Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
I.I. Молекулярные механизмы клеточной адгезии. Роль факторов сыворотки крови в адгезии клеток 7
1.1.1. Роль адгезионных взаимодействий клеток в основных биологических процессах 7
1.1.2. Исследование адгезии клеток к субстрату 10
Роль сыворотки крови в адгезии клеток к субстратам 18
I.I.3 . Межклеточная адгезия 28
Влияние сыворотки крови на межклеточную адгезию 39
1.2. Факторы сыворотки крови, проявляющие ростстимулирующую активность 42
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 57
2.1. Сыворотки .... 57
2.2. Растворы » 57
2.3..Метод выделения и очистки адгезина из сыворотки крови 58
2.4. Определение стабильности адгезина в различных условиях 61
2.5. Исследование комплекса адгезина с "носителем" в сыворотках взрослых особей .. 62
2.6. Определение аминокислотного состава адгезина из сыворотки крупного рогатого скота...62
2.7. Определение биологической активности адгезина 63
2.7.1. Определение адгезионной активности ..... 63
. 2.7.2. Определение действия адгезина на пролиферацию фибробластов китайского хо
мячка в культуре 66
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 68
3.1. Выделение, очистка и свойства адгезина из сыворотки крови 68
3.1.1. Выделение.адгезина из сывороток. ... крови 68
3.1.2. Метод очистки адгезина из сыворотки
крови 71
3.1.3. Аминокислотный состав адгезина 81
3.1.4. Стабильность препаратов адгезина 86
3.1.5. Молекулярный вес адгезина 88
3.1.6. Исследование состояния адгезина в . сыворотках в развитии 91
3.2. исследование биологического действия ад- ...
гезина 100
3.2.1. Взаимодействие адгезина с клеточной поверхностью и его влияние на адгезию . клеток 100
3.2.2. Исследование влияния адгезина.на пролиферацию клеток 109
3.3. исследование адгезина из лейкоцитарной
сыворотки 118
ЗШЖИЕНИЕ 126
ВЫВОДЫ 131
ЛИТЕРАТУРА 133
ПРИЛОЖЕНИЕ ., 161
- Молекулярные механизмы клеточной адгезии. Роль факторов сыворотки крови в адгезии клеток
- Сыворотки
- Выделение, очистка и свойства адгезина из сыворотки крови
Введение к работе
Сыворотка крови - богатый источник биологически активных соединений. Использование сыворотки крови в качестве компонента питательных сред выявило ее способность оказывать стимулирующее влияние на рост клеток ин витро. В свою очередь рост культуры представляет собой последовательность нескольких процессов: адгезии клеток, их выживания и деления. Каждый из этих процессов регулируется эндогенными факторами, в том числе сывороточными.
Известно, что установление адгезионных взаимодействий является необходимым условием роста в культуре подавляющего большинства нормальных клеток. Эти взаимодействия включают адгезию клеток к подложке, а также образование межклеточных контактов. Из сыворотки крови выделено несколько факторов белковой природы, усиливающих взаимодействие клеток друг с другом i0rr,Roseman,i969bl, ИХ адгезию И миграцию по субстрату і Leonard, Skeel,l976; Knox, Griffiths,1979; Pearlstein et al.,1980; Stenn,1981 I, Для наиболее изученного из этих веществ - фибронектина - показана способность не только стимулировать адгезию клеток, но и оказывать влияние на их морфологию и пролиферацию. Причем, цролиферативная и морфогенетическая активности этого вещества опосредованы его взаимодействием С клеточной поверхностью I Yamada,Olden, 1978; Yamada,Kennedy,1979; Olden et al.,1980; Weiss,Reddi,1981 I.
В сыворотке крови также обнаружен ряд факторов, оказывающих влияние на пролиферацию клеток I Hoffman et al.,1973; Fryklund et ai.,1974; Ptashne et ai.,1979 I. Действие на адгезию клеток для большинства из этих веществ не изучалось. Тем не менее, многочисленные данные указывают на регуляторную роль поверхности и адгезионных взаимодействий клеток в пролиферативных процессах 1см.: Васильев, Маленков, 1968, Маленков, 1976;Abercrombie,Ambrose,1962; Pardee, 1971 I. Например, было показано, что адгезионные факторы, выделенные с поверхности клеток морских губок и некоторых тканей млекопитающих, оказывают влияние на основные внутрисин-тетические процессы в клетках: синтез белка, РНК, ДНК ТМаленков и др., 1978; Muller et al. , 1976а 1. Кроме того,ряд данных свидетельствует о том,что рецепторы к некоторым веществам,влияющим на пролиферацию клеток (лектины,пептидные гормоны,факторы роста, кейлоны) расположены на клеточной мембране.Результатом взаимодействия этих веществ с клеточной поверхностью являются структурные перестройки в плазматической мембране,которые могут сопровождаться как изменением ее проницаемости и активности некоторых мембранных ферментов, так и изменением топографии рецепторов клеточной поверхности 1см.: Маленков, 1976; Кетлинский, 1980; Балаж, Блажек, 1982; ciemmons et al., 1980 І. Таким образом, можно предполагать, что некоторые эндогенные факторы, оказывающие влияние на пролиферацию, связываются с клеточной поверхностью и вызывают изменения в плазматической мембране. Б конечном итоге эти изменения могут проявляться в изменении адгезионных свойств клеток. В связи с этим представляется целесообразным определение адгезионной активности ряда факторов, проявляющих цролиферативную активность и, наоборот, " исследование действия на пролиферацию клеток веществ, у которых обнаружена мембранотропная активность. Возможно, что корреляция этих двух типов активности будет установлена не для всех факторов, влияющих на адгезионные или проли-феративные свойства клеток. Однако, такой подход, очевидно, поз- волит выявить класс веществ, осуществляющих регуляцию пролиферации клеток опосредованно через их поверхность.
Основным объектом настоящего исследования являлся неспецифический адгезионный фактор, ранее обнаруженный в сыворотке крови крыс I Ямскова, 1977 1. Этот фактор был назван нами "адгези-ном".
Целью работы являлась идентификация адгезина в сыворотках различных животных и человека и исследование его действия на клеточную адгезию и пролиферацию.
Задачи исследования включали: I) разработку легко воспроизводимого метода выделения и очистки адгезина из сыворотки крови животных и человека; 2) проведение сравнительного исследования физико-химических свойств и биологической активности адгезина, выделенного из сывороток различных животных и человека, в том числе и из лейкоцитарной сыворотки, обладающей ранозаживляющим действием; 3) исследование фактора сыворотки тремя адгезиометри-ческими методами, позволяющими установить его взаимодействие с клеточной поверхностью, а также влияние на прочность плазматической мембраны и межклеточных контактов в тканях печени и легкого мышей ин витро; 4) исследование влияния адгезина на пролиферацию фибробластов китайского хомячка ин витро; 5) исследование состояния адгезина в сыворотке крови животных в развитии.
Молекулярные механизмы клеточной адгезии. Роль факторов сыворотки крови в адгезии клеток
Адгезионные взаимодействия клеток играют важную роль в формировании и поддержании сложных морфологических структур тканей И органов ІСМ.: ТриНКаус, 1972; Marchase et al.,1976}FraZier,Glaser,
1979 I. Наличие межклеточных контактов необходимо для поддержания клеточного и тканевого гомеостаза, а именно: для осуществления транспорта ионов и питательных веществ в клетку, вывода из клетки продуктов метаболизма и обмена информацией между клетками
Ряд данных указывает на связь между адгезионными взаимодействиями клеток и регуляцией важнейших биологических процессов, таких как морфогенез и дифференцировка
В качестве примера такой связи можно привести взаимодействие сетчатки и ретинального пигментного эпителия глаза, происходящих в развитии из общего зачатка и тесно связанных функционально Шпатов, Строева, 1963 I. На ранних стадиях диф-ференцировки пигментного эпителия нарушение его взаимодействия с сетчаткой приводит к метаплазии пигментного эпителия в сетчатку ІСтроева, 1971; Coulombre,Coulombre,19655Coulombre,197C 3# Кроме того, при нарушении контактных взаимодействий между клетками этих двух тканей при культивировании ин витро не происходит образования НаруЖНЫХ СЄГМ6НТОВ фОТОрецепТОрОВ СеТЧаТКИ t Fugisawa
et ai.,i974Jt ЕщЄ одним интересным примером является изменение цитодифференцировки клеток эмбриокарциномы. Эти клетки остаются недифференцированными в течение длительного времени при культивировании в виде суспензии. Прикрепление клеток к поверхности сосуда или образование агрегатов является пусковым сигналом, приводящим К ИХ диффербнцировке ETeresky et al.,1974jMartin,1975, 1978; Hicolae et al.,1976 j. Исследованы компоненты поверхности клеток тератокарциношл которые участвуют в адгезии этих клеток и, по мнению авторов, могут определять их диффбренцировку
IGrabel et al.,1979jOppenheimer,1975 I. В ЭТОМ плане следует
также упомянуть работы, посвященные изучению роли клеточной поверхности слизиевых грибов в адгезии и дифференцировке этих организмов. Для слизиевых грибов описаны две основные фазы развития. Первая фаза - существование недифференцированных одиночных клеток. Вторая фаза - образование агрегатов клеток с последующей дифференцировкой, приводящей к появлению плодовых тел 1см.: Тринкаус, 1972; Gerisch, 1968 3. С поверхности клеток этих организмов были выделены и идентифицированы гликоцротеины, которые участвовали в клеточной адгезии и в дифференцировке слизиевых грибов I Rosen et al.,1975} Alton,Zodish,1977jMuller,Gerisch, 1978; Geltosky et al.,1979 ].
-9 Интересно отметить, что в ходе развития антигены клеточной поверхности, в том числе и адгезионные факторы, претерпевают изменения 1см.: Любимов, 1981 1. Например, непосредственно перёд рождением (или вылуплениём из яйца) снижается количество сиаловой кислоты в молекуле фактора адгезии клеток сетчатки глаза (и -САМ) lEdelman, 1983 I.
Сыворотки
Для исследования были использованы сыворотки крови млекопитающих животных (крысы, собаки, лошади, крупного рогатого скота), человека, птиц (куриные эмбрионы).
Сыворотки крови собаки, беспородных крыс весом 200 г, а также куриных эмбрионов (белый Леггорн) после 8-15 и 19-дневной инкубации получали из цельной крови следующим образом. Цельную кровь инкубировали при 37 С в течение 1,5 часов, затем выдерживали при 4 С в течение 4 часов. Сыворотку отбирали, центрифугировали при 2000 g и замораживали при -20 С для дальнейшего использования.
Сыворотку человека получали центрифугированием (2000 g ) плазмы крови доноров (группа А), предоставленной Центральным НИИ гематологии и переливания крови МЗ СССР.
Сыворотки лошади (нативная и лейкоцитарная) были получены по описанным ранее методикам І Хрущов, Скурская, 1966 1 и любезно предоставлены сотрудником лаборатории гистогенеза (зав. лаб. членкору. АН СССР Н.Г.Хрущов) Института биологии развития им. Н.К. Кольцова АН СССР - ст. н.с. Э.И.Буеверовой.
Использовали также готовые сыворотки крупного рогатого скота (Московский мясокомбинат) и эмбрионов крупного рогатого скота (" Serva ", ФРГ; НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР).
Выделение, очистка и свойства адгезина из сыворотки крови
Ранее в сыворотке крови крыс был обнаружен низкомолекулярный адгезионный фактор І Ямскова, 1977 3. Как было показано, этот фактор одинаково способствовал адгезии клеток печени и легкого мышей и представлял собой термостабильный углеводсодержащий биополимер, не осаждающийся в насыщенном растворе сульфата аммония. Эти данные явились основой настоящего исследования, посвященного поиску этого фактора в сыворотках крови других млекопитающих. С этой целью были исследованы сыворотки крови крысы, собаки, лошади, крупного рогатого скота, человека, а также сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота и куриных эмбрионов.
Лля выделения фактора сыворотку крови насыщали сульфатом аммония до 100 %. При этом практически все сывороточные белки выпадали в осадок.Во всех случаях адгезионная активность (адгезия)
Примечание. Результаты определения адгезионной активности во фракциях, полученных в процессе выделения, очистки и исследования физико-химических свойств адгезина, представлены в разделе 3.2.1 настоящей главы, а также в Приложении.
