги, в частности, опиоидный гексапептид даларгин (Лишманов, Маслов, 1994). По дан-
9 ным научной литературы, даларгин применялся для коррекции некоторых патологических состояний (Слепушкин и др., 1988; Лишманов и др., 1997). В нашей работе с помощью даларгина корректировали состояние гипотермии у крыс.
Фундаментальные различия между гомойо- и гетеротермными животными связывают с особенностями их плазматических мембран (Кребс, 1981; Wang, Lee, 1996; Azzam et al., 2000). В связи с этим сравнительное исследование влияния низкой температуры тела на интенсивность свободнорадикальных процессов и их роли в изменении структурно-функциональных свойств клеточных мембран у гомойо- и гетеротермных животных, очевидно, позволит раскрыть механизмы функциональных мембранных перестроек, позволяющих обеспечить холодовую терморезистентность или толерантность.
Целью настоящей работы явилось установление биохимических механизмов влияния на клеточные мембраны гомойо- и гетеротермных животных гипотермии в условиях коррекции её даларгином.
Задачи исследования:
Изучить влияние зимней спячки и гипотермии на уровень свободнорадикальных процессов и активность антиоксидантной системы крови и нервной ткани.
Исследовать влияние гипотермии на структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов.
Исследовать активность и свойства мембранных ферментов эритроцитов и синаптосом в динамике зимней спячки и гипотермии.
Охарактеризовать окислительно-восстановительное состояние тиоло-вых групп белков мембран синаптосом и эритроцитов у сусликов и крыс при низких температурах тела.
Выяснить возможности и механизмы корригирующего влияния даларгина на свободнорадикальные процессы и структурно-функциональные характеристики плазматических мембран при гипотермии.
Основные положения, выносимые на защиту.
При гибернации повышение стабильности мембран и сохранение их функциональных свойств осуществляется за счет адекватной регуляции сво-боднорадикальных процессов, а также обратимой перестройки липидных и белковых компонентов. ь
Развитие окислительного стресса в тканях крыс при умеренной (30С) кратковременной и, особенно, пролонгированной гипотермии является важнейшим фактором, способствующим повреждению клеточных мембран.
Окислительные повреждения мембран при гипотермии у крыс способствуют их дестабилизации, изменению структурно-динамических характеристик, модификации структуры и кинетических характеристик мембраносвязан-ных ферментов и белков.
Различия в стратегии температурных адаптации у гомойотермных и ге-теротермных животных в значительной степени связаны с неодинаковой структурой и уровнем регуляции биохимических процессов в мембранах.
Парентеральное введение опиоидного пептида даларгина оказывает «антиоксидантный» и мембраностабилизирующий эффекты при гипотермии. Протекторное действие даларгина проявляется только на начальных этапах гипотермии.
Научная новизна.
Впервые установлено, что одной из важных составляющих устойчивости и толерантности зимоспящих животных к изменению температуры тела является низкий уровень метаболитов и скорости индукции процессов ПОЛ, что в свою очередь способствуют поддержанию нативного состояния белковых и липидных компонентов мембран. Защита мембранных структур от окислительного повреждения и перестройка их белковых и липидных компонентов повышает стабильность клеточных и внутриклеточных мембран в условиях низких температур при гибернации. Впервые установлено, что у зимоспящих животных адаптивные приспособления к существованию при низких температурах проявляются на уровне отдельных белков-ферментов путем адекватного изменения кинетических характеристик и температурной зависимости активности мем- брансвязанного фермента (АХЭ).
Впервые установлено, что у гомойотермных животных (крыс), в отличие от гетеротермных животных (сусликов), начальные этапы гипотермии и пролонгированная умеренная гипотермия (30С) приводят к активации свободно-радикальных процессов в тканях и развитию окислительного стресса, что связано с повышением содержания прооксидантов. Впервые показано, что окислительный стресс приводит к повышению отрицательного поверхностного заряда и возникновению структурных изменений в мембранах гомойотермных животных при гипотермии таких, как повышение текучести аннулярных липидов, изменение степени погружения белков в липидный бислой, изменение структуры и редокс-состояния белков. В отличие от гетеротермного животного, гипотермия крыс оказывает повреждающее действие на активность мембраносвязан-ных ферментов (Na, К-АТФазы и АХЭ)
Теоретическая и практическая значимость.
На основе полученных фактов предложены схемы, объясняющие механизмы регуляции свободнорадикальных процессов и защиту мембран от окислительного повреждения у зимоспящих и незимоспящих животных. Обнаруженные в работе закономерности развития свободнорадикальных процессов при гипотермических состояниях различной глубины и длительности у зимоспящих и незимоспящих млекопитающих могут быть использованы для понимания эволюции адаптивных механизмов, контролирующих эти процессы. Установлены пути активации свободнорадикальных процессов и механизмы повреждения мембран при гипотермии гомойотермных животных, а также возможности их коррекции даларгином.
Полученные в данной работе факты о механизмах реализации антистрес-сорного, «антиоксидантного» и мембраностабилизирующего свойств даларгина в условиях гипотермии открывает новые перспективы его практического применения в медицине с целью управления адаптационными реакциями организма.
Результаты экспериментальной работы внедрены в учебный процесс в
12 ходе чтения курса биохимии крови, спецкурсов (нейрохимия, экологическая биохимия, свободнорадикальные процессы в норме и патологии), при проведении больших практикумов в Дагестанском государственном университете и в Махачкалинском филиале Ростовского государственного университета. Методические элементы работы опубликованы в «Практикуме по биохимии» (Ростов-на-Дону, 2000).
Апробация работы. Результаты настоящего исследования доложены и обсуждены более чем на 30 научных симпозиумах и конференциях, в том числе: на 2-й Международной конференции «Успехи современной криобиологии» (Харьков, 1992), симпозиуме «Макро- и микроуровни организации мозга» (Москва, 1992), научной конференции «Организованный мозг» (Москва, 1993), Международном симпозиуме «Физиолого-биохимические основы жизнедеятельности мозга» (Санкт-Петербург, 1994), конференции по функциональной нейрохимии (Пущино, 1996), 12-й Европейской нейрохимической конференции (Санкт-Петербург, 1998), II Международном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов» (Воронеж, 1998), 17-м объединенном съезде Международного нейрохимического общества и 13-м съезде Европейского нейрохимического общества (Берлин, 1999), Международной конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 1999), Международной конференции «Свободнорадикальные процессы и антиоксиданты в развитии и функционировании нервной системы от плода к старению» (Санкт-Петербург, 2001), 18-м объединенном съезде Международного нейрохимического общества и 14-м съезде Европейского нейрохимического общества (Буэнос-Айрес, 2001), III съезде Российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), 19-м съезде Российского физиологического общества (Екатеринбург, 2004).
Работа выполнена на кафедре биохимии и в НИИ биологии ГОУ ВПО «Дагестанский государственный университет» в рамках госбюджетного финансирования по теме 2.1.00 «Молекулярные механизмы температурных адаптации
13 животных и растений к экстремальным факторам среды» (№ госрегистрации 01200118053) и по программе «Университеты России» грант № 07.01.034 «Исследование влияния гипотермии на свободнорадикальные процессы и активность Na, К-АТФазы в мозге крыс».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 64 работы.
