Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Краткая характеристика Т- и В-лимфоцитов крови человека 10
1.1.1. Морфологические и функциональные особенности лимфоидных клеток 10
1.1.2. Особенности строения мембран Т- и В-лимфоцитов 15
1.1.3. Строение и функции отдельных мембранных маркеров 19
1.2. Действие УФ-излучения на иммунокомпетентные клетки 27
1.2.1. УФ-индуцированное пероксидное окисление липидов клеточных мембран. Роль активных форм кислорода 27
1.2.2. Фотоальтерация гликокаликса лимфоидных клеток 35
1.2.3. УФ-индуцированные изменения состояния компонентов иммунной системы 39
1.3. Эндогенные иммуностимуляторы 43
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 50
2.1. Объекты исследования 50
2.2. Методы исследования 50
2.2.1. Методика дефибринирования крови 50
2.2.2. Получение Т- и В-лимфоцитов 50
2.2.3. Определение жизнеспособности лимфоидных клеток 52
2.2.4. Определение чистоты клеточных суспензий 52
2.2.5. Облучение лимфоцитов УФ-светом 53
2.2.6. Модификация лимфоцитов некоторыми 54 иммуномодулирующими соединениями
2.2.7. Метод иммуноферментного анализа 54
2.2.8. Метод розеткообразования 57
2.2.9. Метод люминол-зависимой хемилюминесценции 58
2.2.10. Метод определения супероксиддисмутазной активности лимфоцитов 61
2.2.11. Метод определения пероксидазной активности лимфоцитов ' 62
2.2Л2. Статистическая обработка результатов 63
ГЛАВА 3. Влияние некоторых иммуномодулирующих соединений на антигенный профиль лимфоцитов крови человека 64
3.1. Изменение уровня экспрессии поверхностных иммуноглобулиновых цепей при действии соединений аденинового ряда 64
3.2. Регуляция экспрессии Fc-рецепторов препаратами а-интерферона 71
ГЛАВА 4. Влияние уф-излучения на экспрессию поверхностных антигенов т-лимфоцитами крови человека 77
4.1. Изменение уровня Fc-рецепторов на мембране Т-лимфоцитов 77
4.2. Влияние УФ-света на экспрессию СБ4-маркеров Т-лимфоцитами 81
4.3. Экспрессия антигенов HLA II класса нативными и УФ-модифицированными Т-лимфоцитами 86
4.4. Влияние УФ-излучения на розеткообразующую способность Т-лимфоцитов крови человека с эритроцитами барана 90
ГЛАВА 5. Изменение антигенного профиля мембран в-лимфоцитов при действии уф-излучения 97
5.1. Влияние УФ-света на уровень Fc-рецепторов на мембране В-лимфоцитов 97
5.2. Влияние УФ-излучения на экспрессию CD22 антигенов В-лимфоцитами 100
5.3. Экспрессия некоторых HLA-DR антигенов нативными и УФ-модифицированными В-лимфоцитами 103
5.4. Влияние УФ-излучения на розеткообразующую способность В-лимфоцитов крови человека с эритроцитами мыши ПО
5.5. Влияние УФ-модифицированных Т-лимфоцитов на уровень продукции иммуноглобулина нативными В-клетками 113
ГЛАВА 6. Влияние УФ-света на хемилюминесцентные свойства лимфоцитов и функциональную активность ферментативных антиоксидантов 120
6.1. Хемилюминесцентный ответ нативных и УФ-модифицированных Т- и В-лимфоцитов 120
6.2. Влияние УФ-излучения на функциональную активность ферментативных антиоксидантов 126
Заключение 133
Выводы - 137
Писок литературы
- Морфологические и функциональные особенности лимфоидных клеток
- Определение жизнеспособности лимфоидных клеток
- Регуляция экспрессии Fc-рецепторов препаратами а-интерферона
- Экспрессия антигенов HLA II класса нативными и УФ-модифицированными Т-лимфоцитами
Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы пристальное внимание исследователей направлено на изучение молёкулярно-клеточных механизмов функционирования иммунной системы. Это связано с тем, что факторы иммунитета являются основными элементами поддержания гомеостаза организма человека.
Высокая чувствительность иммунокомпетентных клеток к действию разнообразных химических агентов обеспечивает тонкую регуляцию системы in vivo, а также возможность разработки новых способов лечения патологических состояний [57, 182]. Однако наибольший интерес представляет выяснение механизмов саморегуляции, поскольку большое разнообразие естественных модуляторов (цитокины, гормоны, неспецифические регуляторы) и разнонаправленный эффект их влияния открывают широкие перспективы для иммунокорригирующей терапии, а побочные эффекты либо отсутствуют, либо компенсируются внутренними резервами организма [79].
В современной медицине для лечения вирусных заболеваний используются растворы человеческого лейкоцитарного интерферона, однако конкретные пути модуляции иммунной системы при действии данного цитоки-на в качестве фармакологического препарата или при его эндогенном синтезе в организме, остаются до конца не выясненными.
Соединения аденинового ряда (аденозин, АДФ, АТФ) относятся к неспецифическим иммуномодуляторам, поскольку их основная роль - участие в процессах энергетического обмена. В то же время установлен иммуно-тропный эффект адениновых веществ при значительном увеличении их концентрации в результате массовой гибели клеток. Это позволяет рассматривать аденозин и нуклеотиды в качестве медиаторов тканевого поражения и локальных регуляторов состояния лимфоцитарных клеток [40].
К настоящему времени накоплен значительный экспериментальный материал о влиянии на биообъекты различных диапазонов длин волн элек 6 тромагнитных излучений [24, 26], особое место среди которых занимает УФ-свет [69]. Большое количество работ, посвященных исследованию действия этого модифицирующего фактора, обусловлено усилением роли коротко- и средневолнового ультрафиолета в современной биосфере, а также широким использованием в клинической практике метода аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК). Авторами установлен дезинтоксикацион-ный и антивоспалительный эффект действия УФ-излучения [92], а также его участие в процессах модуляции уровня цитокинов [180], поверхностных антигенов [53], сывороточных иммуноглобулинов [91]. Изменение состояния компонентов иммунной системы вследствие УФ-модификации неизбежно будет отражаться на их функциональной активности (степень ответа на чужеродный антиген, дифференцировка и пролиферация лимфоцитов, кооперативные взаимодействия иммунокомпетентных" клеток, процессы антите-лозависимой клеточной цитотоксичности и др.).
Изучение механизмов действия физических и химических факторов на лимфоидные клетки позволит не только выявить причины возникновения иммунопатологии и способы их терапии, но и расширит общие представления о строении и функционировании биомембран в физиологических условиях и при агрессивных экзогенных воздействиях.
Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось изучение структурно-функциональных изменений мембран лимфоцитов крови человека при действии некоторых физических и химических факторов.
В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:
1. Изучить влияние а-интерферона и соединений аденинового ряда на антигенный профиль лимфоцитарных мембран.
2. Исследовать влияние УФ-излучения (240-390 нм) на уровень экспрессии ряда антигенных детерминант поверхностью Т- и В-лимфоцитов.
3. Оценить уровень процессов пероксидного окисления липидов в мембранах УФ-облученных Т- и В-клеточных субпопуляций.
4. Исследовать функциональную активность ферментов антиоксидант-ной системы (супероксиддисмутазы и пероксидазы) УФ-модифицированных лимфоцитов.
Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным изучению структурно-функциональных особенностей Т- и В-лимфоцитов в присутствии химических модификаторов и в условиях УФ-облучения.
Впервые было изучено влияние УФ-излучения на состояние рецепторного материала (FcR, HLA-DR, CD2, CD4, CD22) изолированных суспензий Т- и В-клеток, что позволило не только отследить изменение антигенного профиля отдельных субпопуляций лимфоцитов, но и проанализировать процессы, связанные с межклеточным взаимодействием.
Выявлено стимулирующее действие УФ-света на уровень функциональной активности В-клеточного звена иммунитета и снижение экспрессии большинства тестируемых структур на поверхности Т-лимфоцитов. Обнаружено иммунокорригирующее действие использованного диапазона УФ-излучения в отношении тестируемых параметров. Установлена связь между уровнем антигенных детерминант УФ-облученных лимфоцитов и протеканием процессов пероксидного фотоокисления липидов (ПФОЛ) мембран Т-лимфоцитов. Показано значительное усиление СОД-активности УФ-модифицированных В-лимфоцитов, что обеспечивает защиту биомембраны от токсического действия продуктов ПФОЛ.
Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют современные представления о структурно-функциональных изменениях лимфоидных клеток при действии на них физических и химических факторов.
Эксперименты с использованием эндогенных иммуномодуляторов раскрывают механизмы тонкой регуляции организма in vivo и при проведении фармакотерапии. Данные, полученные при исследовании комплекса фотоиндуцирован-ных процессов на поверхности иммунокомпетентных клеток (состояние антигенного профиля, уровень процессов ПФОЛ, степень активации компонентов антиоксидантной системы), позволяют понять пути изменения функционального состояния изолированных лимфоцитов и их межклеточных взаимодействий в условиях УФ-облучения.
Разработанная схема событий, возникающих при УФ-облучении лим-фоидных клеток, включает совокупность процессов, инициированных УФ-светом и приводящих к трансформации биомембран отдельных субпопуляций лимфоцитов (Т- и В-клеток), что может быть полезно для понимания молекулярных аспектов действия метода АУФОК-терапии.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на II Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1998); II Международном конгрессе "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине" (СПб, 2000); Всероссийском симпозиуме "Клеточная биология на пороге XXI века" (СПб, 2000); II Российской конференции "Физика в биологии и медицине" (Екатеринбург, 2001); XIV межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий" (Краснодар, 2001); III съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (2001); III Международном симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз" (Москва, 2002).
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 12 печатных работах.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Аденозин, АДФ, АТФ (ОД - 10 мкмоль/л) и а-интерферон (0,01 -100 МЕ/мл) являются "мягкими" иммуномодуляторами состояния рецепторного материала лимфоцитарных клеток, эффект действия которых в значительной степени зависит от используемой концентрации вещества и индивидуальных особенностей доноров.
2. УФ-излучение (240-390 нм) в дозах 151- 1359 Дж/м2 вызывает усиление экспрессии антигенов HLA-DR, CD4, CD22, снижение количества С02-маркеров и разнонаправленные эффекты в отношении экспрессии Fc-рецепторов на поверхностной мембране Т- и В-лимфоцитов крови человека.
3. Мембраны Т- и В-лимфоцитов крови человека обнаруживают различную устойчивость к процессам пероксидного фотоокисления липидов: свободнорадикальные реакции, инициированные УФ-светом, более характерны для Т-клеток и вносят основной вклад в изменение антигенного профиля плазматической мембраны.
4. Фото активация ферментативных антиоксидантов, проявляющих су-пероксиддисмутазную активность, обеспечивает толерантность В-клеточных мембран к процессам пероксидного фотоокисления липидов.
5. Схема процессов, протекающих при действии УФ-излучения на мембраны Т- и В-лимфоцитов крови человека.
Структура диссертации. Диссертационная работа включает 161 страницу машинописного текста и 13 страниц приложения, 23 табл., 40 рис. Состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и приложения. Список литературы содержит 223 источника, из них 121 - отечественных и 102 - зарубежных.
Морфологические и функциональные особенности лимфоидных клеток
Лимфоциты - иммунокомпетентные клетки, способные к специфическому ответу на действие антигенов. Как и другие клетки иммунной системы, они обладают уникальными свойствами - высокой изменчивостью, деформируемостью, инвазивностью и способностью к рециркуляции, обеспечивающими возможность иммунологического надзора [13, 100].
В крови человека в норме содеожится 1,2-3,3-10 /л лимфоцитов [96]. По происхождению и функциональной направленности лимфоидные клетки относятся к Т- или В-зависимой системе. В крови человека на долю Т-клеток приходится около 75% лимфоцитов. В-лимфоциты составляют 15 %, остальные лимфоциты - нулевые клетки, не имеют ни Т-, ни В-маркеров [28, 106]. Эти две основные группы морфологически мало отличимы друг от друга [11, 99]. Большинство покоящихся лимфоцитов представляют собой круглые клетки диаметром 5-8 мкм и высоким ядерно-цитоплазматическим отношением. Узкий ободок цитоплазмы содержит разрозненные митохондрии. Ядро клетки округлое или овальное с плотно агрегированным хроматином [75, 99]. В цитоплазме Т-клеток хорошо развит гладкий эндоплазма-тический ретикулум и содержится много монорибосом [74]. Для В-лимфоцитов характерно наличие большого числа митохондрий, хорошо развитого аппарата Гольджи, полирибосом и шероховатого эндоплазмати-ческого ретикулума [97]. Электронная микроскопия показала, что в В-лимфоцитах более развита гранулярная эндоплазматическая сеть, а в Т-лимфоцитах - система лизосом. Морфометрический анализ выявляет различия в размерах клеток, их ядер, ядерно-цитоплазматических отношениях, содержании и распределении гетерохроматина и эухроматина ядер. Т-лимфоциты и их ядра имеют меньшие размеры, большее содержание гетерохроматина [15].
В результате стимуляции антигеном малые лимфоциты могут трансформироваться в средние и большие, а также в бластные клетки. Этот процесс сопровождается увеличением размера клеток до 12-15 мкм, уменьшением плотности хроматина в ядре. Ободок цитоплазмы становится шире и часто содержит отдельные азурофильные гранулы, в цитоплазме увеличивается количество рибосом и пиронина [15]. Процесс активации лимфоцитов сопровождается увеличением уровня мРНК и усилением биосинтеза белка [141, 198].
Основные функциональные отличия Т- и В-лимфоцитов состоят в том, что В-клетки осуществляют гуморальный иммунный ответ, а Т-лимфоциты - клеточный, а также участвуют в регуляции обеих форм иммунного ответа.
Тимические клетки генерируют и поставляют в кровь и периферические лимфоидные органы несколько типов иммунокомпетентных клеток [15,28,43,72, 109]:
1. Т-эффекторы (ТЕ) - это клетки, которые осуществляют клеточные формы иммунного ответа. В связи с тем, что ТЕ способны специфически разрушать клетки-мишени, их называют цитотоксическими Т-лимфоцитами, или Т-киллерами. Т-киллер - одна из основных эффекторных клеток клеточноопосредованного иммунитета, которая, наряду с другими клетками, способна осуществлять лизис мишеней [218]. Маркерами Т-киллеров служат поверхностные антигены CD56 и CD 16. Кроме того, они обладают антигеном CD2, свойственным большинству клеток лимфоидного ряда и определяющим адгезивные свойства клеток, и рецепторами к цито-кинам, которые могут стимулировать их активность (ИЛ-12) либо подавлять её (ИЛ-10) [104].
Очень велика роль Т-киллеров в реализации трансплантационного иммунитета, развитии аутоиммунных заболеваний, в противоопухолевой защите [132, 155].
2. Т-помошники (Т-хелперы, Ти) составляют 55-60% от числа цирку лирующих Т-лимфоцитов. Несут на своей поверхности антиген CD4, а так же рецептор к Fc-фрагменту IgM. Ти включают В-лимфоциты в пролифера цию и дифференцировку, обеспечивающую накопление соответствующего клона зрелых антителопродуцентов - плазматических клеток, интенсивно синтезирующих антитела против иммунизирующего антигена. Функцио нальная активность опосредуется гуморальными хелперными факторами, которые синтезируются этими лимфоцитами в ответ на антигенный стимул. Т-хелперы, стимулирующие другие Т-лимфоциты к выработке хелперных сигналов, называют Т-усилителями - амплифайерами (от англ. to amplifier усиливать). Недостаточность хелперной функции Т-лимфоцитов приводит к "неотвечаемости" организма на антигенную стимуляцию, что, в конечном итоге, способствует персистенции в организме человека большого количе ства микроорганизмов, развитию злокачественных новообразований и явля ется причиной летального исхода [130, 137].
3. Т-супрессоры (Ts) составляют 20-30% циркулирующих Т лимфоцитов. Обладают выраженной экспрессией антигена CD8, рецепторов к Fc-фрагменту иммуноглобулина G, гистамину и теофиллину. Ts тормозят включение В-лимфоцитов в пролиферацию и дифференцировку и, следова тельно, тормозят выработку антител различных классов; обеспечивают эф фект конкуренции антигенов; тормозят развитие реакций гиперчувстви тельности замедленного типа, формирование цитотоксических Т лимфоцитов; обеспечивают становление и поддержание иммунологической толерантности [12, 139].
Определение жизнеспособности лимфоидных клеток
Жизнеспособность клеток определяли в тесте с трипановым синим. Этот краситель не проникает в живые клетки, но при повреждении мембран способен окрашивать клеточное ядро [66]. Для определения жизнеспособности лимфоцитов после воздействия УФ-излучения и клеток, находящихся в реакционной смеси при определении СОД-активности, использовали 0,2% раствор трипанового синего в изотоническом растворе Хенкса без глюкозы. Краситель смешивали в равных объемах с клеточными суспензиями и в камере Горяева осуществляли подсчет не менее 100 клеток для определения процента окрашенных (мертвых) лимфоцитов.
Чистоту клеточных суспензий проверяли методом окрашивания мазков по Романовскому [42, 90]. В основе метода лежит способность смеси основных (азур II) и кислых (водорастворимый желтый эозин) красок окрашивать различные элементы клеток в разные цвета и оттенки.
Для окрашивания мазков использовали готовый раствор краски Романовского. Предварительно клеточную суспензию фиксировали в пробирке 3% глютаровым альдегидом. Мазки наносили на предметные стекла и укладывали на стеклянный мостик. После этого их заливали краской в разведении 1-2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды. Красящий раствор наливали на препарат высоким слоем и выдерживали его в таком положении 1-2 мин. После этого краску смывали струей воды, и мазки устанавливали в штатив вертикально для просушки. Морфологическую идентификацию клеток крови осуществляли методом иммерсионной микроскопии (табл. 5).
Полученные суспензии Т- и В-лимфоцитов в объеме 3 мл облучали в термостатированной (37С) кювете при постоянном перемешивании магнитной мешалкой типа ММ6 с помощью ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240-390 нм. Ин тенсивность облучения составляла 151 Дж/м" в 1 мин на расстоянии 0,23 м до объекта. Время облучения образцов крови составляло 1, 3, 6 и 9 мин, что соответствовало дозам облучения 151; 453; 906 и 1359 Дж/м".
Для модификации лимфоцитов с помощью соединений аденинового ряда применяли растворы аденозина, АДФ и АТФ в концентрациях 0,1; 1 и 10 мкмоль/л. Инкубацию лимфоцитов в растворе Хенкса, содержащего аде-ниновые вещества, проводили при температуре 37С в течение 1 часа.
Для модификации лимфоцитов с помощью, интерферона использовали растворы человеческого лейкоцитарного а-интерферона в концентрациях 0,01; 0,1; 1; 10 и 100 МЕ/мл. Инкубацию лимфоцитов в растворе Хенкса, содержащего цитокин, проводили при температуре 25С в течение 24 часов.
Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) применяется для выявления антигенов и антител в сыворотке крови и на поверхности клеточной мембраны. Он относится к простым, чувствительным, быстрым и хорошо воспроизводимым методам [94].
Проведение твердофазного ИФА основано на следующих 4 принципах.
1. Различные ферменты, наибольшее распространение из которых получили пероксидаза хрена (ПХ).и щелочная фосфотаза (ЩФ), можно ковалентно присоединить к антигенам или антителам различными химическими методами, при этом оба компонента коныогата сохраняют свою биологическую активность.
2. Большинство антигенов самопроизвольно сорбируются на поверхности пластика (например, в лунках полистироловой панели). Именно на этом принципе основан первый этап реакции, заключающийся в "сенсибилизации" панелей антигенами или антителами. Адсорбированные на твердой фазе антигены и антитела уже не смываются буфером, содержащим детергент, тогда как несвязавшиеся компоненты легко удаляются отмыванием.
3. Затем в "сенсибилизированных" лунках инкубируют исследуемый образец и стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы, состоящие из одного или нескольких слоев. Несвязавшиеся компоненты на каждом этапе удаляются отмыванием, что позволяет добиться высокой специфичности анализа в реакции входящего в состав коньюгата фермента с индикаторным субстратом
4. При связывании конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию останавливают на нужной стадии, а степень окрашивания оценивают визуально, сравнивая со стандартами, или инструментально по оптической плотности.
Метод ИФА был использован нами для определения Fc-рецепторов, антигенов системы HLA-DR, CD4, СБ22-маркеров на поверхности натив-ных и УФ-модифицированных лимфоцитов, для определения уровня мем-брансвязанных иммуноглобулиновых молекул при действии на клетку соединений аденинового ряда, для определения растворимых иммуноглобулинов в системе: нативный В-лимфоцит - УФ-модифицированный Т-лимфоцит.
Регуляция экспрессии Fc-рецепторов препаратами а-интерферона
В ходе работы было исследовано влияние человеческого лейкоцитарного интерферона (ct-INF) в диапазоне концентраций 0,01; 0,1; 1; 10 и ЮОМЕ/мл на сорбционную способность Т-лимфоцитов 35 доноров в отношении конъюгата белок А - пероксидаза хрена. Одним из основных компонентов мембраны лимфоцитов, с которым может взаимодействовать белок А золотистого стафилококка, являются Fc-рецепторы [15]. Термином "Fc-рецептор" обозначают целый ряд мембран-связанных антигенов (CD16, CD32, CD64), взаимодействующих с константным участком иммуноглобулиновой макромолекулы. Следовательно, определяя способность лимфоцитов сорбировать коньюгат, мы выявляем суммарную экспрессию данных молекул на их поверхности.
Величина регистрируемого параметра для интактных Т-лимфоцитов колебалась в широких пределах - от 0,903+0,026 до 1,540±0,059.
Внесение в суспензии Т-лимфоцитов a-IFN приводило к разнонаправленным эффектам в отношении экспрессии FcR. При разных дозах модификатора было зарегистрировано как увеличение количества антигенных детерминант, так и их уменьшение (табл."7). При использовании минимальной концентрации a-INF (0,01 МЕ/мл) и максимальной (100 МЕ/мл) количество образцов с возросшим и пониженным уровнем FcR оказалось практически одинаковым - 17-15 и 14-15. Концентрации модификатора 0,1 и 10 МЕ/мл оказывали более выраженное стимулирующее действие в отношении исследуемого параметра. Соответственно для 21 и 20 доноров зарегистрировано увеличение количества рецепторов, а уменьшение выявлено лишь для 9 и 13 человек. Наиболее выраженная активация уровня экспрессии антигенных детерминант отмечена при концентрации a-INF, равной 1 МЕ/мл.
Таким образом, повышение концентрации a-INF от 0,01 до 1 МЕ/мл приводит к увеличению количества доноров, Т-лимфоциты которых усиливают FcR-экспрессию (до 92% относительно немодифицированного состояния). Применение больших концентраций модификатора (10 и 100 МЕ/мл) нивелирует данный эффект. Число доноров с выраженным стимулирующим эффектом уменьшается.
Определенный практический и теоретический интерес представляет анализ индивидуальной чувствительности FcR доноров к действию различных доз a-IFN. В зависимости от количества Fc-рецепторов на мембранах немодифицированных Т-лимфоцитов доноры были разделены на 5 групп. 1 группа (10 доноров). Нативные Т-лимфоциты данных доноров обла дали исходно высоким уровнем экспрессии FcR на поверхности нативных Т-лимфоцитов (1,509+0,052). Максимальное увеличение уровня экспрессии FcR в среднем на 22% у доноров этой группы наблюдалось при их модифи кации интерфероном в концентрации 0,01 МЕ/мл. При использовании а IFN в больших концентрациях (0,1-И 00 МЕ/мл) наблюдается дозозависимое уменьшение этой величины. При разведении модификатора 0,1 и 1 МЕ/мл тестируемый параметр продолжает превышать контроль соответственно на 13 и 7%, при концентрации 10 МЕ/мл уровень FcR-экспрессии достигает значений интактного состояния, а применение максимальной дозы a-INF приводит к уменьшению регистрируемого показателя на 15% (рис. 9 а). 2 группа (4 донора). Уровень экспрессии FcR на мембранах Т лимфоцитов был ниже, чем в первой группе и составил 1,084±0,018. Увели чение количества антигенных детерминант наблюдалось после инкубации с a-IFN в концентрации 0,1-И 00 МЕ/мл. Максимальный эффект зарегистрирован при разведении цитокина 1 МЕ/мл - исследуемый параметр возрос на 80% и составил 1,957+0,018. Минимальная из используемых доз статистически достоверно снижала количество Fc-рецепторов на 21% (рис. 9 б). 3 группа (5 доноров). Величина ИФА-сигнала для интактных Т лимфоцитов составила 1,040±0,024. Стимулирующий эффект a-IFN выяв лен лишь при одном разведении модификатора - 1 МЕ/мл. Концентрации цитокина 0,01; 10 и 100 МЕ/мл оказывали ингибирующий эффект на FcR экспрессию - падение параметра составляло до 55%) относительно контроля (рис. 9 в). 4 группа (9 доноров). a-IFN в дозе 0,1 МЕ/мл приводит к снижению исходного уровня экспрессии (0;976±0,093) на 25%, концентрация цитокина 10 МЕ/мл, напротив, индуцирует значительное увеличение количества тестируемых маркеров - ИФА-сигнал составил 2,873±0,021 (рис. 9 г). 5 группа (7 человек). Т-лимфоциты данных доноров обладали самым низким уровнем FcR-экспрессии в немодифицированном состоянии. Стимулирующий эффект a-IFN выявлен при всех разведениях цитокина - исследуемый показатель возрастает до 60% относительно интактного уровня (рис 9 д).
Таким образом, нами установлено, что различные дозы a-IFN оказывают разнонаправленный эффект в отношении экспрессии Fc-рецепторов, локализованных на поверхностной мембране Т-лимфоцитов. Анализ интер-ферончувствительности Т-клеток показал, что в большинстве случаев, чем ниже исходный уровень FcR, тем большие концентрации цитокина необходимы для достижения максимальной экспрессии тестируемых рецепторов. Механизм действия a-IFN на иммунокомпетентные клетки реализуется через специфические рецепторы.
Экспрессия антигенов HLA II класса нативными и УФ-модифицированными Т-лимфоцитами
По мнению ряда авторов [8, 55, 108], основная причина изменения количества антигена на клеточной поверхности после воздействия УФ-света -процесс фотоальтерации гликокаликса. Фотоальтерация примембранных слоев характерна для многих клеток - лимфоцитов, эритроцитов, тимоци-тов, спленоцитов и др. В результате десорбции компонентов мембраны существенно изменяется ее топография, что приводит к модуляции уровня экспрессии поверхностных антигенов и рецепторов. Анализ данных, полученных нами при исследовании влияния УФ-излучения (240-390 нм) в диапазоне доз 151-=-1359 Дж/м2 на уровень экспрессии ряда поверхностных молекул Т-лимфоцитов (CD2, CD4, CD 16, CD32, CD64, HLA-DR), показал следующее. Облучение клеточной суспензии УФ-светом приводит к значительному изменению уровня тестируемых молекул на поверхности лимфоцитарных мембран. Для CD2-MapKepoB и FcR было характерно снижение количества антигенных детерминант, а для С04-маркеров и продуктов локуса HLA-DR - их увеличение. Для большинства доноров эффективными оказались максимальные из используемых доз УФ-излучения - 906 и 1359 Дж/м . Выявлены группы доноров, лимфоциты которых отличаются по уровню толерантности биомембран к действию модификатора.
На основании полученных результатов можно предположить, что деструктивные процессы в белково-липидном матриксе, вероятнее всего, про-текают при использовании больших доз облучения (1359 Дж/м"), поскольку только в данном случае наблюдается снижение количества антигена (CD2) на клеточной поверхности. Десорбция примембранных слоев может привести как к уменьшению уровня экспрессии макромолекул из-за отрыва иммунных маркеров с поверхности лимфоцита, так и к его усилению. В последнем случае необходимо, чтобы клетка обладала предсу шествующим и антигенными детерминантами, в нативном состоянии не доступными для взаимодействия с антителами вследствие их глубокой локализации в ли-пидном матриксе, сильной ассоциации с гидрофобными частями белков, блокировки центров связывания соответствующими лигандами или стери-ческой "маскировкой" соседними макромолекулами. Альтерация гликока-ликса под действием УФ-излучения способна привести к открытию таких "неактивных" рецепторов и, тем самым, увеличить степень регистрируемой экспрессии молекул.
Действие малых доз УФ-света (151 - 453 Дж/м") приводит к уменьшению аффинности рецепторов, что вызывает уменьшение сигнала в тест 95 системе, однако, число маркеров, экспрессированых на поверхности мембраны, по всей видимости, остается неизменным. Причиной снижения сродства антигенных детерминант к антителам может выступить поглощение энергии кванта аминокислотами белковой макромолекулы (фотоионизация ароматических аминокислотных остатков, фотолиз -S-S- и -C-S- связей) и, как следствие, изменение конформации клеточного рецептора и потеря им функциональной активности. Второй возможный путь - реакции фотопревращения липидов биомембраны, приводящие к изменению структуры бислоя [103]. Изменение микроокружения клеточных антигенов, являющихся в большинстве случаев интегральными белками, способно изменить баланс водородных, гидрофобных и других слабых связей, поддерживающих нативную конформацию макромолекулы, что также приведет к " снижению ее функциональной активности.
Выявленные нами изменения антигенного профиля мембраны Т-лимфоцитов при действии УФ-света указывают на процессы активации клеточной и гуморальной составляющих иммунной системы. Усиление экспрессии антигенов HLA-DR, являющихся ранними маркерами активации Т-клеток, приведет к стимуляции межклеточных взаимодействий и, возможно, к уменьшению рестрикции на чужеродные антигены. Снижение количества FcR, являющихся источниками супрессирующих сигналов, снимет ограничение В-лимфоцитов на процессы дифференцировки и пролиферации, вызовет изменение уровня продукции медиаторов воспаления, процессов ан-тителозависимой клеточной цитотоксичности. Следует ожидать усиление комплексирования Т- и В-лимфоцитов при развитии иммунного ответа на чужеродный белок вследствие роста числа С04-маркеров на мембране УФ-модифицированных Т-лимфоцитов, а также значительное повышение сродства TcR к комплексу антигена с продуктами МНС класса II, увеличение вероятности прохождения в клетку активационных сигналов.
Похожие диссертации на Модуляция структурно-функциональных изменений мембран Т- и В-лимфоцитов крови человека некоторыми химическими и физическими агентами
