Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1 Активные формы кислорода и некоторые их свойства 8
1.1.1 .Активные формы кислорода - медиаторы и передатчики сигналов.. 10
1.1.2. Образование активных форм кислорода митохондриями клеток сердечной мышцы 11
1.1.3.Нарушения метаболизма кардиомиоцитов, вызванные ишемией 14
1.1.4.Роль активных форм кислорода в повреждениях миокарда 16
1.1.5 .Ишемическое прекондиционирование 17
1.1.6. Участие активных форм кислорода в инициации апоптоза 18
1.1. Т.Коэнзим Q - переносчик электронов митохондриалъной дыхательной цепи и антиоксидант 19
1.2. Активные формы азота 21
1.2.1 .Источники оксида азота 22
1.2.2.Вазодиляторная функция оксида азота 22
1.2.3.ИО-зависимыйапоптоз 23
1.2.4. Активные формы азота в митохондриях 24
1.2.5.Антиоксидантное действие оксида азота 26
2. Материалы и методы исследования 30
2.1 Получение изолированных митохондрий 30
2.2 Опыты с перфузируемыми сердцами 30
2.3 Исследование действия экзогенного коэнзима Q 33
2.4 Определение функциональной активности митохондрий 35
2.5 Получение препаратов для изучения путей метаболизма оксида азота 35
2.6 Индуцированное перекисное окисление митохондрий 36
2.7 Регистрация спектров ЭПР 37
2.8 Определение абсолютных значений скоростей генерации супероксидных радикалов 41
3. Исследование закономерностей образования свободных радикалов кислорода митохондриями сердца 47
3.1. Сократительная функция сердца 47
3.2. Функциональная активность митохондрий 50
3.3. Генерация супероксидных радикалов в митохондриях 53
3.4. Влияние диеты с коэнзимом Qio на митохондрии сердец, подвергнутых окислительному стрессу 64
4. Исследование антиоксидантных и прооксидантных свойств физиологических доноров оксида азота 67
Заключение 96
Выводы 99
Список цитируемой литературы 100
- Активные формы азота
- Опыты с перфузируемыми сердцами
- Регистрация спектров ЭПР
- Генерация супероксидных радикалов в митохондриях
Введение к работе
Образование активных форм кислорода (0 , ОН , Н202) в результате процессов жизнедеятельности организма является неотъемлемой составляющей аэробного метаболизма. Образование свободных радикалов кислорода в биологических системах происходит постоянно и является как прямым результатом функционирования ряда специальных ферментативных систем, так и следствием побочного процесса множества окислительно-восстановительных реакций в клетке. Значительный интерес в отношении короткоживущих свободных радикалов обусловлен, прежде всего, их высокой химической активностью.
Основным потребителем кислорода в клетках сердечной мышцы является дыхательная цепь митохондрий - более 90 % всего потребляемого клеткой кислорода восстанавливается до воды с участием цитохром с оксидазы митохондрий, поэтому способность митохондрий к одноэлектронному восстановлению кислорода представляет наибольшую опасность. В обычных условиях, когда скорость побочного образования активных форм кислорода относительно невысока ( 2 %), антиоксидантная система клетки эффективно защищает от развития окислительного стресса. В условиях пониженного энергетического метаболизма, в состоянии 4 митохондриальной дыхательной цепи, при существенном увеличении внутриклеточной концентрации кислорода, происходят также значительные сдвиги в редокс-состоянии электронных переносчиков, способствующие резкому возрастанию скорости генерации свободных радикалов кислорода.
Участие свободных радикалов, а также других токсических форм кислорода в развитии патологических состояний сердечной мышцы после длительной ишемии в настоящее время является доказанным. Ишемия характеризуется как неадекватное снабжение ткани кислородом и необходимыми метаболитами и обусловлена нарушениями в системе кровообращения. Было обнаружено, что следующая за длительной ишемией миокарда реперфузия сопровождается значительными тканевыми повреждениями и нарушениями сократительной способности - появлением аритмий и временной механической дисфункции. Это явление, получившее название «кислородный парадокс», обусловлено резким усилением генерации активных форм кислорода при восстановлении нормального уровня внутриклеточного кислорода.
Адаптация к ишемии (ишемическое прекондиционирование) - краткая серия непродолжительных циклов ишемии-реперфузии, предшествующая длительной ишемии - привлекает внимание в силу оказываемого им защитного действия на миокард, его адаптации к ишемическому стрессу. В силу того, что основным повреждающим фактором реперфузии сердечной мышцы являются активные формы кислорода, представляет большой интерес влияние ишемического прекондиционирования на активность генерации свободных радикалов кислорода митохондриями. Очевидно, что защитный эффект реализуется в период длительной ишемии на основании тех изменений, которые происходят в кардиомиоцитах в результате адаптации к ишемии. Представляет интерес вопрос о том, в течение какого времени длительной ишемии проявляется защитный эффект адаптации. Известно, что степень ишемических повреждений миокарда определяется длительностью ишемии. Так как супероксидные радикалы вносят основной вклад в повреждения миокарда после ишемии, величина постишемической генерации активных форм кислорода должна быть пропорциональна длительности ишемии.
Супероксидный анион-радикал, образующийся в митохондриях, является предшественником более токсичных активных форм кислорода и азота. Действительно, при взаимодействии супероксида и оксида азота возникает пероксинитрит (ONOO), который далее распадается с образованием таких сильнейших окислителей как гидроксильный радикал и радикал диоксида азота. Пероксинитрит может приводить к окислительной модификации низкомолекулярных и макромолекулярных компонентов митохондрий, в том числе коэнзима Q, NADH и белков дыхательной цепи. В то же время пероксинитрит может быть субстратом цитохромокисдазы и нейтрализовываться специфическими митохондриальными пероксиредоксинами, обладающими пероксидазной активностью белками. С другой стороны, NO может эффективно ингибировать перекисное окисление липидов, то есть, является антиоксидантом. Важную роль в антиоксидантном действии оксида азота, по-видимому, играют динитрозильные комплексы железа (DNIC), образующиеся при взаимодействии NO с ионами железа и тиолами. В связи с тем, что NO, генерируемый митохондриальной М)-синтазой, способен превращаться как в пероксинитрит так и в DNIC, весьма важным является изучение взаимодействий между метаболитами оксида азота и активными формами кислорода. Эти исследования особо актуальны, так как данные взаимодействия могут определять баланс антиоксидантных и прооксидантных процессов в митохондриях и в целом в клетке.
Целью работы являлось изучение механизмов регуляции процессов образования и гибели активных форм кислорода и азота в кардиомиоцитах -сократительных клетках сердечной мышцы - в условиях, моделирующих окислительный стресс и защитное действие антиоксидантных систем клетки.
Исходя из общей цели, в диссертации решались следующие задачи:
1. Изучение влияния ишемии различной длительности и реперфузии на функциональную активность митохондрий сердца и кинетику образования ими свободных радикалов кислорода.
2. Иследование роли экзогенного коэнзима Qw при защите клеток сердечной мышцы от повреждений, вызванных окислительным стрессом.
3. Изучение антиоксидантных свойств динитрозильных комплексов железа в условиях моделируемого окислительного стресса, в том числе в условиях перекисного окисления в митохондриях сердца крысы.
4. Исследование антиоксидантных свойств DNIC в условиях генерации феррилмиоглобина и органических свободных радикалов. Изучение влияния супероксидных радикалов на образование DNIC с участием ферритина и тиолов.
Активные формы азота
Наряду с активными формами кислорода существенную роль в патологических процессах развивающихся при ишемии и последующей реперфузии миокарда играют активные формы азота [60]. К последним относят оксид азота (NO), пероксинитрит, диоксид азота, нитроксильный анион и другие физиологические производные NO. Кроме того, оксид азота и его метаболиты играют важную роль в большом числе физиологических процессов, среди которых регуляция кровяного давления, образование тромбов, нейромедиаторная функция, защита организма In vivo NO генерируется М?-синтазой (NOS), которая катализирует превращение L-аргинина в L-цитруллин. Существует несколько изоформ NO-синтаз [61, 62], такие как нейрональная (nNOS), митохондриальная (mtNOS), эндотелиальная (eNOS) и индуцибельная (iNOS). Нейрональная, эндотелиальная и митохондриальная изоформы синтезируются многими тканями постоянно, но их активность регулируется внутриклеточной концентрацией кальция. Индуцибельная М?-синтаза, участвующая в окислительном взрыве, синтезируется макрофагами в ответ на стимуляцию различными цитокинами и липополисахаридами. С00/7-терминальный домен всех М9-синтаз содержит сайты для связывания NADFH, FAD и FMN. ЛТ -терминальный домен служит для связывания тетрагидробиоптрина и аргинина. Каталитические участки включают цитохром Р-450-подобную оксидазу (гем-связывающий сайт).
Таким образом, домен, содержащий NADFH, FAD и FMN, по-видимому, представляет собой цитохром Р-450-редуктазу. Регуляторный домен М)-синтаз включает кальмодулинсвязывающий участок. В ходе каталитического акта происходит гидроксилирование гуанидинового азота, в котором, предположительно, участвуют супероксидный радикал и гем-содержащий домен. Далее происходит отщепление NO от ІУ-окси-і-аргинина, с одновременным образованием цитруллина [63, 64]. Одной из наиболее заметных медиаторных функций оксида азота является регуляция тонуса сосудов и образования тромбов. Механизмы этих процессов хорошо изучены на молекулярном уровне. Это связывание NO с гемом гуанилатциклазы - фермента, катализирующего образование циклического гуанозинмонофосфата (cGMP). В результате этого связывания происходит активация фермента, продукт которого является модулятором функций протеинкиназ, фосфодиестераз, ионных каналов и других физиологически важных целей, в числе которых регуляция тонуса гладкой мускулатуры [65] и ингибирование образования тромбов [66]. Релаксация гладкой мускулатуры сосудов происходит под действием cGA/P-зависимой протеинкиназы, которая фосфорилирует и активирует Ся-чувствительные калиевые каналы [67]. Действие NO опосредованно такими его метаболитами, как S-нитрозотиолы.
Предполагается, что низкомолекулярные и ассоциированные с белками -нитрозотиолы могут участвовать в стабилизации и транспорте NO, а также в реализации биологических функций этого соединения [68]. Данные ряда авторов свидетельствуют о том, что S-нитрозотиолы действуют аналогично эндотелиальному фактору релаксации [69, 70], активируют гемсодержашую гуанилатциклазу и ингибируют агрегацию тромбоцитов [71, 70, 68]. В то же время, весьма вероятно, что основной формой депонирования NO в организме могут быть более стабильные по сравнению с З-нитрозотиолами при физиологических условиях нитрозильные комплексы негемового железа с тиольными группами [72]. МЭ-зависимый апоптоз наблюдался в нескольких экспериментальных моделях и при определенных клинических патологиях [73, 74, 75]. Индукция апоптоза оксидом азота связана с уменьшением концентрации кардиолипина, сниженной активностью митохондриальной электрон-транспортной цепи и выходом митохондриального цитохрома с в цитозоль [76]. Однако, некоторые типы клеток, как, например, эндотелиальные клетки капилляров, обладают очень высокой сопротивляемостью к инициированию апоптоза оксидом азота. Низкие концентрации NO обеспечивают таким клеткам защиту от апоптоза ингибируя некоторые каспазы [77]. Высокая сопротивляемость к jVO-зависимому апоптозу связана с высоким количеством внутриклеточного глутатиона [78]. Механизмом такого глутатион зависимого ингибирования апоптоза, по-видимому, является нитрозилирование тиольных групп (-нитрозилирование) каспазы-3 [45]. Важнейшим внутриклеточным компартментом, в котором проявляется действие оксида азота являются митохондрии [79, 80, 81]. Образование оксида азота в митохондриях катализируется митохондриальной МЗ-синтазой [82, 83]. Этот фермент имеет тот же самый кофактор и субстраты, как и другие конститутивные синтазы оксида азота. В то же время в литературе обсуждается возможность образования NO из нитрита в результате катализируемой цитохромоксидазой нитритредуктазной реакции [84,]. Известно, что эндогенный оксид азота обратимо ингибирует потребление кислорода и синтез АТР, действуя на цитохромоксидазу. С цитохромоксидазой и другими компонентами дыхательной цепи митохондрий взаимодействуют также образующиеся в этих органеллах пероксинитрит (ONOO) и нитроксильный анион (NO ). Пероксинитрит возникает при реакции оксида азота с супероксидным радикалом [85]: Предполагают, что пероксинитрит, являясь субстратом цитохромоксидазы, может восстанавливаться до NO, либо превращаться в нитрит [86]. С другой стороны, пероксинитрит, по-видимому, необратимо ингибирует цитохромоксидазу [87]. Кроме того, ONOO может вызывать окисление макромолекулярных [88] и низкомолекулярных компонентов митохондрий, в том числе коэнзима Q, NADH [89] и тиольных групп [90]: Известно также, что пероксинитрит вызывает специфическое, NAD зависимое высвобождение кальция из митохондрий [91]. Считается, что за нейтрализацию пероксинитрита ответственны митохондриальные пероксиредоксины (специфические обладающие пероксидазной активностью ферменты). Нитроксильный анион, также обладающий прооксидантными свойствами, образуется в митохондриях при взаимодействии N0 с восстановлеными формами убихинона, цитохрома с и цитохромоксидазы в
Опыты с перфузируемыми сердцами
В экспериментах, посвященных исследованию влияния ишемического прекондиционирования, ишемии и реперфузии на митохондрии кардиомиоцитов, выделению митохондрий предшествовала физиологическая обработка сердец, в ходе которой извлеченное из грудной полости сердце подвешивали за аорту на канюлю перфузионной установки (рис. 2). Сердце перфузировали ретроградно по методу Лангендорфа [125] модифицированным раствором Кребса-Хензелейта, содержащим: 118 мМ NaCl, 5,9 мМ KCl, 3,0 мМ CaCl2, l,2MMMgS04, 0.5мМЯа-EDTA, 20мМЫаНСО3,11 мМD-гшокозы; рН=7,4. Насыщенный карбогеном (95% 02 + 5% С02) раствор при 37С подавали в канюлю через систему термостатированных трубочек перистальтическим насосом. Скорость потока перфузата поддерживали постоянной (изоволюмический режим работы) и выбирали исходя из условия достижения перфузионного давления в аорте 60 80 мм рт. ст. Для измерения внутрижелудочкого давления в полость левого желудочка сердца вводили катетер с латексным баллончиком. Баллончик заполняли жидкостью, устанавливая диастолическое давление в желудочке на уровне 10-15 мм рт. ст. Изменения давления в баллончике регистрировали с помощью электроманометра Gould Statham P23Db и монитора Gould 2400S (США). В качестве параметров сократительной функции работающего в изоволюмическом режиме сердца были выбраны систолическое, диастолическое и развиваемое давление, которое определялось как разность между систолическим и диастолическим давлением. Коронарный поток определяли по количеству жидкости, оттекающей от сердца в единицу времени.
Сразу после достижения стабильного значения сократительной функции,сердца подвергались ишемическому прекондиционированию.Прекондиционирование заключалось в последовательном проведении четырёх коротких циклов ишемии и реперфузии. Ишемия миокарда достигалась путём полного прекращения потока перфузата через систему. За каждым из первых трёх пятиминутных периодов ишемии следовал пятиминутный период реперфузии, после четвёртого периода ишемии реперфузию осуществляли в течение двадцати минут. Затем следовал период длительной тотальной нормотермическои ишемии, продолжавшийся в разных экспериментальных группах соответственно 15, 30, 45 или 60 минут. Восстановление сократительной способности сердечной мышцы после длительной ишемии наблюдали в течение тридцати - сорока пяти минут. Контрольную группу сердец подвергали только аэробной перфузии, длительной ишемии и реперфузии.
Работа по изучению действия экзогенного убихинона проведена на крысах-самцах линии Wistar (возраст 10-11 месяцев), которые были разделены на две группы. Обе группы получали обычный рацион с добавлением творога (20 г/сутки) и моркови, помимо этого, крысы второй группы вместе с водой получали гидрофильную форму убихинона («Кудесан», ООО «НПП Аква-МДТ», Москва). Суточная доза кудесана составляла около 10 мг/кг при среднем потреблении 25 мл воды в сутки.
Перфузия сердец проводилась как описано выше, с некоторыми дополнениями. Раствор Кребса-Хензелейта содержал субстраты, обеспечивавшие максимальную работоспособность сердца [126] - глюкозу (11 мМ), пируват (5 мМ) и инсулин (10 ед/л). Основным критерием сократительной функции изоволюмического сердца был показатель интенсивности сократительной функции (ИСФ), представляющий произведение развиваемого давления и частоты сокращений. Как известно, этот показатель изменяется прямо пропорционально величине потребления кислорода сердечной мышцей. Схема опыта включала определение максимальной ИСФ при градуальном повышении скорости перфузии (рис. 3), в основе этого лежит дополнительная активация сократительного аппарата ионами Са++, входящими через активируемые растяжением ионные каналы [127]. Максимальная работоспособность сердца в данных условиях достигалась при введении в перфузат изопротеренола в концентрации 0,1 мкМ, после чего на фоне прежней скорости перфузии и продолжающегося введения изопротеренола оценивали состояние системы антиоксидантной защиты миокарда посредством введения в перфузат 70 мкМ перекиси водорода в качестве индуктора свободнорадикального окисления.
Скорость потребления кислорода митохондриальной дыхательной цепью определяли с помощью электрода Кларка на полярографе YSI 53 фирмы Yellow Spring Instruments, Inc. (США). Среда инкубации митохондрий для полярографических измерений содержала: 250 мМ сахарозы, 20 мМ HEPES, 1 мМ EGTA (диэтилендинитрилотетрауксусная кислота), 4 мМ КН2Р04, и 3 мМ MgCl2\ рН 7,4. В качестве субстрата дыхания использовали сукцинат в концентрации 5 мМ (при этом среда инкубации содержала также ротенон -ингибитор комплекса I дыхательной цепи, в концентрации 2 мкМ) или глутамат и манат в концентрациях 3 мМ и 4 мМ, соответственно. Для определения дыхательного контроля (степени сопряженности электронного транспорта и окислительного фосфорилирования) добавляли ADP в концентрации 20-250 мкМ.
Перед использованием препарат ферритина диализовали против 0,05 М іСТУа-фосфатного буфера (рН 7,4).З-нитрозоглутатион (GSNO) и динитрозильные комплексы железа (DNIC) с глутатионом в диамагнитной димерной форме получали, смешивая 300 мМ NaN02 и 200 мМ восстановленного глутатиона в кислой среде и растворы FeS04 и глутатиона в молярном соотношении 1:2 в сосуде Тунберга в атмосфере NO соответственно [128]. Препараты GSNO, ONOO и DNIC хранили при - 20 С. Для получения пероксинитрита смешивали охлажденные растворы 1 MNaN02 и 1 М Н202 в 0,3 М H2S04, после чего быстро добавляли равный объём 1,4 М NaOH [85]. Для генерации 0 в разных экспериментах использовали систему ксантин-ксантиноксидаза или диоксид калия (К02).
Регистрация спектров ЭПР
Для определения скорости генерации свободных радикалов кислорода митохондриями использовали спиновую ловушку ТТЯОЛ -диоксибензол-/ -дисульфонат натрия). Образовавшиеся в митохондриях супероксидные радикалы окисляли TIRON до семихинонной формы, интенсивность сигнала ЭПР которойопределялась скоростью генерации радикалов 0 2 [131]. Среда инкубациисодержала: 250 мМ сахарозы, 20 мМ HEPES, 1 мМ EGTA, 4 мМ КН2Р04, 3 мМ MgCl2 и 10 мМ TIRON; рН 7,4. Использовали следующие добавки: 5 мМ сукцината, 3 мМ глутамата, 4 мМ малата, 1 мкг/мл антимицина А, 2 мкМ ротенона, 1 мкМ миксотиазола, 1-2 мг/мл СОД. Концентрация митохондрий в среде инкубации составляла 1 мг/мл.
Спектр ЭПР семихинона TIRON в модельной системе состоит из четырех линий равной интенсивности, возникающих вследствие расщепления на двух неэквивалентных протонах молекулы (рис. 4). Условия регистрации спектров: СВЧмощность 5 мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧмодуляции 0,05 мТл. Выбор величины СВЧ мощности определялся требованием достижения максимальной чувствительности при неискаженной форме сигнала. Для обеспечения постоянства газового состава образцы помещали в тонкостенный (толщина стенок 0,00254 мм) тефлоновый капилляр фирмы Norell, Inc. (США), а запись спектров проводили при непрерывной продувке воздухом. Содержание кислорода в образце определяли по ширине компонент спектра ЭПР нитроксильного радикала TEMPONE-ISN-Dis (-оксо-2,2, 5, 5-тетраметил-пиперидин-);(5-7-оксил-75Л0- Спектры ЭПР TEMPONE-15N-D16 регистрировали при СВЧ мощности 0,5 мВт, СВ частоте 9,15 ГГц, амплитуде В модуляции 0,01 мТл. Низкопольная компонента спектра ЭПР нитроксильного радикала в инкубационной среде в условиях различного газового состава представлена на рис. 5. Измерение амплитуды компонент спектра ЭПР позволило также определить время установления стационарного газового состава в образце при постоянной скорости продувки, которое оказалось равным 5 мин.
Концентрацию DNIC также определяли методом спектроскопии ЭПР. Поскольку использованная димерная форма DNIC не обнаруживается методом ЭПР, ее переводили в мономерную ЭЛР-детектируемую форму. Для этого в растворы добавляли цистеин в молярном соотношении к DNIC 25:1, что приводило к образованию ЭПР-детектируемых мономерных DNIC с цистеином. Спектры ЭПР динитрозильных комплексов железа регистрировали при комнатной температуре (-25 С). Образцы перед измерением помещали в стеклянные каилляры или в ряде экспериментов с генерацией 0 2 - вгазопроницаемые тефлоновые капилляры, как и в экспериментах с митохондриями. Условия записи спектров ЭПР DNIC . СВЧ мощность 10 мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧмодуляции 0,4 мТл. Спин-аддукты DEPMPO регистрировали при тех же условиях при амплитуде В модуляции 0,1 мТл.
Для определения абсолютных значений скоростей образования 0\ митохондриями была использована супероксид-генерирующая система ксантин-ксантиноксида. Скорость генерации супероксидных радикалов в модельной системе измеряли на спектрометре DU-8 фирмы Beckman (США) по реакции восстановления цитохрома с. Реакционная смесь содержала 250 мМ сахарозы, 20 MMHEPES, 1 MMEGTA, 0,2л Мксантина, 0,1 -200мкг/мл ксантиноксидазы и 27 мкМ цитохрома с; рН 7,4. Реакция инициировалась добавлением ксантина. В качестве контрольного образца использовался раствор того же состава, что и реакционная среда, за исключением ксантиноксидазы. За восстановлением цитохрома с следили по изменению разностного оптического поглощения при 550 и 557 нм. Молярный дифференциальный коэффициент экстинкции был принят равным 21,1 мМА-см !. Регистрация спектров ЭПР спиновой ловушки TIRON в ксантиноксидазной системе проводилась в условиях, аналогичных условиям регистрации в митохонриальной суспензии. Образцы также помещали в газопроницаемый тонкостенный капилляр и непрерывно продували воздухом. Реакция инициировалась добавлением ксантиноксидазы (0,1 200 мкг/мл) в реакционную смесь, содержащую 10 мМ TIRON и основные компоненты среды спектрофотометрических исследований, за исключением цитохрома с.
Скорость генерации О] в ксантиноксидазной системе принимали равной чувствительной к супероксиддисмутазе (СОД) скорости восстановления цитохрома с ( «1,5х105М_1с-1) [1]. На рис. 6 приведена экспериментально установленная зависимость скорости восстановления цитохрома с от концентрации ксантиноксидазы. Зависимость проявляла линейный характер на всем диапазоне использованных концентраций. Отклонения от линейности, наблюдаемые со временем при больших количествах ксантиноксидазы, обусловлены восстановлением значительной части цитохрома с реакционной среды. Зависимость величины двойного интеграла спектра ЭПР TIRON от концентрации ксантиноксидазы представлена на рис. 7. Как видно, эта зависимость не является линейной и достаточно хорошо аппроксимируется квадратичной формой, что находится в согласии с ранее установленными закономерностями образования семихинона TIRON в супероксидгенерирующих системах [131]. Подобный характер зависимости обусловлен нестабильностью семихинона, который довольно быстро (Г17 хбсек, [132]) погибает в результате
Часть экспериментов по определению скоростей генерации супероксидных радикалов митохондриями миокарда с использованием спиновой ловушки TIRON проводилась в институте фармакологии и токсикологии университета ветеринарной медицины в Вене. Животных убивали, используя гильотину. Опыты проводили по той же методике, но состав сред выделения и инкубации митохондрий несколько отличался. Среда выделения содержала 300 мМ сахарозы, 20 мМ триэтаноламина, 1 мМ EGTA и 0,1 мг/мл БСА, при 4С рН=7,4, а среда инкубации - 300 мМ сахарозы, 20 мМ триэтаноламина, 4 мМ КН2Р04, 1 мМ DETAPAC, рН=7,4 при 25С. При этом достоверных различий в результатах контрольных экспериментов не наблюдалось.В работе были использованы реактивы фирм Sigma, Aldrich, ICN, Cambridge Isotope Labs и OXIS (США), Serva, BASF, Merk (ФРГ). Все растворы были приготовлены на деионизованной воде, нерастворимые в воде соединения были растворены в дважды перегнанном этаноле.
Статистическую обработку полученных результатов проводили по ґ-тесту и тесту ANOVA, используя приложения программ Origin 5.0 и Origin 6.1 фирмы Microcal Software, Inc. (США). Результаты представлены как среднее значение ± средняя ошибка (М ± т). Различия между экспериментальными данными считали достоверными, если Р 0,05.
Генерация супероксидных радикалов в митохондриях
Зависимости величины стабильного сигнала семихинона TIRON, а также ее квадрата от концентрации митохондрий в среде инкубации проявляли закономерности, установленные ранее для ксантиноксидазной системы. При использованных нами концентрациях митохондрий (0,9 -1,1 мг/мл) скорость образования кислородных радикалов была пропорциональна содержанию митохондриального белка в измеряемом образце. На рис. 13 приведены спектры ЭПР спиновой ловушки TIRONB суспензии митохондрий, окисляющих сукцинат в присутствии антимицина А, в газопроницаемом тефлоновом капилляре. Как видно, супероксид-зависимое окисление ловушки снижалось до нерегистрируемого уровня после четырех минут продувки образца азотом (рис. 13 (3)) и уже в первые секунды после замены азота на воздух сигнал появлялся вновь (рис. 13 (4)). На рис. 14 изображены спектры ЭПР еще одной использованной нами спиновой ловушки - DEPMPO - в модельной системе ксантин-ксантиноксидаза (1, 2) и в суспензии митохондрий. В спектре (1) присутствуют также компоненты сигнала TIRON. В большинстве наших опытов использовался, однако, TIRON, так как чувствительность DEPMPO как ловушки оказалась существенно ниже. Кроме того, из представленного на рисунке спектра (3) видно, что спин-аддукт DEPMPO с супероксидным радикалом достаточно быстро переходит в спин-аддукт DEPMPO-OH, характерный для гидроксильного радикала.
На рис. 15 показаны величины сигналов ЭПР TIRON, записанных через десять минут после введения суспензии митохондрий в газопроницаемый тефлоновый капилляр. В отсутствие субстратов окисления (в первом состоянии дыхательной цепи митохондрий) сигнал ЭПР TIRON не регистрировался. В четвертом состоянии дыхательной цепи, в присутствии сукцината в качестве субстрата, величина скорости генерации супероксидных радикалов, рассчитанная по приведенным выше калибровочным кривым, оказалась равной 0,03 нмоль 0 2 / мин / мг белка. Величина сигнала ЭПР от TIRON сильно возрастала в присутствии антимицина А - ингибитора be \ комплекса дыхательной цепи, блокирующего на матриксной стороне митохондриальной мембраны перенос электрона от цитохрома 65бб на окисленный коэнзим Q. Сукцинат-зависимое окисление TIRON замедлялось при добавлении в среду инкубации ротенона - ингибитора комплекса I дыхательной цепи. При использовании сукцината в качестве субстрата окисления образование существенной части супероксидных радикалов связано с обратным переносом электронов от сукцината на NAD+. Ротенон блокирует обратный перенос электронов в комплексе I и, тем самым, ограничивает локализацию центров генерации радикалов 0 2 Ъс\ сегментом дыхательной цепи. Образование Рис. 15. Зависимость величины сигнала ЭПР TIR0N от присутствия в суспензии митохондрий сердца крысы субстратов окисления и ингибиторов дыхательной цепи. Добавки в инкубационную смесь: сукцинат (1), сукц. и ротенон (2), сукц. и антимицин А (3), сукц., антимицин А и ротенон (4), глутумат, малат, и сукц. (5), глутумат, малат, сукц. и ротенон (6), глутумат, малат, сукц. и антимицин А (7), глутамат, малат, сукц., антимицин А и ротенон (8). Температура образца 25С. супероксидных радикалов в Ъс\ сегменте происходит благодаря прямой реакции с кислородом нестабильной фракции семихинонов коэнзима Q. Добавление ротенона в присутствии глутамата и малата в инкубационной среде приводило к заметному увеличению величины сигнала ЭПР.
Это является свидетельством того, что супероксидные радикалы в комплексе I образуются по субстратную сторону от места действия ротенона. В присутствии другого ингибитора g-цикла - миксотиазола - сигнал уменьшался до нерегистрируемого уровня. Супероксиддисмутаза и цианид подавляли сукцинат-зависимое окисление TIRON на 90 + 95%, что свидетельствует об образовании семихинонов TIRON за счет реакции с кислородными радикалами, генерируемыми дыхательной цепью. Максимального значения скорость сукцинат-зависимой генерации кислородных радикалов митохондриями достигала в присутствии антимицина А и была равна 0,9 ±0,2 нмолъ О / мин /мг белка. На рис. 16 и 17 показаны величины сигнала ЭПР TIRON и скорости образования супероксидных радикалов соответственно в суспензии митохондрий, выделенных из сердец контрольных групп после аэробной перфузии и последующей ишемии разной длительности. Скорость сукцинат-зависимой генерации 0 в митохондриях, вычисленная по интенсивности сигнала ЭПР TIRON, в отсутствии ингибиторов и в присутствии антимицина А в среде инкубации, была равна (при 25 С) соответственно 0,26 и 4,0 нмолъ 0 2 /мин /мг белка после 30 минут ишемии и 0,25 и 3,35 нмолъ О / мин / мг белка в конце 45-минутной ишемии. В присутствии антимицина А скорость генерации супероксида в митохондриях была равна 0,5 нмолъ 0 2 /мин /мг белка после аэробной перфузии, 1,1 нмолъ О / мин / мг белка после ишемии длительностью 15 минут и около 1,0 нмолъ О / мин / мг белка после 50-минутной ишемии. Видно, что с увеличением длительности тотальной ишемии до 30 минут увеличивается значение скорости
