Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время внимание исследователей привлекает вопрос об участии нейтрофилов в регуляции иммунного и других звеньев гомеостаза. Являясь наиболее лабильными и пластичными клетками крови, способными к быстрому реагированию на любые повреждающие воздействия, нейтрофилы формируют первую линию защиты организма. Реактивность нейтрофилов важно учитывать при включении их в патогенез как одного из ключевых эффекторов иммунокомплексного воспаления. С этой точки зрения изучение функционального потенциала нейтрофилов позволяет выявить резервные возможности фагоцитарного звена иммунитета, а также рассматривать изменения реактивности этих клеток в качестве индикаторов патологических нарушений.
В реализации эффекторных функций нейтрофилов особое место отводится продуктам секреции данных клеток. Активированные фагоциты продуцируют различные медиаторы воспалительных реакций, среди которых активные кислородные метаболиты и ряд цитокинов. Современные знания о цитокинах позволяют считать эти медиаторы иммунитета частью сложной цепи взаимодействующих молекулярных факторов, посредством которых работа различных систем организма становится скоординированной и регулируемой (А.А. Михайлова, 1992).
Использование в клинике при воспалительных процессах и других имму-нопатологиях, обусловленных недостаточностью системы нейтрофилов, препаратов на основе естественных клеточных регуляторов - цитокинов - открывает большие перспективы. Среди рекомбинантных цитокинов, применяемых в современной медицине, интерес представляет фактор некроза опухоли а. Его мощное биологическое влияние на иммуногенез, воспалительные процессы и опухолевые клетки позволяет считать фактор некроза опухоли (ФНОа) многообещающим средством иммунотерапии онкологических, воспалительных, инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также при иммунодефицитах, трансплантации органов и тканей (В.П. Шичкин, 1998).
Несмотря на широкие перспективы использования ФНО в клинике, необходимо решить ряд проблем, связанных с подбором терапевтических концентраций, трудностью прогнозирования и контроля реакции организма на цито-киновую терапию.
Участие нейтрофилов в процессах распознавания возбудителя и формирования иммунного ответа во многом определяется внутриклеточным метаболизмом и структурно-функциональным состоянием рецепторного аппарата клеток (A.M. Земсков и соавт., 2001). Дефекты в работе ферментных систем и ослабление адгезивных взаимодействий нейтрофилов ведут к серьезным нарушениям фагоцитоза, что ослабляет неспецифический иммунитет и может служить причиной частого бактериального инфицирования. Однако бесконтрольное действие большого количества активированных нейтрофилов приводит к повреждениям тканей и органов собственного организма, развитию аутоиммунной агрессии. Все это определяет необходимость поиска эффективных методов воздействия на кровь и ее компоненты, корригирующих функциональное состояние фагоцитов.
РОС НАЦИОМА.» ВНБЛНОТЕКА СЯе 08
Одним из методов иммунокоррекции является ультрафиолетовое облучение крови. Аутотрансфузия УФ-облученной крови в настоящее время широко используется при лечении гнойно-септических, сердечно-сосудистых и других заболеваний (А.Н. Вельских и соавт., 1996; В.И. Карандашов, Е.Б. Петухов, 1997). В проведенных экспериментальных и клинических исследованиях установлен дезинтоксикационный, противовоспалительный, иммуномодулирующий эффект действия УФ-света (К.А. Самойлова и соавт., 1986; Е.А. Олейникова и соавт., 1986; В.Г. Артюхов и соавт., 2001), его участие в структурно-функциональных перестройках рецепторного аппарата иммунокомпетентных клеток (К.А. Самойлова и соавт., 1987. 1990, 1991; Е.В. Волгарева и соавт., 1990; К.А. Samoilova et al., 1996; K.D. Obolenskaya et al., 1998), в процессах активации белков системы комплемента (В.Г. Аргюхов и соавт., 1990; В.В. Гусинская и соавт., 1994, 1995а, 19956), сывороточных иммуноглобулинов (В.Ю. Жосанов и соавт., 2001), модуляции уровня цитокинов (Е.Б. Жибурт и соавт., 1995; D. Kulms et al, 2001).
Несмотря на значительные успехи в изучении фагоцитарного звена иммунитета, исследование регуляторного действия УФ-света на функциональную (фагоцитарную, секреторную, адгезионную, цитотоксическую) активность ней-трофилов остается малоизученной областью фотоиммунологии. Практически отсутствуют работы, посвященные анализу взаимосвязи структурно-функциональных фотомодификаций фагоцитов с процессами их взаимодействия с сывороточными опсонинами, в частности белками системы комплемента, а также с медиаторами иммунного ответа - цитокинами. Необходимость таких исследований очевидна с точки зрения современных представлений о функциональной кооперации клеточных и гуморальных компонентов иммунной системы. Раскрытие закономерностей и механизмов действия УФ-излучения на клеточные и гуморальные звенья иммунной системы позволит теоретически обосновать практическое применение УФ-света в клинической практике.
Интерес представляет также изучение возможности регуляции активности фагоцитов сочетанным действием естественных модуляторов физической и химической природы (к примеру, УФ-света и фактора некроза опухоли). Так, использование ФНОа в различных концентрациях на фоне фотомодификации крови может способствовать повышению эффективности иммунокорригирую-щего действия АУФОК при лечении патологий различной степени тяжести.
Исследование механизмов, лежащих в основе регуляторного действия УФ-света и ФНОа на нейтрофилы, позволит выявить новые подходы к терапии клеточных дефектов фагоцитоза и иммунокоррекции.
Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось изучение структурно-функционального состояния нейтрофилов в условиях УФ-облучения и в присутствии фактора некроза опухоли а.
В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:
-
Изучить влияние УФ-света (240-390 нм) в диапазоне доз 75,5^-2265 Дж/м2 на процесс взаимодействия нейтрофилов с СЗ фактором системы комплемента.
-
Выявить влияние УФ-света (75,5-^-755 Дж/м2) и фактора некроза опухо-
ли a (40^-1000 пкг/мл) на фагоцитарную активность и состояние ферментных систем нейтрофилов.
3. Оценить вклад изменений структурно-функционального состояния ре
цепторов иммунной адгезии (FcR и CR3) на мембранах УФ- и/или ФНО-
модифинированных нейтрофилов в модуляцию фагоцитарной активности дан
ных клеток.
4. Исследовать цитотоксическую (ФНО-продуцирующую и NO*-
секретирующую) способность нейтрофилов в условиях УФ-облучения
(75,5-2265 Дж/м2).
Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным изучению структурно-функционального состояния нейтрофилов при действии УФ-света и ФНОа.
Впервые изучено влияние УФ-света на взаимодействие мембран нейтрофилов с СЗ фактором системы комплемента и выявлены основные закономерности, обусловливающие данный процесс. Установлено, что в основе структурно-функциональных фотомодификаций мембран нейтрофилов лежит эффект «кэппинга» рецепторов CR1 с лигандированным СЗ фактором комплемента.
Показано регуляторное действие УФ-света и ФНОа на фагоцитарную активность нейтрофилов. Рассматривается вклад различных процессов (перок-сидного фотоокисления липидов, активности НАДФН-оксидазы, миелоперок-сидазы и супероксиддисмутазы) в изменение функционального потенциала фото- и ФНО-модифицированных нейтрофилов. Обсуждаются возможные пути изменения структурно-функционального состояния рецепторов иммунной адгезии (CR1, CR3, FcR), приводящие к повышению или понижению функциональной активности модифицированных фагоцитов.
Выявлено иммунокорригирующее действие УФ-света на уровень продукции NO* и фактора некроза опухоли а нейтрофилами; конечный эффект при этом определяется исходным уровнем исследуемых показателей и дозой УФ-света. Установлены корреляционные зависимости между уровнем генерации NO* и ФНО-продуцирующей способностью и СОД-активностью нейтрофилов.
Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о молекулярно-клеточном механизме регуляторного действия УФ-света на функциональную активность нейтрофилов, являющихся важным звеном неспецифического иммунитета организма.
Изучение фотоиндуцированных структурно-функциональных изменений рецепторов CR1, CR3, FcR, через которые реализуются адгезивные взаимодействия нейтрофилов, важно при рассмотрении вопросов, связанных с выяснением механизмов действия УФ-света на молекулярно-клеточном уровне. Полученные экспериментальные данные позволяют выявить общие закономерности регуляторного действия УФ-света на процесс взаимодействия рецепторов нейтрофилов с соответствующими лигандами, в частности с СЗ фактором комплемента, что необходимо для решения проблемы опсонинзависимой регуляции фагоцитоза.
Данные, полученные при исследовании функциональной активности фо-
томодифицированных нейтрофилов в присутствии ФНОа (уровень процессов ПФОЛ, состояние систем генерации АКМ, антиоксидантной системы, рецепторного аппарата), могут быть использованы для оценки резервных возможностей иммунитета и определения глубины и динамики патологических сдвигов в организме.
Эксперименты с использованием фактора некроза опухоли а позволяют выработать новые подходы к иммунокоррекции патологических состояний организма при проведении фармакотерапии и определить возможность применения метода АУФОК на различных стадиях воспалительного процесса с целью повышения эффективности его использования.
Предложенная схема регуляторного действия УФ-света и ФНОа на функциональные свойства нейтрофилов может быть полезна для понимания молекулярных механизмов иммунокорригирующего действия метода АУФОК.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VIII международной конференции по химии и физико-химии оли-гомеров «Олигомеры-2002» (Черноголовка, 2002); 8-ой Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущине, 2004); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); XIX съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (СПб., 2004); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2005); IV съезде фотобиологов России (Саратов, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов, в том числе 3 статьи в журналах системы РАН и РАМН.
На защиту выносятся следующие положения:
1. УФ-свет (240-390 нм) в дозах 75,5-^-2265 Дж/м2 индуцирует повышение
антителосвязываюшей способности СЗ компонента комплемента в системе из
взаимодействующих нейтрофилов и белков системы комплемента.
-
УФ-излучение в дозах 75,5-^-755 Дж/м2 и ФНОа в концентрациях 40-^ 1000 пкг/мл оказывают модулирующее действие на функциональное состояние нейтрофилов (системы генерации активных кислородных метаболитов и антиоксидантной защиты, рецепторный аппарат), изменяя фагоцитарную активность клеток.
-
УФ-свет (75,5-^2265 Дж/м2) усиливает антителосвязывающую способность CR3-peuenTopoB и вызывает разнонаправленные эффекты в отношении Fc-рецепторов с лигандированным IgG, зависящие от исходного уровня их сорбционной способности.
-
УФ-облучение нейтрофилов в дозах 75,5-^2265 Дж/м2 оказывает корригирующее действие на генерацию NO* и продукцию ФНОа данными клетками.
-
Схема возможных регуляторных процессов, приводящих к изменению функционального потенциала нейтрофилов в условиях УФ-облучения и в присутствии ФНОа.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 201 страницу машинописного текста, 15 таблиц, 43 рисунка. Состоит из «Введения», семи глав, «Заключения», «Выводов» и «Приложения». Список литературы содержит 272 источника, из них 128 - отечественных и 144 — зарубежных.
