Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1 Общие представления об электронной структуре кислородных молекул и механизмах их активации 7
1 .2 Механизмы, кинетика образования и дезактивации 10
1.3 Методы регистрации и исследования синглетного кислорода 17
1.4. Синглетный кислород в модельных и биологических системах 24
1.5 Связывание красителей с белками и аминокислотам 40
1.6 Заключение 42
Глава 2. Материалы и методы исследований 44
2.1 Материалы 44
2.2 Измерение спектров оптического поглощения и флуоресценции 48
2.3 Регистрация фосфоресценции 'Ог 49
2.4 Методика регистрации кинетических кривых фосфоресценции синглетного кислорода 53
Глава 3. Результаты 55
3.1 Исследование кинетических параметров синглетного молекулярного кислорода в водных растворах порфиринов 55
3.1.1 Гомогенные растворы порфиринов в этаноле и воде 55
3.1.2 Смесь воды и этанола 62
3.1.3 Кинетические параметры 'Ог в коллоидных водно-детергентных системах 68
3.2 Тестирование красителей в водных растворах 71
3.2.1 Метод определения квантового выхода красителей 71
3.2.2 Порфирины и хлорины 72
3.2.3 Бактсриохлорины 74
3.2.4 Родамины 77
3.2.5 Фталоцианины 81
3.3 Тушение фосфоресценции синглетного молекулярного кислорода неорганическими и органическими соединениями 83
3.3.1 Тушение 'С>2 азидом натрия в водных и спиртовых растворах порфиринов 84
3.3.2 Тушение 'Ог азидом натрия в дстергентных растворах 86
3.3.3 Тушение 'Ог триптофаном 89
3.3.4 Тушение Ог альбумином и белками плазмы крови 93
Заключение 97
Выводы 98
Благодарность 101
Литература 102
- Механизмы, кинетика образования и дезактивации
- Измерение спектров оптического поглощения и флуоресценции
- Гомогенные растворы порфиринов в этаноле и воде
- Тушение фосфоресценции синглетного молекулярного кислорода неорганическими и органическими соединениями
Введение к работе
Введение
Исследование образования, дезактивации, реакционной способности и биологической роли активных форм кислорода (АФК) — одна из фундаментальных проблем биофизики и биохимии. Основное состояние молекулы кислорода -трип летное. Это предопределяет относительную химическую инертность кислородных молекул, взаимодействие которых с органическими молекулами, обычно являющимися синглетными в основном состоянии, запрещено по спину. Высокая химическая и биологическая активность кислорода - следствие его способности генерировать промежуточные активные формы, среди которых первичными являются супероксид-анион-радикалы, возникающие в результате присоединения одного электрона наружной незаполненной оболочкой кислородных молекул, и сивглетный кислород, возникающий в результате электронного перехода молекулы кислорода из основного состояния в низколежащее синглетное ДЁ - состояние. Первый тип АФК - результат химической, а второй -физической активации кислородных молекул.
Биологическая роль АФК исключительно высока. Например, они определяют серию сигнальных реакций в клетках в ответ на стрессовые воздействия [1], стимулируют каскад биохимических реакций, приводящих к запрограммированной смерти клеток — апоптозу [2], вызывают деструктивные процессы в сетчатке глаза [3], в поверхностных тканях животных и растений под действием света, подавляют фотосинтез [4], определяют реакции иммунитета и развитие многих болезней животных и человека [5, 6]. С другой стороны, стимуляция образования АФК приводит к гибели раковых клеток, это активно используется при лечении раковых заболеваний методом фотодинамической терапии (ФДТ) [7-12, 13-16]. АФК вызывают инактивацию вирусов и бактерий, что используется для лечения очагов гнойного воспаления и инфекционных заболеваний [17,18].
Настоящая работа посвящена исследованию образования и дезактивации синглетного кислорода ( О2, 'Ag), который по свойствам существенно отличается от других АФК и в наибольшей степени допускает исследование биофизическими методами анализа. Синглетный кислород может возникать в темиовых ферментативных и неферментативных процессах, но основной путь его образования - перенос энергии па молекулярный кислород от возбужденных молекул пигментов - фотосенсибилизаторов. Именно этот процесс лежит в основе широко распространенного класса
Введение
фотодинамических реакций второго типа, имеющих важное прикладное значение [19-22].
При взаимодействии с ненасыщенными органическими молекулами (химическими ловушками) синглетный кислород образует характерные циклические пероксиды, а при спонтанной дезактивации излучает инфракрасную фосфоресценцию в области 1270 им. Именно на этих свойствах основаны современные методы обнаружения и исследования 'Ог - химические и оптические методы [23-25]. Химические методы относительно просты. Однако информация, получаемая этими методами, не всегда убедительна, так как ловушки вносят возмущение в изучаемые системы, вступая в реакции как с СЬ, так и с другими АФК и активными интермедиатами некислородной природы. Существенно надежнее - оптический фосфоресцентный метод, так как он не вносит искажений в изучаемые системы. Однако интенсивность фосфоресценции синглстного кислорода очень мала, и ее регистрация связана с использованием относительно сложных высоко чувствительных фотометрических приборов [25-28]. В настоящее время с помощью указанных методов накоплен обширный экспериментальный материал о свойствах синглетного кислорода в химических системах, главным образом, в органических растворителях и оксиде дейтерия. Однако параметры синглетпого кислорода в естественных условиях - в водных растворах биологически важных соединений и биологических системах - мало исследованы, так как время жизни, стационарная концентрация синглетного кислорода, а также квантовый выход его фосфоресценции в этих системах существенно меньше, чем в органических растворителях и оксиде дейтерия.
Цель работы состояла в исследовании кинетики генерации и дезактивации синглетного кислорода при импульсном лазерном возбуждении фотосенсибилизаторов в водных растворах биологически важных соединений и моделях биологических систем, с тем, чтобы экспериментально показать, какие кинетические параметры характерны для синглетного кислорода в системе, моделирующей реальную клетку. Для измерений предполагалось использовать метод наносекундных измерений собственной ИК фосфоресценции синглетного кислорода на уникальном лазерном фосфоресцентном спектрометре, разработанном в группе биохимии синглетного кислорода Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. Кроме того, в работе предполагалось показать, что с помощью данных, получаемых в результате кинетической регистрации фосфоресценции синглетного кислорода, можно оценить
Введение
фотодинамическую активность различных красителей, потенциально пригодных для практического применения.
В соответствии с этой целью были поставлены и решены следующие задачи:
1) Провести сравнительное исследование кинетики фосфоресценции 'Ог в насыщенных
воздухом и кислородом растворах биологически важных фотосенсибилизаторов в
органических растворителях и воде при импульсном лазерном возбуждении с
наносекундньш временным разрешением.
2) Исследовать кинетические параметры 'СЬ в гетерогенных водных системах,
используя для этой цели смеси этанола и воды и водно-мицеллярные растворы,
приготовленные с использованием детергентов разной природы,
3) Исследовать влияние тушителей сингл етного кислорода - азида натрия, аминокислот
и белков - на кинетические параметры 'Ог в гомогенных и гетерогенных водных
системах при концентрациях тушителей, соответствующих эффективности тушения Ог
компонентами живых клеток в биологических системах.
4) Фосфоресцентным методом исследовать фотодинамическую активность
водорастворимых красителей разных классов (порфиринов, хлоринов, фталоцианинов,
родамипов, бактсриохлоринов), представляющих интерес в связи с теоретическими и
прикладными проблемами фотобиологии и фотомедицины.
Механизмы, кинетика образования и дезактивации
Если энергия Ті меньше энергии Е -состояния кислорода, то заселяться может ]Ag -состояние. Следовательно, образование синглетного кислорода 1АК является основным Глава I. Обзор литературы результатом переноса энергии от Ті на Ог независимо от энергии Ті [37, 39]. Для красителей, которые использовались в наших экспериментах, передача энергии от красителя на кислород происходит по механизму, представленному на рис. 1.2. краситель кислород Рис. 1.2. Схема процессов фотосенсибилизированного образования и дезактивации сииглетного кислорода, ph фосфоресценция, d -безызлучательиая дезактивация, ког - константа скорости переноса энергии от триплетиой молекулы красителя на кислород.
Образование синглетного кислорода по указанному на схеме механизму служит инициатором широко распространенного класса фотодинамических реакций второго типа (тип II) и лежит в основе широко применяемого в настоящее время метода фотодинамической терапии. В качестве фотосенсибилизаторов таких реакций обычно применяют синтетические и природные красители разного строения, включая порфирипы, хлорины, бактериохлорины и фталоцианины [15, 54-58]. Фотодинамические красители представляют собой макроцикл ичес кие органические соединения, имеющие плоскую форму с диаметром макроцикла 20-30 А и толщиной около 3 А (рис. КЗ) [59-61].
Фотофизические свойства фотодинамических красителей определяются их электронной структурой, концентрацией, природой и свойствами среды, температурой [62, 63]. В естественных условиях красители образуют смесь мономеров и агрегатов (димеров, тримеров и олигомеров). Агрегация - физическое явление, которое вызывается межмолекулярными силами взаимодействия [59, 61], точнее, электростатическими силами и образованием нековалентной связи между молекулами красителей.
В соответствии с геометрическим порядком, молекулы образуют линейные и трехмерные, пространственные, агрегаты. Геометрия агрегата определяет спектроскопические свойства, поскольку от положения энергетических уровней зависит величина дипольного момента перехода, являющегося функцией угла между молекулами, а также расстояния между членами в цепи [64, 65]. В соответствии с геометрией и спектроскопическими свойствами в литературе различают: - Н-агрегаты, у которых дипольные моменты молекул расположены параллельно. Образование таких агрегатов вызывает смещение полос поглощения в коротковолновую область (гипохромия). Применительно к спектрам поглощения красителей при агрегации может наблюдаться следующее: полоса Соре смещается в сторону коротких длин волн (800-1800 см" ), увеличивается ширина полосы при половине максимальной высоты, положение красной Q-полосы несколько (100-300 см ) смещается в сторону более коротких длин волн [66]. Такие изменения спектра наблюдаются как для самообразовавшихся, так и для ковалентно связанных димеров. - J-агрегаты, у которых дипольные моменты переходов расположены вдоль одной линии. Для таких типов агрегатов характерно интенсивное поглощение в более длинноволновой полосе по сравнению с мономерами (батохромня) - то есть полоса Соре спектров поглощения немного смещается в сторону длинных длин волн, увеличивается ширина полосы и положение Q-полосы смещается в сторону длинных длин волн на 1-10 нм. - если дипольные моменты молекул находятся под углом друг к другу, то в спектре наблюдается давыдовское расщепление полосы поглощения, т.е. например, вместо одной полосы поглощения, характерной для мономерных молекул, появляются две, смещенные гипохромно и батохромно, полосы поглощения, характерные для агрегированных молекул.
Агрегация молекул красителей-фотосенсибилизаторов обычно вызывает значительное уменьшение квантового выхода генерации синглетного кислорода [67, 68]. Это вызвано снижением эффективности образования триплетного состояния красителей и передачи энергии от красителя на кислород. В уравнении к() , kj константы скорости переноса энергии от триплетного состояния красителя на молекулу кислорода и перехода из синглетного состояния кислорода в основное трип летное, [Ті] и [(] - концентрации красителя в триплетном состоянии и молекулярного кислорода в растворе. Концентрация [Гі] определяется из соотношения.
В газовой фазе при давлении кислорода меньше 1 атм безызлучательные процессы отсутствуют и квантовый выход фосфоресценции равен 1. Увеличение давления кислорода, присутствие постороннего газа или взаимодействие с растворителем в растворах вызывает уменьшение радиационного времени жизни за счет изменения электронной структуры молекул кислорода в комплексах соударения молекул кислорода и посторонних частиц [39 и приведенные там же ссылки].
Измерение спектров оптического поглощения и флуоресценции
Измерения спектров поглощения проводили на двухлучевом спектрофотометре Hitachi U-3400, предназначенном для измерений в области 190-2600 нм. Прибор располагал двумя источниками света - дейтериевой лампой и лампой накаливания, диспергирующий элемент - голографическая решетка 600 шт/мм (800-2600 нм) и 1440 шт/мм (190—850 нм). Разрешение прибора по длине волны составляло 0,07 нм. Детектором в ультрафиолетовом и видимом диапазоне служил фотоумножитель типа R928, в ближнем инфракрасном диапазоне - фотодиод на основе PbS. Точность определения оптической плотности 0,0002 (в диапазоне 0-0,5 А) и 0,0004 (в диапазоне 0,5 - 1 А). При измерениях использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 2 мм и 10 мм. Спектры пигментов в растворе записывали, используя в качестве образца сравнения растворитель.
Флуоресценцию образцов регистрировали на спектрофлуориметре Perkin Elmer MPF-44. В этом приборе возбуждение флуоресценции осуществлялось ксеноновой лампой. Ширина щели монохроматора перед возбуждающим источником света 10 нм, перед детектором 2-4 нм. Флуоресценцию растворов регистрировали под углом 90 к возбуждающему излучению. Измерения проводили в прямоугольных кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 или 2 мм. Регистрацию флуоресценции образца в кювете 2 мм проводили с грани, на которую падает возбуждающее излучение, кювета была повернута к возбуждающему излучению под углом 45.
Фосфоресценцию синглетного молекулярного кислорода регистрировали с помощью собранного в лаборатории спектрометра, работающего на основе метода коррелированного счета одиночных фотонов. Установка за время работы претерпела изменения, последний вариант представлен на рис 2.1. Исследуемый образец возбуждали лазером на парах меди («Фемта», Физический институт РАН, Троицк), азотным лазером (ЛГИ-505), или лазером на парах золота (Mechatron). Параметры лазеров представлены в таблице 2.1. Возбуждающее излучение проходило через фильтры {СЗС-21, СЗС-14, или УФС-2, или СЗС-5, рис. 2.2), пропускающие излучение лазера, но задерживающие инфракрасное излучение трубки излучателя. Излучение лазера с помощью системы линз коллимировали на кварцевую кювету с образцом. При работе использовали два вида кювет: с длиной оптического пути 10 мм (луч возбуждающего излучения падал под углом 90 к грани кюветы) и 2 мм (луч возбуждающего излучения падал под углом 45 к грани кюветы, с которой происходила регистрация). Оптическая плотность исследуемого образца на длине волны возбуждения в большинстве измерений была около 0,2, хотя в отдельных экспериментах использовались более плотные растворы с оптической плотностью до 1.
Фосфоресценцию синглетного молекулярного кислорода регистрировали под прямым углом к возбуждающему излучению. Дифракционный монохроматор МС-80 выделял излучение на 1270 нм, ширина щели 4,5 мм, дисперсия 4 нм/мм, что соответствовало 18 нм. Чтобы уменьшить вероятность попадания на фотоумножитель рассеянного света флуоресценции красителей, перед входом монохроматора устанавливали граничный светофильтр ИКС-7, пропускающий только инфракрасный свет в области более 900 нм. Сигнал, выделенный монохроматором, регистрировали фотоумножителем ФЭУ-83 со спектральной характеристикой С-1 (рис. 2.3), охлаждаемый до - 60
Импульс лазера регистрировали вспомогательным фотоумножителем «Старт» (ФЭУ-58), который при регистрации лазерного импульса, осуществлял запуск встроенного в компьютер цифрового преобразователя («Парсек» Дубна). Кинетику фосфоресценции измеряли, используя принцип коррелированного во времени счета одиночных фотонов. С момента поступления сигнала от ФЭУ-«Старт» цифровой преобразователь начинал формировать импульс, амплитуда которого была пропорциональна интервалу времени между возбуждающим лазерным импульсом и первым зарегистрированным ФЭУ-«Стоп» импульсом люминесценции, который через предусилитель также поступал на цифровой преобразователь. Порог дискриминации сигналов, поступающих с ФЭУ-«Стоп», устанавливали так, чтобы не пропускать сигнал электрической наводки от лазерного генератора, но регистрировать импульсы ФЭУ. Импульс «Стоп» прекращал формирование сигнала преобразователя. Амплитуда сигнала, сформированного преобразователем, в момент поступления сигнала «Стоп» была пропорциональна времени, прошедшему с момента лазерной вспышки до импульса «Стоп». Этот сигнал регистрировался во временном канале, соответствующем прошедшему временному интервалу. Число зарегистрированных в каждом канале импульсов служило показателем интенсивности люминесценции. Зависимость числа импульсов в каждом канале от времени после лазерной вспышки составляла кинетическую кривую люминесценции.
Энергию лазерных импульсов, возбуждающих молекулы красителя, подбирали таким образом, чтобы возбуждение молекул красителя приводило к незначительному уменьшению концентрации его молекул в основном состояния в момент возбуждения лазерным импульсом за счет перехода в синглетное и затем триплетное состояние, В экспериментах в зависимости от мощности лазерного импульса и оптических свойств фотосенсибилизатора доля молекул фотосенсибилизатора в возбужденном состоянии в момент импульса составляла от 1 до 20% от количества всех молекул красителя в растворе. В насыщенных воздухом системах обратная релаксация красителя в основное состояние происходила с постоянной времени не более 2 мкс, поэтому за время между лазерными вспышками (60-1400 мкс) концентрация невозбужденных молекул красителей полностью восстанавливалась (таблица 2.2).
Возбуждающее лазерное излучение, поглощенное образцом, может приводить к его нафеванию. Во время регистрации фосфоресценции сипглетного кислорода нагревание образца контролировали с помощью термопары цифрового мультиметра М-838. Таблица 2.3 иллюстрирует степень нагревания исследуемых растворов в кювете толщиной 10 мм. Учитывая эти данные, при регистрации кинетической кривой облучение жидких маловязких растворов продолжалось не более 200 сек. При необходимости более длительной регистрации свечения после 200 сек облучения раствор заменяли новым. Вязкие растворы в тритоне Х-100, которые сильно нагревались во время облучения, освещали в течение 20 сек, что приводило к Глава 2. Методы исследований и материалы нагреванию на 3 С. Затем растворы заменяли новыми необлученными или охлаждали до комнатной температуры и облучали вновь. Таким образом, при регистрации фосфоресценции [Ог не допускали нагревание образца более чем на 3 С.
Гомогенные растворы порфиринов в этаноле и воде
Исследование параметров синглетного кислорода в смесях этанола и воды представляло интерес, так как такие смеси являются простейшим примером гетерогенной системы. Кроме того, они часто используются для солюбилизации недостаточно растворимых в воде соединений. Как показано методом рентгеновской эмиссионной спектроскопии, вода и спирты в смеси смешиваются не полностью. Например, в смеси метанола и воды (при молярной концентрации 1:1 и 7:3 соответственно) молекулы спирта образуют цепь из 6-8 молекул метанола, связанную с кластерами воды. При этом в смеси сохраняются структуры, характерные для молекул в чистых воде и метаноле [189].
Кинетические кривые фосфоресценции синглетного кислорода в насыщенных воздухом смесях воды и этанола при импульсном лазерном возбуждении. Фотосенсибилизатор - ТСФП (15 мкМ). Кинетические кривые получены на 1270 им в результате накопления сигнала от 2,4-10 лазерных импульсов, расположены по возрастанию массового содержания этанола в смеси, 1 - 0%, 2 - 44%, 3 - 76%, 4 -100%.
Поскольку вода, этанол и их смеси обладали заметным поглощением на 1270 им (рис. 3.6), которое зависело от состава смеси, множитель Тцг заметно влиял на измеряемую интенсивность. Величину Tw приближенно оценивали следующим образом. Измерение фосфоресценции проводили в растворах, оптическая плотность которых в области возбуждения фосфоресценции не превышала 0,2. В этом случае распределение молекул синглетного кислорода по облученному лазером объему раствора можно было считать примерно равномерным. Фосфоресценция, излучаемая молекулами, находящимися у передней по отношению к детектору грани кюветы, очевидно, не поглощалась растворителем. Фосфоресценция молекул, находящихся у задней грани кюветы, частично поглощалось растворителем.
Коэффициент преломления света в воде равен 1,3224, в этаноле - 1,36159. В смесях воды и этанола коэффициент преломления нелинейно возрастает с содержанием этанола [Справочник физических величин]. Scurlock и др. [190] определили, что зависимость константы скорости излучательнои дезактивации синглетного кислорода от коэффициента преломления раствора определяется следующей эмпирической формулой.
Полученные значения w в смесях, которые соответствовали времени жизни триплетного состояния ТСФП в насыщенных воздухом растворах, уменьшались при увеличении концентрации этанола в растворе, что качественно соответствует увеличению растворимости кислорода в таких смесях.
Дезактивация синглетного кислорода растворителями происходит, как известно, за счет передачи энергии на колебательные обертона молекул растворителей [39], а время жизни Ог (тд) удовлетворительно аппроксимируется уравнением: где kq - величина константы скорости тушения синглетного кислорода молекулами растворителя, а С ц молярная концентрация соединения, образующего растворитель.
Зависимость обратных времен нарастания от концентрации этанола в растворе. Времена были получены в результате аппроксимации кинетических кривых по формуле (3.1). Сплошная прямая соединяет точки, соответствующие растворам ТСФП в 100% воды и 96% этанола. Пунктирная прямая соответствует аппроксимации экспериментальных данных по уравнению (3.6) при варьировании значений ки20 и keth.
При варьировании обоих параметров одновременно получено, что в смесях наиболее вероятные значения кто = 5413±154 и kets, = 3406±580 М" с" , что несколько меньше значений в чистых растворителях. Кроме того, все точки, экспериментальной зависимости константы затухания от объемного содержания этанола, полученные в Глава 3. Результаты смеси воды и этанола (за исключением чистой воды и этанола) лежат ниже прямой, соединяющей константы скорости тушения, полученные для 100% воды и этанола.
При варьировании одного из параметров лучшая аппроксимация, согласно значению квадратичного отклонения от экспериментальных данных получена при фиксации кгм = 3800 M"V\ значение кию при этом соответствовало 5390±140 M V, что соответствует времени жизни Ог в чистой воде 3,35±0,09 мкс.
Таким образом, экспериментальные значения kmtx свидетельствуют о том, что константы тушения синглетного кислорода водой и этанолом в их смесях, в пределах точности наших измерений постоянны и почти не отличаются от значений этих констант в воде и этаноле до их смешивания. То есть межмолекулярные взаимодействия между молекулами воды и этанола в смесях, изменение структуры обеих жидкостей слабо влияют на константы тушения синглетного кислорода молекулами этих растворителей.
Для изучения кинетических параметров синглетного кислорода в коллоидных гетерогенных системах, мы использовали водные растворы ТСФП, содержащие детергенты тритон Х-100 (ТХ-100), ДСН и ЦТАБ. ТХ-100 - неионогенньга детергент, т.е. его молекулы не несут электрического заряда, а молекулы ДСН и ЦТАБ несут соответственно отрицательный и положительный заряды. В воде использованные детергенты образуют мицеллы. Средние молекулярные массы мицелл составляют для ТХ-100 90 кД, что соответствует 140 молекулам детергента, для ДСН — 23,2 кД, 80 молекул детергента, и для ЦТАБ — 61,7 кД, 215 молекул детергента [191, 192]. Молекулы ТСФП в водном растворе отрицательно заряжены, поэтому в мнцеллярном растворе ТХ-100 молекулы ТСФП локализованы как в мицеллах, так и в водной фазе. В отрицательно заряженные мицеллы ДСН молекулы порфирина, вероятно, не проникают, поэтому они локализованы в водной фазе вне мицелл. В растворе положительно заряженного ЦТАБ, по-видимому, все молекулы порфирина локализованы на поверхности мицелл.
Тушение фосфоресценции синглетного молекулярного кислорода неорганическими и органическими соединениями
Цель этого раздела исследований состояла в изучении кинетических параметров фосфоресценции Ог в водных и водно-мицеллярных растворах красителей в присутствии сильных биологически важных тушителей синглетного кислорода - азида натрия, аминокислот, альбумина и белков плазмы бычьей крови. При этом мы ставили две задачи: (1) исследовать кинетические параметры фосфоресценции при импульсном лазерном возбуждении в системах, где время жизни С соответствовало времени жизни Ог в реальных биологических системах, и (2) учитывая, что ранее большинство измерений было выполнено в оксиде дейтерия, изучить тушение 02 указанными соединениями в водных системах.
Исследования начали с анализа тушения Ог азидом натрия в этаноле, в котором эффект тушения был подробно изучен ранее. Добавление азида натрия (до 2 мМ) в спиртовые растворы ТСФП приводило к уменьшению TJ И интегральной интенсивности фосфоресценции, рассчитанной как площадь под кинетической кривой, но не влияло на величину rrise (табл. 3.8). Во всем интервале концентраций тушителя xj было значительно больше w. Тушение подчинялось уравнению Штсрна-Фольмера: (Гд)о/Гд = Ijl = 1 + fc, -[Є]-(Гд)о (3.7) где Jo и /, (тл)о и Tj соответственно - интенсивность и время жизни фосфоресценции в отсутствии и в присутствии азида натрия, kq - константа скорости дезактивации синглетного кислорода азидом натрия, [Q] - концентрация азида натрия. Константы скорости тушения, рассчитанные из значений xj и интегральной интенсивности фосфоресценции, оказались одинаковыми в пределах точности измерений и равными ft 1 I (2,0±0,3)х10 М" -с" (рис. 3.19). Это соответствует значениям, полученным в спиртовых растворах другими авторами [197],
В насыщенных воздухом водных растворах ТСФП азид натрия также вызывал уменьшение интегральной интенсивности и времени затухания фосфоресценции. Падение интенсивности подчинялось уравнению Штерна-Фольмера с константой тушения (4,0±0,6) Ю М" -с (рис. 3.19). Эта величина примерно вдвое больше, чем в этаноле, и близка к значению, полученному ранее в оксиде дейтерия [118] и в водных растворах [161, 187,197].
При анализе кинетики фосфоресценции мы наблюдали, что изменение концентрации азида в интервале 3-12 мМ не приводило к изменению времени затухания, которое всегда составляло 1,9±0,2 мкс (табл. 3.9). Эта величина совпадала с временем жизни триплетного состояния ТСФП. При этом время нарастания уменьшалось до нескольких сотен наносекунд, примерно в соответствии с уравнением Штерна-Фольмера. Отсюда можно заключить, что азид натрия не тушил триплетное состояние ТСФП, а резкое уменьшение %л в его присутствии приводило к инвертированию кинетики фосфоресценции. В присутствии указанных концентраций азида натрия нарастание кинетической кривой после лазерного импульса определялось дезактивацией Ог (хд), а затухание определялось скоростью взаимодействия триплетных молекул ТСФП с кислородом (т . Уравнение (1.3) показывает, что такое инвертирование является результатом изменения соотношения xt и ТА, а именно TJ T,. В связи с эффектом инвертирования определение константы скорости тушения Ог азидом натрия в воде по кинетическим данным не дает надежных результатов, поскольку в тех случаях, когда время жизни триплетного состояния порфирина и СЬ близки по величине (соответствует 0,4 - 2 мМ азида натрия в растворе), значения тгііе и Tj, которые дает регрессия кинетических данных, определяются с большой ошибкой.
Предполагают, что в клетке также выполняется условие г( гд, так как по оценкам [39 и приведенные там же ссылки] время жизни СЬ в цитоплазме клеток составляет 20-200 не, а время жизни триплетного состояния красителей - не менее 10 мкс. Таким образом, чтобы оценить экспериментально время жизни ( в живой клетке по фосфоресценции кислорода необходимо регистрировать кинетическую фазу ее нарастания после лазерного импульса.
При этом увеличение концентрации азида натрия сопровождалось резким уменьшением времени нарастания фосфоресценции синглетного кислорода, которое примерно соответствовало тушению интегральной интенсивности фосфоресценции. Время затухания фосфоресценции уменьшалось в существенно меньшей степени, причем его минимальное значение несколько превышало значение тГ(К. в растворе, не содержащем детергент (табл. ЗЛО). Сравнение этих данных показало, что тушение фосфоресценции азидом в детергентных растворах приводило к такому же инвертированию кинетики, как и в водных растворах без детергента. При высоких концентрациях детергента фаза нарастания - определялась дезактивацией Ог, фаза затухания - переносом энергии от триплетных молекул порфирина на кислород. Представляет интерес также анализ значений констант тушения О2 в детергентных растворах. Из рис. 3.19 видно, что в воде без детергента и в присутствии 10% ТХ-100 тангенс угла наклона прямых одинаков. В растворах, содержащих около 10% ДСП и ЦТАБ, тангенс угла наклона заметно больше, чем в воде. Однако время жизни Ог в не содержащих детергенты растворах больше, чем в воде, поэтому расчет констант скорости тушения С 2, показывает, что наименьшая константа характерна для раствора ТХ-100, которая в 1,5 раза меньше, чем в воде, константа в растворе ДСН совпадает с константой в воде, константа в растворе ЦТАБ вдвое больше, чем в воде. Полученные нами значения констант скорости тушения Ог азидом натрия в растворах ДСН и ЦТАБ коррелируют со значениями, полученными в более ранней работе (табл. 3.11). [137]. Различие констант скорости тушения определяется характером взаимодействия азида с мицеллами детергентов. Можно предположить, что азид проникает в неионогенные мицеллы ТХ-100 и тушит О2 как внутри мицелл, так и в водной фазе. В мицеллы ДСН, ионы которого заряжены отрицательно, отрицательно заряженные молекулы ТСФП и ионы N3-, вероятно, не проникают, поэтому тушение Ог осуществляется только вне мицелл в водной фазе. В растворах ЦТАБ, ноны которого несут положительный заряд, молекулы ТСФП и азида, вероятно, адсорбированы на поверхности мицелл, поэтому локальная концентрация тушителя в месте генерации СЬ значительно больше средней. Таким образом, в условиях сильного тушения ( азидом натрия, который не тушит триплстные молекулы порфирина, но существенно уменьшает время жизни Ог до значений, характерных для живых клеток, наблюдается инвертирование кинетических фаз - нарастание соответствует дезактивации С 2, а затухание - скорости переноса энергии от триплетного состояния порфирина на кислород. Сопоставление изложенных данных позволяет предположить, что в живых клетках Ог локализован в значительной мере в липофильных структурах, а время его жизни следует измерять по кинетике нарастания фосфоресценции после лазерного импульса.
