Введение к работе
Актуальность исследования. Коммуникация живых систем происходит с участием разнообразных химических соединений и различного рода излучений. Во всех этих взаимодействиях восприятие физико-химического сигнала осуществляется на клеточном уровне, и основополагающую роль в них играют клеточные поверхности.
Особый интерес вызывают эффекты и механизмы действия биологически активных веществ (БАВ) в «сверхмалых дозах» (СМД). В малых и сверхмалых концентрациях (10" -10" моль/л) проявляют свою активность многие природные хемомедиаторы - токсины и противоядия, вещества, предупреждающие об опасности, феромоны, криопротекторы, фитогормоны и другие (Чибисова, 1998). Описан парадоксальный характер действия низких концентраций токсичных веществ и лекарственных препаратов, который заключается, в частности, в бимодальной или полимодальной зависимости «доза-эффект» (Бурлакова и др. (обзор), 2004). Отмечается (Бурлакова, 2002), что последствия от воздействия СМД ксенобиотиков могут быть не менее серьезными, чем последствия от высоких разовых доз: под их влиянием могут меняться существующие связи, давать сбой некоторые системы адаптации, поскольку организм способен приспосабливаться лишь к эффектам, лежащим в обычном диапазоне проявлений воздействия. Установлена также высокая чувствительность биологических объектов к нетепловому электромагнитному излучению (ЭМИ) крайне высоких частот (КВЧ), предполагается, что оно выполняет информационную функцию в живых системах (Бецкий и др., 2004).
Исследования в области слабых воздействий находятся на стадии накопления экспериментальных данных. Гипотезы, объясняющие их механизмы, немногочисленны и противоречивы. Решение данной проблемы позволит уточнить пределы токсичности ксенобиотиков, приведет к пересмотру доз лекарственных веществ и открытию новых направлений их использования, к переосмыслению многих принципов в биологии, экологии и медицине.
Известно, что основные закономерности эффектов СМД не связаны со структурой вещества или уровнем биологической организации мишени (Бурлакова и др., 2003, 2004). Ряд исследователей полагают, что в основе механизма их парадоксального действия лежит изменение структурных свойств воды. Следует отметить, что водная компонента биосистем признана первичной мишенью действия ЭМИ КВЧ малой интенсивности (Синицын и др., 1998). Поскольку свойства воды значительно различаются в объёме жидкости и вблизи поверхности раздела фаз, мы предположили, что химические вещества и ЭМИ изменяют структуру сетки водородных связей воды у клеточной поверхности, этот процесс является первой стадией в последовательности биохимических превращений в клетке и организме в целом.
Актуальной задачей при изучении роли водной компоненты биосистем в формировании отклика на низкоинтенсивное воздействие является разработка адекватных моделей клеточной поверхности. Они могут найти практическое применение: для прогноза биологического действия химических соединений и
физических факторов, при поиске веществ и средств, повышающих адаптационные возможности организма, при разработке тест-систем для определения низких концентраций физиологически активных и токсичных веществ.
Важным и новым аспектом использования экспериментального и компьютерного моделирования клеточной поверхности является изучение или уточнение механизмов межклеточных контактов, в частности малоизученных полисахарид-полисахаридных взаимодействий, которые могут иметь место в симбиотических процессах, например, при агрегации бактерий и адсорбции на поверхности корней растений.
Цель диссертационной работы: развитие методологии моделирования клеточных поверхностей для исследования молекулярных механизмов физико-химической коммуникации живых систем.
Для достижения указанной цели нами были поставлены и решены следующие задачи:
-
Разработать модельные системы, имитирующие поверхностные свойства мембран и белков и позволяющие фиксировать изменение структуры и динамики приповерхностной воды.
-
Изучить концентрационные эффекты воздействия биологически активных веществ (индолил-3-уксусной кислоты, никотина, метронидазола) на биологические и модельные системы.
-
Исследовать влияние биологически активных веществ на состояние объемной и приповерхностной воды. Провести молекулярное моделирование динамики сетки водородных связей воды в их присутствии.
-
На основе биоподобных моделей сконструировать тест-системы для определения низких концентраций биологически активных веществ.
-
Исследовать изолированные и комбинированные эффекты воздействия электромагнитного излучения крайне высоких частот низкой интенсивности и биологически активных веществ на модельные биообъекты.
-
Создать модели клеточной поверхности бактерий Azospirillum brasilense Sp245 на основе липосом и изучить роль липополисахарида наружной бактериальной мембраны в процессах образования микробных ассоциатов и адсорбции клеток на корнях пшеницы.
-
Осуществить компьютерное моделирование пространственной структуры О-специфического полисахарида внешней мембраны Azospirillum brasilense Sp245 и полисахарид-полисахаридного взаимодействия.
-
Разработать биоподобные наносистемы для целевой доставки химических соединений к корням растений.
Научная новизна работы:
В результате проведенных исследований получило развитие перспективное научное направление моделирования клеточной поверхности для исследования механизмов физико-химической коммуникации живых систем. Впервые разработана методология выбора и создания моделей для исследования участия воды у поверхности мембран и белков при воздействии на биосистемы БАВ в низких концентрациях и ЭМИ нетепловой интенсивности. В основу данной
методологии положены следующие принципы: отсутствие сродства модельной системы к БАВ; высокая чувствительность к изменению структуры и подвижности воды; возможность регистрации отклика системы на указанное изменение; комплексное применение моделей, соответствующих различным уровням организации биосистем. Исследовано дозо-зависимое воздействие фитогормона гетероауксина, алкалоида никотина и антимикробного препарата метронидазола на биологические и модельные системы, обнаружены немонотонный характер действия и эффекты низких концентраций ИУК (10" -10" моль/л), никотина (10" - 10" моль/л) и цитопротекторное действие метронидазола (10" - 10" моль/л). Благодаря сочетанию экспериментального и компьютерного моделирования определено, что в основе указанных эффектов лежит неодинаковое воздействие БАВ на структуру воды у поверхности биологических объектов. В качестве наиболее вероятного молекулярного механизма действия низких концентраций БАВ предложен фазовый ^-переход типа порядок-беспорядок, связанный с перестройкой сетки водородных связей воды, который индуцируется молекулами вещества в водном микроокружении. Установлено, что эффекты комбинированного воздействия ЭМИ КВЧ на резонансных частотах и БАВ в низких концентрациях зависят от характера воздействия вещества на структуру водной компоненты. Разработаны модели бактериальной поверхности, представляющие собой липосомы, инкрустированные липополисахаридами (ЛИС) внешней мембраны клеток А. brasilense Sp245. Они впервые использованы для изучения полисахарид-полисахаридных взаимодействий в межклеточных контактах в системах бактерии-бактерии, бактерии-злаки. Методами молекулярной динамики установлены термодинамически равновесные конформации О-специфического полисахарида (О-ПС) ЛИС A. brasilense Sp245 в водной фазе и доказано, что две цепи полисахаридов только при антипараллельной ориентации взаимодействуют друг с другом с образованием структуры типа двойной спирали за счет межмолекулярных водородных связей. Сочетание экспериментального и компьютерного моделирования позволило доказать участие О-ПС ЛПС бактериальной поверхности в симбиотических взаимодействиях бактерий и предположить молекулярный механизм этих взаимодействий.
Научно-практическая значимость работы:
Разработаны методические подходы к конструированию биоподобных систем, чувствительных к изменению динамики приповерхностной воды. Впервые показана возможность создания сенсорных систем на этой основе для определения низких концентраций БАВ в водных средах. Оформлено 2 заявки на изобретение по способам определения ИУК (№ 2007140953, приоритет от 02.11.2007; № 2007142881, приоритет от 19.11.2007). Обнаружено цитопротекторное действие метронидазола в отношении ЭМИ и детергента. Предложено использовать разработанные модельные системы для поиска клеточных протекторов нового поколения. Осуществлен прогноз характера воздействия химических веществ на структурные характеристики воды с помощью методов молекулярного моделирования; в качестве структурных
характеристик использованы парные корреляционные функции радиального распределения, среднее время жизни и среднее количество водородных связей, распределение молекул воды по кластерам различного размера. Отмечена корреляция результатов экспериментального и компьютерного моделирования. Обнаружены новые биологически эффективные частоты в КВЧ диапазоне ЭМИ, показано, что данное излучение способно компенсировать негативное влияние токсичных веществ на живые системы. Впервые показана возможность применения биоподобных наносистем для проведения фундаментальных исследований симбиотических процессов взаимодействия бактерий и растений и для направленного транспорта химических веществ к корням растений. В модельных экспериментах показана высокая эффективность доставки химического соединения к корням пшеницы с помощью наночастиц диоксида кремния, обогащенных растительными полисахаридами, и липосом, инкрустированных ЛПС внешней бактериальной мембраны A brasilense Sp245. Оформлена заявка на изобретение систем транспорта химических веществ к корням пшеницы (заявка № 2007145119, приоритет от 06.12.2007), применение которых позволит уменьшить антропогенную нагрузку на сельскохозяйственные угодья и окружающую среду. Основные положения, выносимые на защиту.
-
Развитие методологии моделирования клеточной поверхности способствует установлению и уточнению молекулярных механизмов физико-химической коммуникации живых систем.
-
Предложенные модели для изучения роли приповерхностной воды во взаимодействиях живых систем с биологически активными веществами в низких концентрациях и ЭМИ КВЧ нетепловой интенсивности соответствуют различным уровням организации биосистем, не обладают сродством к БАВ и проявляют высокую чувствительность к структурным изменениям водной компоненты.
-
БАВ в низких концентрациях оказывают различное воздействие на структуру воды у поверхности биологических объектов: структурирующее, деструктурирующее, разнонаправленное в зависимости от концентрации.
-
Прогноз характера воздействия БАВ на структуру приповерхностной воды проводится по совокупности определенных с помощью методов молекулярного моделирования структурных характеристик воды (парных корреляционных функций радиального распределения, среднему времени жизни и среднему количеству водородных связей, распределению молекул воды по кластерам различного размера) в присутствии молекулы вещества.
-
Биоподобные структуры, чувствительные к изменению диффузионной подвижности приповерхностной воды, используются в сенсорных системах для определения БАВ в низких концентрациях.
-
Модельные системы применяются для выявления биологически эффективных частот в КВЧ-диапазоне ЭМИ низкой интенсивности и исследования комбинированных эффектов воздействия ЭМИ и БАВ на биосистемы.
-
Молекулярное моделирование бактериальной поверхности позволяет изучать полисахарид-полисахаридные взаимодействия в симбиотических процессах агрегации бактерий и адсорбции на поверхности корней растений.
-
Разработанные наносистемы с углеводными детерминантами являются эффективными средствами для направленного транспорта химических веществ к корням растений.
Апробация работы:
Основные результаты исследований докладывались на российских и международных конференциях: III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002); I и II Российских школах-конференциях «Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине» (Саратов, 2002, 2004 гг.); 1, 2, 3 Всероссийских конференциях «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2003, 2005, 2007 гг.); Saratov Fall Meeting - Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine, (Саратов, 2003-2006 гг.); Международном симпозиуме "Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants" (Саратов, 2003 г.) , HUPO 2nd Annual & IUBMB XIX World Congress (Montreal, Canada, 2003); 41-st Congress of the European Societies of Toxicology "Eurotox-2003" (Florence, Italy, 2003); 10th International Congress of Toxicology (Tampere, Finland, 2004); Всероссийский симпозиум "Тест-методы химического анализа" (Саратов, 2004 г.); Gordon Research Conference "Macromolecular Organization & Cell Function" (Oxford, Great Britain, 2004); 42nd Congress of the European Societies of Toxicology "Eurotox-2005" (Cracow, Poland, 2005); 10 и 11 Путинских конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006, 2007 гг.); Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2006 г.); III Научно-практическая конференции «Научно-технические аспекты обеспечения безопасности при уничтожении, хранении и транспортировке химического оружия» (Москва, 2006 г.); VII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва 2006 г.); EUROTOX 2006/6 CTDC Congress, (Dubrovnik, Croatia, 2006); IV Международной научно-практической конференции «Экология речных бассейнов» (Владимир, 2007 г.); VII Международной крымской конференции «Космос и биосфера» (Судак, Крым, Украина, 2007 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 57 работ.
Декларация личного участия автора. Автор лично выбрал и теоретически обосновал тематику исследований, участвовал в экспериментальных исследованиях. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно. В совместных публикациях вклад автора составил 60-80 %.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 287 страницах машинописного текста, включает 90 рисунков и 12 таблиц. Работа состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и приложения; список используемых источников включает 422 работы отечественных и зарубежных авторов.
Настоящая работа представляет собой часть плановых научно-
исследовательских работ Саратовского государственного технического университета, Саратовского военного института биологической и химической безопасности. Исследования проводились также в сотрудничестве с Институтом биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (НИР № гос. регистрации 01.200.116077) и лабораторией электромагнитных полей НИИ Естественных наук Саратовского государственного университета. Работа поддержана программой Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы» (раздел 3.3, проект № 45436).
