Введение к работе
Актуальность проблемы. Гибель клеток в результате апоптоза - основное свойство практически всех клеток (M.D. Jacobson et al., 1997). Это обязательный процесс нормального развития органов, тканевого гомеостаза, развития нервной системы и регуляции иммунной системы. Недостаточная или избыточная гибель клеток ведет к различным заболеваниям человека, включая злокачественные образования, дегенеративные заболевания, иммунодефицитные состояния (СВ. Thompson, 1995). Высокая степень координации и стереотипность процессов индуцированной гибели клеток свидетельствуют о том, что клетки активируют типовую программу гибели, к которой сводятся разнообразные пути сигнальной трансдукции (A.M. Chinnaiyan, V.M. Dixit, 1996; E. White, 1996; J. Yang, 1997).
К настоящему времени накоплены обширные сведения о типах программированной клеточной гибели, ее морфологических проявлениях, путях реализации, основных «участниках» и регуляторах апоптоза (Е.Б. Владимирская, 2002).
Вместе с тем отсутствуют детальные представления о взаимосвязи отдельных этапов программированной клеточной смерти, составляющих ее основные независимые фазы: инициацию, эффекторную фазу и деградацию, и оценке их временных характеристик. Не менее значимыми представляются вопросы, касающиеся изучения способов инициации различных путей апоптоза (рецепторопосредованного, митохондриального, каспазонезависимого и др.), выяснения точек («сайтов») их интеграции и возможности целенаправленного регулирования процессов клеточной гибели при помощи физико-химических агентов.
Поскольку апоптоз - физиологическое явление, то в организме должны быть факторы, приводящие к ПКГ. В настоящее время известно, что таковыми могут быть как внутриклеточные сигналы, так и внешние, опосредующие свое действие через рецепторные системы, которые сами по себе не являются токсическими или деструктивными. Это могут быть неспецифические факторы, такие как температура, токсические агенты, оксиданты, свободные радикалы, гамма- и УФ-излучение, бактериальные токсины и др. Во всех этих случаях происходит индукция апоптоза, но при увеличении дозы соответствующего агента развивается некроз клетки (Т.А. Ушакова и др., 2004).
УФ-свет известен как потенциальный индуктор апоптоза в различных типах клеток (И.Ф. Донская и др., 1997). Показано, что УФ-свет может индуцировать апоптоз в клетках некоторых лимфоидных линий. Известно, что апоптоз иммунокомпетентных клеток в условиях УФ-В-излучения запускается СБ95(Ра8/Аро-1)-рецепторно/лигандной системой (R. Caricchio et al, 1998). Однако молекулярные механизмы этого процесса и последовательность начальных этапов развития клеточной гибели в условиях облучения изучены далеко не полностью. Остаются открытыми вопросы, касающиеся выявления спо-
4 собов запуска различных путей реализации апоптоза в условиях воздействия УФ-света.
Особое внимание в последние годы уделяется изучению роли активированных кислородных метаболитов в развитии апоптоза. Известно, что программированная гибель клеток, как правило, сопровождается образованием значительного количества активных форм кислорода. В то же время АФК способны инициировать апоптоз в различных типах клеток (О.Ю. Плетюшкина и др., 2006). Показано (В.В. Новицкий и др., 2008), что интенсификация внутриклеточной продукции АФК связана с вовлечением митохондриального и TNFR(tumor necrosis factor гесер1ш)-опосредованного путей. Однако, несмотря на очевидную взаимосвязь окислительного стресса с апоптозом, роль АКМ в саморазрушении клеток неясны (Н.К. Зенков и др., 1999).
В связи с вышеизложенным нами были исследованы механизмы и последовательность этапов программированной клеточной гибели лимфоцитов крови доноров в условиях воздействия УФ-света и активных форм кислорода.
Цель и задачи диссертационной работы. Целью работы явилось выявление путей реализации апоптоза лимфоцитов периферической крови доноров, индуцированного воздействием УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода).
Задачи работы предусматривали:
Исследование изменений уровня экспрессии мембранных рецепторов смерти CD95 (Fas) лимфоцитов человека после воздействия УФ-света и АФК.
Исследование изменений функциональной активности эффекторной каспазы-3 лимфоцитов доноров после УФ-облучения клеток и генерации АФК.
Изучение структурных модификаций ДНК лимфоцитов человека в динамике развития апоптоза, индуцированного воздействием УФ-излучения и АФК.
Исследование изменений уровня белка р53 в лимфоцитах доноров после УФ-облучения клеток и генерации АФК.
Исследование изменений уровня цитохрома с в цитозоле и структурного состояния митохондриальных мембран лимфоцитарных клеток после воздействия УФ-света и АФК.
Научная новизна. Впервые изучены изменения структурного состояния ДНК, уровня экспрессии мембранного Fas-рецептора, функциональной активности каспазы-3, концентрации белков р53 и цитохрома с лимфоцитарных клеток человека в динамике развития апоптоза, индуцированного воздействием УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, сингл етного кислорода). Установлено, что УФ-свет и АФК индуцируют фрагментацию ДНК лимфоцитов после 20 ч инкубации модифицированных клеток. Показано, что в течение 1-5 ч после воздействия УФ-света и АФК
5
на лимфоциты наблюдается повышение уровня экспрессии
мембранных Fas-рецепторов смерти по сравнению с интактными клетками. Обнаружено увеличение функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов через 4 ч после генерации синглетного кислорода, гидроксильного радикала и добавления пероксида водорода, а также через 8и24и6и8ч после УФ-облучения клеток соответственно в дозах 151 и 1510 Дж/м . С использованием метода ДНК-комет выявлено, что повреждения ДНК (двунитевые разрывы) по-являются сразу после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 1510 и 3020 Дж/м и добавления пероксида водорода в концентрации 10" моль/л (кометы типа С1) и достигают максимума через 6 ч после модификации клеток (кометы типов С2 и СЗ). Установлено, что через 6 ч после воздействия пероксида водорода и УФ-света в дозах 1510 и 3020 Дж/м на лимфоциты происходит повышение уровня р53 в исследуемых клетках. Сделано заключение о ведущей роли рецепторо-посредованного (Fas-зависимого) каспазного и р53-зависимого путей в реализации апоптоза лимфоцитов, индуцированного воздействием УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м и пероксида водорода (10" моль/л). Предложена схема возможных внутриклеточных событий, приводящих к апоптотической гибели лимфоцитов после их УФ-облучения.
Практическая значимость. Теоретические положения диссертационной работы углубляют современные представления о путях и механизмах реализации апоптоза иммунокомпетентных клеток человека, индуцированного воздействием физико-химических факторов. Они могут быть использованы для разработки способов целенаправленного управления программами жизнедеятельности клеток организма при патологических состояниях, связанных с усилением или ослаблением процессов клеточной гибели. Результаты работы используются в учебном процессе Воронежского государственного университета при проведении занятий по дисциплинам «Биофизика», «Биофизика мембран», «Физико-химические основы межклеточных взаимодействий», «Медицинская биохимия и биофизика», а также в ходе выполнения магистерских и дипломных работ студентами кафедры биофизики и биотехнологии.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на IV съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); 3-й Международной конференции ИНТЕРНАС-2007 "Актуальные проблемы современного естествознания" (Калуга, 2007); 15-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2008" (Москва, 2008); Международной научной конференции "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем" (Беларусь, Минск, 2008); 5-ом съезде Российского фотобиологического общества "Преобразование энергии света при фотосинтезе" (Пущино, 2008); 6-ом Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008);. на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2009" (Москва, 2009); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 статей и 8 тезисов, в том числе 2 статьи в журнале системы РАН.
На защиту выносятся следующие положения:
В реализации апоптоза лимфоцитов периферической крови доноров, индуцированного воздействием УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510 Дж/м и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода) ведущая роль принадлежит рецепторопосредованному каспазному и р53-зависимому путям.
В условиях УФ-облучения лимфоцитов в дозе 3020 Дж/м осуществляются рецепторопосредованный без участия каспазы-3, р53-зависимый и каспазонезависимый пути инициации программированной клеточной гибели.
Гибель лимфоцитов в условиях воздействия УФ-света и Н2О2 происходит через промежуточное состояние С1 с образованием высокомолекулярных фрагментов ДНК (> 300 т.п.н.) и состояние С2, характеризующееся наличием фрагментов ДНК (< 50 т. п.н.) до состояния СЗ, характеризующегося межнуклеосомной фрагментацией ДНК (Nxl80 п. н.).
Схема возможных внутриклеточных событий, приводящих к апоп-тотической гибели лимфоцитов после их УФ-облучения.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 172 страницы машинописного текста, 4 таблицы, 50 рисунков. Состоит из "Введения", 5 глав, "Заключения", "Выводов" и "Приложения". Список литературы содержит 240 источников, из них 88 - отечественных и 152 - зарубежных.
