Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1, Нейтрофильные лейкоциты, их роль в регуляции иммунно го гомеостаза организма 13
1.1. Морфологические и функциональные особенности нейтрофилов
1.2. Рецепторы и белки на поверхности нейтрофилов 21
1.3. Участие активных кислородных метаболитов в реализации эффек-торного потенциала нейтрофилов. 29
1.4. Цитокины как медиаторы иммунного ответа. Роль фактора некроза опухоли в иммунологических реакциях 34
ГЛАВА 2. Воздействие УФ-света на состояние компонентов иммунной системы 41
Экспериментальная часть 46
ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования 46
3.1 .Объекты исследования 46
3.2. Методы исследования... -* 46
3.2.1. Выделение нейтрофилов из крови человека 46
3.2.2. Получение сыворотки крови 47
3.2.3. УФ-облучение исследуемых образцов 47
3.2.4. Инкубация нейтрофилов с фактором некроза опухоли а 48
3.2.5. Метод иммуноферментиого анализа для определения поверхностных рецепторов нейтрофилов
3.2.6. Метод иммунофлуоресценции для изучения структурных
свойств мембран нейтрофилов3.2.7. Получение лизатов нейтрофилов для определения концентрации ФНОа 52
3.2.8. Метод иммуноферментиого анализа для определения концен-трации ФНОа в лизатах нейтрофилов
3.2.9. Измерение интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов 53
3.2.10. Получение супернатанта нейтрофилов 57
3.2.11. Определение активности супероксиддисмутазы нейтрофилов крови человека 57
3.2.12. Определение продукции оксида азота нейтрофилами крови че-ловека ^
3.2.13. Определение активности миелопероксидазы нейтрофилов крови человека
3.2.14. Определение концентрации белка методом Лоури 63
3.2.15. Определение жизнеспособности нейтрофилов с помощью три-панового синего 63
3.2.16. Статистическая обработка результатов экспериментов 65
ГЛАВА 4. Влияние УФ-света на процесс взаимодействия мембран нейтрофилов с СЗ фактором системы комплемента
4.1. Взаимодействие мембран нейтрофилов с СЗ фактором системы комплемента в условиях УФ-облучения 66
4.2. Влияние УФ-света на функциональное состояние мембраносвя-занного СЗ 68
4.3. Взаимодействие фотомодифицированных нейтрофилов с сывороточным СЗ 70
4.4. Влияние УФ-света на структурно-функциональное состояние сы-вороточного СЗ
4.5. Влияние УФ-света на локализацию CR1-рецепторов с лигандиро-ваннымСЗ на поверхности нейтрофилов ''
4.6. Определение роли фотомодификаций мембран нейтрофилов и белка СЗ в изменении антителосвязывающеи способности изучаемой системы
ГЛАВА 5. Исследование сочетанного действия УФ-света и фактора некроза опухоли а на функциональную активность нейтрофилов
5,1. Влияние сочетанного действия УФ-света и ФНОос на уровень спонтанной хемилюминесценции 84
5.2. Исследование уровня жизнеспособности УФ- и цитокинмодифи-цированных нейтрофилов с помощью красителя трипанового синего 88
5.3. Влияние сочетанного действия УФ-света и ФНОа на фагоцитарную активность нейтрофилов 90
5.4. Исследование сочетанного действия УФ-света и ФНОа на активность супероксиддисмутазы нейтрофилов
5.5. Исследование активности миелопероксидазы нейтрофилов в условиях сочетанного действия УФ-света и ФНОа 1и'
5.6. О процессах, ответственных за изменение функциональной активности УФ- и/или цитокинмодифицированных нейтрофилов
ГЛАВА 6. Влияние сочетанного действия УФ-света и фактора некроза опухоли а на структурно-функциональное состояние рецепторов им мунной адгезии
6.1. Исследование сочетанного действия УФ-света и ФНОа на структурно-функциональное состояние Fc-рецепторов с лигандированным иммуноглобулином G на мембранах нейтрофилов
6.2. Исследование сочетанного действия УФ-света и ФНОа на десорбцию молекул свободного и связанного на Fc-рецепторах иммуноглобулина G с УФ- и/или цитокинмодифицированных нейтрофилов
6.3. Исследование сочетанного действия УФ-света и ФНОа на структурно-функциональное состояние CR3 рецепторов на мембранах нейтрофилов "
6.4. О вкладе рецепторного аппарата в реализацию функционального потенциала нейтрофилов ' 4
ГЛАВА 7. Влияние УФ-света на цитотоксическую активность ней трофилов 147
7.1. Влияние УФ-света на продукцию оксида азота нейтрофилами крови человека 148
7.2. Влияние УФ-света на продукцию ФНОа нейтрофилами крови человека 152
7.3. Влияние УФ-света на активность супероксиддисмутазы нейтрфилов крови человека 157
7.4. Продукция оксида азота и активность супероксиддисмутазы УФ-
модифицированных нейтрофилов в присутствии циклогексимида 162
Заключение 167
Выводы 174
Список литературы
- Рецепторы и белки на поверхности нейтрофилов
- Выделение нейтрофилов из крови человека
- Влияние УФ-света на функциональное состояние мембраносвя-занного СЗ
- Исследование уровня жизнеспособности УФ- и цитокинмодифи-цированных нейтрофилов с помощью красителя трипанового синего
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время внимание исследователей привлекает вопрос об участии нейтрофилов в регуляции иммунного и других звеньев гомеостаза. Являясь наиболее лабильными и пластичными клетками крови, способными к быстрому реагированию на любые повреждающие воздействия, нейтрофилы формируют первую линию защиты организма. Реактивность нейтрофилов важно учитывать при включении их в патогенез как одного из ключевых эффекторов иммунокомплексного воспаления. С этой точки зрения изучение функционального потенциала нейтрофилов позволяет выявить резервные возможности фагоцитарного звена иммунитета, а также рассматривать изменения реактивности этих клеток в качестве индикаторов патологических нарушений.
В реализации эффекторных функций нейтрофилов особое место отводится продуктам секреции данных клеток. Активированные фагоциты продуцируют различные медиаторы воспалительных реакций, среди которых активные кислородные метаболиты и ряд цитокинов. Современные знания о цитокинах позволяют считать эти медиаторы иммунитета частью сложной цепи взаимодействующих молекулярных факторов, посредством которых работа различных систем организма становится скоординированной и регулируемой [71].
Использование в клинике при воспалительных процессах и других иммунопатологиях, обусловленных недостаточностью системы нейтрофилов, препаратов на основе естественных клеточных регуляторов — цитокинов — открывает большие перспективы. Среди рекомбинантных цитокинов, применяемых в современной медицине, интерес представляет фактор некроза опухоли а. Его мощное биологическое влияние на иммуногенез, воспалительные процессы и опухолевые клетки позволяет считать фактор некроза опухоли (ФНОа) многообещающим средством иммунотерапии онкологических, воспалительных, инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также при иммунодефицитах, трансплантации органов и тканей [123].
Несмотря на широкие перспективы использования ФНО в клинике, необходимо решить ряд проблем, связанных с подбором терапевтических концентраций, трудностью прогнозирования и контроля реакции организма на цитокиновую терапию.
Участие нейтрофилов в процессах распознавания возбудителя и формирования иммунного ответа во многом определяется внутриклеточным метаболизмом и структурно-функциональным состоянием рецепторного аппарата клеток [40]. Дефекты в работе ферментных систем и ослабление адгезивных взаимодействий нейтрофилов ведут к серьезным нарушениям фагоцитоза, что ослабляет неспецифический иммунитет и может служить причиной частого бактериального инфицирования. Однако бесконтрольное действие большого количества активированных нейтрофилов приводит к повреждениям тканей и органов собственного организма, развитию аутоиммунной агрессии. Все это определяет необходимость поиска эффективных методов воздействия на кровь и ее компоненты, корригирующих функциональное состояние фагоцитов.
Одним из методов иммунокоррекции является ультрафиолетовое облучение крови. Аутотрансфузия УФ-облученной крови в настоящее время широко используется при лечении гнойно-септических, сердечно-сосудистых и других заболеваний [51, 80]. В проведенных экспериментальных и клинических исследованиях установлен дезинтоксикационный, противовоспалительный, иммуномодулирующий эффект действия УФ-света [81, 97, ПО], его участие в структурно-функциональных перестройках рецепторного аппарата иммунокомпетентных клеток [22, 25, 45, 98, 220, 241], в процессах активации белков системы комплемента [3, 29, 30, 31], сывороточных иммуноглобулинов [103], модуляции уровня цитокинов [116, 200].
Несмотря на значительные успехи в изучении фагоцитарного звена иммунитета, исследование регуляторного действия УФ-света на функциональную (фагоцитарную, секреторную, адгезионную, цитотоксическую) активность нейтрофилов остается малоизученной областью фотоиммунологии. Практически отсутствуют работы, посвященные ' анализу взаимосвязи структурно-функциональных фотомодификаций фагоцитов с процессами их взаимодействия с сывороточными опсонинами, в частности белками системы комплемента, а также с медиаторами иммунного ответа - цитокинами. Необходимость таких исследований очевидна с точки зрения современных представлений о функциональной кооперации клеточных и гуморальных компонентов иммунной системы. Раскрытие закономерностей и механизмов действия УФ-излучения на клеточные и гуморальные звенья иммунной системы позволит теоретически обосновать практическое применение УФ-света в клинической практике.
Интерес представляет также изучение возможности регуляции активности фагоцитов сочетанным действием естественных модуляторов физической и химической природы (к примеру, УФ-света и фактора некроза опухоли). Так, использование ФНОа в различных концентрациях на фоне фотомодификации крови может способствовать повышению эффективности иммуно корригирующего действия АУФОК при лечении патологий различной степени тяжести.
Исследование механизмов, лежащих в основе регуляторного действия УФ-света и ФНОа на нейтрофилы, позволит выявить новые подходы к терапии клеточных дефектов фагоцитоза и иммуно коррекции.
Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось изучение структурно-функционального состояния нейтрофилов в условиях УФ-облучения и в присутствии фактора некроза опухоли а.
В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:
Изучить влияние УФ-света (240-390 нм) в диапазоне доз 75,5-^-2265 Дж/м на процесс взаимодействия нейтрофилов с СЗ фактором системы комплемента.
Выявить влияние УФ-света (75,5^-755 Дж/м ) и фактора некроза опухоли а (40-гЮОО пкг/мл) на фагоцитарную активность и состояние ферментных систем нейтрофилов.
Оценить вклад изменений структурно-функционального состояния рецепторов иммунной адгезии (FcR и CR3) на мембранах УФ- и/или ФНО- модифицированных нейтрофилов в модуляцию фагоцитарной активности данных клеток.
4. Исследовать цитотоксическую (ФНО-продуцирующую и N0"-секретирующую) способность нейтрофилов в условиях УФ-облучения (75,5-2265 Дж/м2).
Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным ' изучению структурно-функционального состояния нейтрофилов при действии УФ-света и ФНОа.
Впервые изучено влияние УФ-света на взаимодействие мембран нейтрофилов с СЗ фактором системы комплемента и выявлены основные закономерности, обусловливающие данный процесс. Установлено, что в основе структурно-функциональных фотомодификаций мембран нейтрофилов лежит эффект «кэппинга» рецепторов CR1 с лигандированным СЗ фактором комплемента.
Показано регуляторное действие УФ-света и ФНОа на фагоцитарную активность нейтрофилов. Рассматривается вклад различных процессов (пероксидного фотоокисления липидов, активности НАДФН-оксидазы, миелопероксидазы и супероксиддисмутазы) в изменение функционального потенциала фото- и ФНО-модифицированных нейтрофилов. Обсуждаются возможные пути изменения структурно-функционального состояния рецепторов иммунной адгезии (CR1, CR3, FcR), приводящие к повышению или понижению функциональной активности модифицированных фагоцитов.
Выявлено иммунокорригирующее действие УФ-света на уровень продукции NO* и фактора некроза опухоли а нейтрофилами; конечный эффект при этом определяется исходным уровнем исследуемых показателей и дозой УФ-света. Установлены корреляционные зависимости между уровнем генерации N0" и ФНО-продуцирующей способностью и СОД-активностыо нейтрофилов.
Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о молекулярно-клеточном механизме регуляторного действия УФ-света на функциональную активность нейтрофилов, являющихся важным звеном неспецифического иммунитета организма.
Изучение фотоиндуцированных структурно-функциональных изменений рецепторов CR1, CR3, FcR, через которые реализуются адгезивные взаимодействия нейтрофилов, важно при рассмотрении вопросов, связанных с выяснением механизмов действия УФ-света на молекулярно-клеточном уровне. Полученные экспериментальные данные позволяют выявить общие закономерности регуляторного действия УФ-света на процесс взаимодействия рецепторов нейтрофилов с соответствующими лигандами, в частности с СЗ фактором комплемента, что необходимо для решения проблемы опсонинзависимой регуляции фагоцитоза.
Данные, полученные при исследовании функциональной активности фотомодифицированных нейтрофилов в присутствии ФНОа (уровень процессов ПФОЛ, состояние систем генерации АКМ, антиоксиданти ой системы, рецепторного аппарата), могут быть использованы для оценки резервных возможностей иммунитета и определения глубины и динамики патологических сдвигов в организме.
Эксперименты с использованием фактора некроза опухоли а позволяют выработать новые подходы к иммунокоррекции патологических состояний организма при проведении фармакотерапии и определить возможность применения метода АУФОК на различных стадиях воспалительного процесса с целью повышения эффективности его использования.
Предложенная схема регуляторного действия УФ-света и ФНОа на функциональные свойства нейтрофилов может быть полезна для понимания молекулярных механизмов иммунокорригирующего действия метода АУФОК.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VIII международной конференции по химии и физико-химии олигомеров «Олигомеры-2002» (Черноголовка, 2002); 8-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2004); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); XIX съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (СПб., 2004); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2005); IV съезде фотобиологов России (Саратов, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов, в том числе 3 статьи в журналах системы РАН и РАМН.
На защиту выносятся следующие положения:
1. УФ-свет (240-390 нм) в дозах 75,5-2265 Дж/м2 индуцирует повышение антител ос вязываю щей способности СЗ компонента комплемента в системе из взаимодействующих нейтрофилов и белков системы комплемента.
2. УФ-излучение в дозах 75,5-755 Дж/м и ФНОсс в концентрациях 40-М 000 пкг/мл оказывают модулирующее действие на функциональное состояние нейтрофилов (системы генерации активных кислородных метаболитов и антиоксидантной защиты, рецепторный аппарат), изменяя фагоцитарную активность клеток.
3. УФ-свет (75,5-2265 Дж/м) усиливает антител ос вязы вающую способность CR3-рецепторов и вызывает разнонаправленные эффекты в отношении Fc-рецепторов с лигандированным IgG, зависящие от исходного уровня их сорбционной способности.
4. УФ-облучение нейтрофилов в дозах 75,5-2265 Дж/м2 оказывает корригирующее действие на генерацию NO" и продукцию ФНОсс данными клетками.
5. Схема возможных регуляторных процессов, приводящих к изменению функционального потенциала нейтрофилов в условиях УФ- облучения и в присутствии ФНОа.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 201 страницу машинописного текста, 15 таблиц, 43 рисунка. Состоит из «Введения», семи глав, «Заключения», «Выводов» и «Приложения». Список литературы содержит 272 источника, из них 128 - отечественных и 144 -зарубежных.
Рецепторы и белки на поверхности нейтрофилов
Взаимоотношения нейтрофилов с различными стимулами и типами клеток складываются на уровне плазматической мембраны, несущей рецепторы, трансформирующие поступающие сигналы в те или иные клеточные реакции. Рецепторы представляют собой, как правило, белки или гликопро-теины, располагающиеся на мембране и характеризующиеся высокой степенью сродства к биологически активным веществам широкого спектра действия. Особенности функционирования рецепторных структур во многом определяют гомеостаз клеток и характер их ответа на различные эндо- и экзогенные стимулы [9].
К настоящему времени известно, что Нф экспрессируют разнообразные мембранные рецепторы (табл. 2), которые осуществляют связь клеток с их микроокружением и регулируют функциональную активность фагоцитов: адгезию, миграцию, хемоктаксис, дегрануляцшо и поглощение [112].
Прочие НатрийуретическиЙ белок аденозин А2 Большинство реакций в системе опсонической кооперации, а также подключение фагоцитов в качестве основного эффектора иммунокомплекс-ного воспаления обеспечивают рецепторы к Fc-фрагментам иммуноглобулинов, в частности иммуноглобулину G [260]. Для связывания IgG существуют три различных рецептора: FcyRI, FcyRII, FcyRIII (соответственно CD64, CD32,CD16).
FcyRI (CD64) представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 72000 Да с высокой авидностью для мономерного IgG. В основном этот рецептор экспрессирован на мононуклеарных фагоцитах, однако, на Иф он появлялся после стимуляции интерфероном-у [232].
На покоящихся Нф находятся два рецептора для Fc-фрагмента IgG: FcyRII и FcyRIII. Оба рецептора низкой аффинности и связывают преимущественно агрегированные формы IgG, а также иммунные комплексы [186].
FcyRII (CD32) - гликопротеин с молекулярной массой около 40000 Да, существующий в шести различных изоформах, что позволяет говорить о наличии семейства FcyRII-рецепторов, которые, кроме Нф, присутствуют на моноцитах, макрофагах, тромбоцитах и В-лимфоцитах [259].
FcyRIII (CD16) - гликопротеин с молекулярной массой 50000-80000 Да, присутствующий на Нф, макрофагах и естественных киллерах и кодируемый двумя различными генами с высокой гомологией. Принципиальное различие между двумя формами заключается в том, что FcyRIII для Нф прикреплен к плазматической мембране через гликозилфосфатидилинозитол, a FcyRIII для макрофагов и естественных киллеров имеет типичный гидрофобный трансмембранный домен [214].
Все три типа рецептора опосредуют фагоцитоз бактерий и других клеток, опсонизированных IgG, участвуют в антителоопосредованной клеточной цитотоксичности фагоцитов в отношении клеток-мишеней, несущих на мембране комплексы антиген - антитело (IgG). В качестве клеток-мишеней могут выступать клетки, инфицированные вирусами, простейшими, или злокачест 23 венно трансформированные клетки самого организма. Через Fc-рецепторы опосредована индукция иммунными комплексами «респираторного взрыва» в фагоцитах, секреция ими ФНОа, ИЛ-6, лизосомальных ферментов [47, 118].
На поверхности Нф также обнаружен рецептор для IgA (FcccR). Он представляет собой белок с молекулярной массой 60000 Да и по структуре похож на FcaR, обнаруженный на мононуклеарных фагоцитах. Данные о влиянии FcaR на локомоторные функции Нф очень противоречивы. Так, часть авторов обнаружила угнетение хемотаксиса Нф по отношению к градиенту концентрации IgA, в то время как другие сообщают о повышении хемо-кинеза в присутствии IgA [188, 261]. Несмотря на отсутствие на поверхности Нф рецепторов для IgE, эти клетки способны взаимодействовать с ним через Мас-2/є IgE-связывающий белок, присутствующий на мембране. Данное взаимодействие, вероятно, приводит к активации метаболизма Нф иммунными комплексами, в состав которых входит IgE [253].
Потенциальными активаторами хемотаксиса и «респираторного взрыва» Нф являются полипептиды бактериального происхождения или их синтетические аналоги (формил-метионил-лейцилфенилаланил - f-MLP). Эти белки взаимодействуют с клетками через специфический рецептор (FPR) для фор-милсодержащих белков [147]. Липосахарид (ЛПС), полученный из грамотри-цательных бактерий, также взаимодействует с поверхностью Нф, связываясь с некоторыми лигаидами. Среди них белок, связывающий ЛПС (CD 14), и белок, повышающий проницаемость бактерий (ВІР), которые, будучи связанными с мембраной нейтрофила, активно связывают ЛПС. Известно, что ЛПС, оказывая праймирующее действие на Нф, ингибирует их апоптоз [33].
Установлено наличие на поверхности нейтрофилов специфического рецептора для нейтрофилактивирующего пептида-1 (NAP-1) или ИЛ-8 [216], рецептора для метаболита арахидоновой кислоты - лейкотриена В4 (LTB4) [167]. Являясь высокоактивным биологическим соединением, лейкотриен В4 способен вызывать хемотаксис и агрегацию лейкоцитов, стимулировать их биохи 24 мическую активность, а также высвобождение лизосомальных ферментов [118].
Большое значение для понимания роли Нф в воспалении имеет наличие на этих клетках рецепторов (Hi и Н2) для гистамина. При взаимодействии с Hi-рецептором на мембранах лейкоцитов гистамин способен вызывать «респираторный взрыв», сопровождающийся выбросом АФК, инициирующих ПОЛ. Данная реакция лежит в основе медиаторного действия гистамина при воспалении. Через Н2 реализуются противовоспалительные эффекты, к числу которых в первую очередь относятся торможение хемотаксиса и выделение лизосомальных ферментов [9].
Выделение нейтрофилов из крови человека
Нейтрофилы выделяли центрифугированием донорской крови на двойном градиенте плотности фиколл-урографина (р=1,077 и 1Д 19 г/мл) [6]. Для этого готовили рабочие растворы: раствор № 1: 7,64 г фиколла, 20 мл 76 % раствора урографина, 92,56 мл дис-тилированной воды (р=1,077 г/мл) - раствор №1; раствор № 2: 2,74 г фиколла, 10 мл 76 % раствора урографина, 35,6 мл дисти-лированной воды (р=1,119 г/мл) - раствор №2.
К 3 мл гепаринизированной крови (20 Ед/мл) добавляли раствор Хен-кса в соотношении 1:1. В центрифужную пробирку вносили 1 мл раствора № 2, осторожно наслаивали 1 мл раствора № 1 на раствор № 2. Затем на двойной градиент фиколла-урографина наносили разбавленную кровь. Центрифугировали в течение 40 минут при 3000 об/мин (480 g) на центрифуге MPW-340. Наблюдали три хорошо выраженные фракции (рис. 3): 1) фракция на границе плазмы и раствора № 1, состоящая из моноцитов и лимфоцитов; 2) фракция на границе растворов № 1 и № 2, состоящая из нейтрофилов; 3) эритроциты. / кровь .раствор №2 -раствор № G-480g плазма 2 Рис. 3. Схема выделения нейтрофилов
Полученную фракцию нейтрофилов центрифугировали в избытке раствора Хенкса в течение 10 минут при 1000 об/мин на центрифуге MPW-340. Отмытые нейтрофилы суспензировали раствором Хенкса до рабочей концентрации.
Для проверки чистоты полученной суспензии нейтрофилов делали мазки, которые затем окрашивали по методу Романовского-Гимзе. В полученной клеточной суспензии нейтрофилы составляли 93 % всех клеток, 5 % приходилось на долю лимфоцитов и около 2 % на долю моноцитов.
Источником человеческой сыворотки явилась кровь доноров. Цельную кровь (без добавления антикоагулянта) отбирали в сухую стерильную посуду и оставляли на 2-3 часа при +4 С до образования кровяного сгустка. После ее центрифугирования в течение 15 минут при 1500 об/мин на центрифуге MPW-340 супернатант отбирали в чистую сухую пробирку.
УФ-облучение суспензии нейтрофилов в соответствующих опыту концентрациях и сыворотки крови доноров в соответствующем разведении объемом 2 мл проводили в стеклянной термостатируемой (20±1 С) полусфери-ческой формы кювете сверху (площадь облучаемой поверхности 10" м ) при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки (магнитная ме 48
шалка типа ММ-ЗМ) излучением ртутно-кварцевой лампы ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания в области 240-390 нм. Интенсив-ность излучения - 151 Дж/м в минуту с учетом расстояния до облучаемого объекта 0,23 м. Дозы облучения нейтрофилов составили 75,5; 453; 755 и 2265 Дж/м2, сыворотки крови - 75,5; 453 и 755 Дж/м2.
Инкубация нейтрофилов с фактором некроза опухоли а
К 1 мл суспензии нативных и фотомодифицированных нейтрофилов в концентрации 1-Ю6 клеток/мл добавляли ФНОа в конечных концентрациях 40, 200, 500 и 1000 пкг/мл и проводили инкубацию клеток в течение 30 мин. при температуре 37 С. В работе использовали коммерческий препарат ФНОа (производство ООО «Протеиновый контур», СПб.).
Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA - enzyme linked immunosorbent assay) широко применяется для выявления антигенов и антител в сыворотке крови и на поверхности клеточной мембраны. Он относится к простым, чувствительным, быстрым и хорошо воспроизводимым методам [109].
Проведение твердофазного ИФА основано на следующих 4 принципах:
1. Различные ферменты, наибольшее распространение из которых получили пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, можно ковалентно присоединить к антигенам или антителам различными химическими методами, при этом оба компонента конъюгата сохраняют свою биологическую активность.
2. Большинство антигенов самопроизвольно сорбируются на поверхности пластика (например, в лунках полистироловой панели). Именно на этом принципе основан первый этап реакции, заключающийся в «сенсибилизации» панелей антигенами или антителами. Адсорбированные на твердой фазе антигены и антитела уже не смываются буфером, содержащим детергент, тогда как несвязавшиеся компоненты легко удаляются отмыванием.
3. Затем в «сенсибилизированных» лунках инкубируют исследуемый образец и стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы, состоящие из одной или нескольких слоев. Несвязавшиеся компоненты на каждом этапе удаляются отмыванием, что позволяет добиться высокой специфичности анализа в реакции входяще го в состав конъюгата фермента с индикаторным субстратом.
4. При связывании конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент с иммобилизованным иммунным комплексом, активный центр фермента остается доступным для взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию останавливают на нужной стадии, а степень окрашивания оценивают визуально, сравнивая со стандартами, или инструментально по оптической плотности.
Метод ИФА был использован нами для определения CR1-рецептора (CD35), лигандированного с СЗ белком системы комплемента, уровня Fc-рецепторов (CD16 и CD32) и СЯЗ-рецептора (CDllb/CD18, Мас-1) на поверхности нативных и модифицированных нейтрофилов.
Изучение изменений рецепторных свойств мембран нейтрофилов по отношению к СЗ фактору комплемента после УФ-облучения проводили с помощью специально разработанных нами тестов на основе твердофазного ИФА на полистироловых 96-луночных планшетах.
Реакцию по образованию иммунного комплекса осуществляли со спе цифическими антителами против СЗ компонента комплемента (производство МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского). Методика проведения ИФА предусматривала последовательное нане сение на поверхность полистироловых планшет суспензии нейтрофилов, 1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА), сыворотки крови доноров, как ис точника СЗ, и антител к СЗ, конъюгированных с ферментной меткой - перок сидазой хрена (Пх), их инкубацию при 37 С в течение 1-1,5 часа и отмывку несвязавшихся компонентов промывочным буфером после каждой стадии. В , зависимости от целей эксперимента один из компонентов системы (нейтро филы или сыворотка) мог быть удален.
Влияние УФ-света на функциональное состояние мембраносвя-занного СЗ
В данной серии экспериментов (рис. 9 (1)) на 96 луночные полистироловые планшеты последовательно иммобилизовались нативная или подвергнутая УФ-облучению суспензия Нф, 1 %-ный раствор БСА, нативная или УФ-облученная сыворотка и конъюгат антител против СЗ с пероксидазой хрена. После иммобилизации нейтрофилов на носителе производили их гипоосмоти-ческий лизис дистиллированной водой. УФ-облучение Нф и сыворотки в системе (Нф+С) +Ат(СЗ)-Пх в дозах Нф+С+Ат(СЗ)-Пх - - Нф+С) +Ат(СЗ)-Пх С+Ат(СЗ)-Пх -2- С +Ат(СЗ)-Пх 4 г1 Нф+С+Ат(СЗ)-Пх — Нф +С+Ат(СЗ)-Пх Нф+С+Ат(СЗ)-Пх- - Нф+С +Ат(СЗ)-Пх Рис. 9. Схема постановки экспериментов по изучению структурно-функциональных УФ-модификаций белка СЗ и мембран нейтрофилов Условные обозначения: жирный шрифт - контрольная система, нормальный шрифт - опытная система; Нф -иммобилизованные нативные нейтрофилы крови доноров; С - сыворотка крови доноров как источник СЗ фактора комплемента; Ат(СЗ)-Пх - конъюгат пероксидазы хрена с антителами к СЗ компоненту комплемента; - УФ-облученный в дозах 75,5; 755 и 2265 Дж/м2 компонент ИФА-системы 75,5; 755 и 2265 Дж/м приводило к достоверному, усиливающемуся с ростом дозы УФ-света повышению оптической плотности детектируемого продукта реакции на 0,037; 0,060 и 0,115 ед, опт пл. по отношению к системе Нф+С+Ат(СЗ)-Пх, где все рассматриваемые компоненты были необлученными (рис. 10). Это указывает на увеличение способности находящегося в системе СЗ компонента взаимодействовать с антителами против него. Наблюдаемый эффект возрастания антителосвязывающей способности СЗ в исследуемой системе может быть следствием увеличения количества СЗ компонента в УФ-облученной сыворотке и на мембранах фотомодифицированных Нф или в одном из этих компонентов.
В изучаемой многокомпонентной системе (Нф+С) +Ат(СЗ)-Пх можно выявить лишь суммарный вклад отдельных ее составляющих, подвергнутых воздействию УФ-излучения. При этом нельзя оценить вклад фотомодификаций каждого из исследуемых компонентов. Вследствие этого нами были проведены эксперименты, позволяющие исключить один из взаимодействующих компонентов системы - Нф или сыворотку, как источник СЗ (рис. 9 (2,4)), или же, сохранив систему полностью, только один из компонентов подвергнуть УФ-облучению (рис. 9 (3,5)). Таким образом нами предполагалось определить вклад фотомодификаций каждого компонента в суммарное УФ-индуцированное изменение антителосвязывающей способности всей системы (Нф+С) +Ат(СЗ)-Пх.
Влияние УФ-света на функциональное состояние мембраносвязанного СЗ
В данной серии экспериментов исследовали систему Нф +Ат(СЗ)-Пх (рис. 9 (2)), где по изменению антителосвязывающей способности лигандиро-ванного на мембранах СЗ судили не только о его функциональных УФ-модификациях, но и о процессах структурно-функциональных превращений самих мембран Нф. Под лигандированным (мембраносвязанным) СЗ подразумевали связавшийся с рецепторами CR1 в условиях in vivo белок СЗ системы УФ-индуцированные изменения антителосвязывающей способности сывороточного и мембраносвязанного СЗ в системе (Нф+С) +Ат(СЗ)-Пх за контроль принято значение оптической плотности ИФА-системы Нф+С+Ат(СЗ )-Пх (D492=0,161) dtp - средняя разность между значениями D492 опытных и контрольных образцов комплемента [63]. При этом на планшеты наносили нативные или УФ модифицированные в дозах 75,5; 755; 2265 Дж/м2 Нф, а затем конъюгат.
Иммобилизация на носителе УФ-облученных клеток индуцировала возрастающее с ростом дозы усиление ИФА-сигнала на 0,027; 0,051 и 0,064 ед. опт. пл. (рис. 11), что свидетельствует об увеличении числа сорбированных на мем бранах фагоцитов антител к СЗ компоненту. Так как в данной системе не было дополнительного источника СЗ, то наблюдаемые изменения можно объяснить такого рода структурными фотомодификациями мембран Нф, которые приводят к антигенному дрейфу, меняя тем самым общую картину набора и локализации антигенных детерминант и рецепторов на поверхности клетки.
Исследование уровня жизнеспособности УФ- и цитокинмодифи-цированных нейтрофилов с помощью красителя трипанового синего
Таким образом, УФ-свет и ФНОа отдельно и при сочетанием действии могут выступать как в роли иммуностимуляторов по отношению к фагоцитарной активности Нф, так и оказывать негативное влияние на функциональное состояние иммуноцитов. Конечный эффект совместного действия УФ-облучения и ФНОа определяется дозой УФ-света и в преобладающей степени концентрацией цитокина. Эффект повышения фагоцитарной активности наиболее выражен при сочетанном действии УФ-света в дозе 75,5 Дж/м и ФНОа в концентрации 40 пкг/мл. Совместное действие УФ-света и ФНОа в высоких концентрациях (200; 500 и 1000 пкг/мл) носит противоположный характер. Повышение концентрации цитокина индуцирует значительное снижение фагоцитарной активности фотомодифицированных Нф, причем уровень снижения интенсивности ХЛ увеличивается пропорционально повышению концентрации ФНОа. Максимальный эффект снижения функциональной активности Нф наиболее выражен при совместном действии УФ-света в диапазоне доз 75,5- 755 Дж/м и цитокина в концентрации 1000 пкг/мл (рис. 18,22).
Явление увеличения функционального потенциала фагоцитов в процессе предварительного воздействия стимулирующих агентов получило название «прайминг». Прайминг фагоцитов является первой стадией активации клеток и выражается в увеличении ответа Нф на последующую стимуляцию, определяемом в виде индекса прайминга (ИП), в сокращении лаг-периода развития ответа клеток на стимуляцию и повышении скорости развития ответной реакции. Он может быть вызван действием большого набора эндогенных и экзогенных факторов (праймеров), среди которых - ФНОа и оптическое излучение [53,226].
Для оценки праймирующего эффекта действия УФ-излучения и ФНОа, а также их совместного влияния нами был рассчитан индекс праймирования (ИП). Последний вычисляли как соотношение максимальных интенсивностей люминолзависимой хемилюминесценции модифицированных и нативных Нф и выражали в относительных единицах (отн. ед.) [53].
Прайминг фагоцитирующих клеток можно разделить на два типа: кратковременный (время прединкубации до 1 часа) и пролонгированный, характерный в основном для макрофагов (время прединкубации 5-40 часов). Кратковременный тип прайминга характеризуется следующими особенностями: - эффект прайминга вызывается воздействием низкой концентрации прайми-рующего агента в течение нескольких минут; - эффективность мала, величина ИП лежит в пределах 2-4.
Важным этапом данного типа прайминга является увеличение содержания внутриклеточного Са2+ и нечувствительность к присутствию ингибиторов синтеза белка- цикл ore ксимида и пуромицина [227].
Анализ полученных данных (табл. 9) показал, что индекс праймирую-щего действия УФ-света и ФНОа как в отдельности, так и в сочетании друг с другом лежит в пределах 2 отн. ед. Это, а также анализ кривых ХЛ ответа и временных характеристик фагоцитоза УФ- и/или цитокинмодифицированных Нф, свидетельствует о кратковременном типе прайминга, вызываемом данными стимуляторами.
Как видно из табл. 9, увеличение концентрации ФНОа меняет направленность действия цитокина, достигая максимальной стимулирующей активности в концентрации 40-200 пкг/мл и снижая прайминг фагоцитов при воздействии его в концентрации 1000 пкг/мл.
Праймирующий эффект сочетанного действия УФ-облучения (75,5 755 Дж/м ) и ФНОа (40 1000 пкг/мл) определяется дозой УФ-света и концентрацией цитокина. Праймирующая активность совместного влияния модификаторов максимально проявляется при сочетании УФ-излучения в дозе 75,5 Дж/м и ФНОа в концентрации 40 пкг/мл (табл. 9). С повышением дозы и концентрации модификаторов их стимулирующая способность снижается, достигая наибольшего падения при инкубации фотомодифицированных в дозе 755 Дж/м Нф с ФНОа в максимальной концентрации 1000 пкг/мл.
Состояние предактивированности (прайминга) Нф имеет первостепенное значение в антиинфекционной резистентности организма, так как такие фагоциты появляются в зоне внедрения патогена в более подготовленном состоянии и значительно эффективнее могут выполнять свои эффекторные функции.
Механизм прайминга до конца не ясен. Во многом он определяется природой праймирующих субстанций, которые могут задействовать различные пути биологических реакций, запускающих этот процесс [93]. Предполагают, что увеличение функционального потенциала фагоцитов в процессе прайминга есть следствие модификации механизма трансдукции сигнала взаимодействия рецептор - стимулятор на внутриклеточные ферментативные системы с последующей их активацией, а также увеличения количества и аффинности поверхностных рецепторов [193, 240]. Как известно из литературных данных [53, 54], модуляция фагоцитарной активности фагоцитов может быть обусловлена изменением: 1. физического состояния липидной фазы клеточных мембран; 2. активности НАДФН-оксидазного комплекса; 3. активности ферментов антиоксидантной системы; 4. количества и аффинности поверхностных рецепторов фагоцитов.
