Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 11
1.1. Активные формы кислорода и метаболиты оксида азота в прооксидантных и антиоксидантных процессах в клетках миокарда
1.1.1. Активные формы кислорода и некоторые их свойства
1.1.2. Образование активных форм кислорода митохондриями сердца 14
1.1.3. Нарушения метаболизма кардиомиоцитов, вызванные ишемией 21
1.1.4. Нарушения метаболизма кардиомиоцитов, вызванные адриамицином23
1.1.5. Активные формы азота и их свойства 27
1.1.6. Активные формы азота в митохондриях 29
1.1.7. Динитрозильные комплексы железа с тилоловыми лигандами 34
1.2. Антиоксиданты 38
1.2.1. Коэнзим Q — переносчик электронов митохондриальной дыхательной цепи и антиоксидант 38
1.2.2. Митохондриально-направленные антиоксиданты 40
2. Материалы и методы исследования 47
2.1. Получение изолированных митохондрий 47
2.2. Определение функциональной активности митохондрий 48
2.3. Регистрация спектров эпр 48
2.4. Определение абсолютных зна чений скоростей генерации супероксидных радикалов 53
2.5. Получение динитрозильных комплексов железа и запись спектров эпр 57
2.6. Исследование свободнорадикальных форм производных убихинона и пластохинона 57
3. Результаты и обсуждение 61
3.1. Функциональная активность митохондрий сердца 61
3.2. Генерация супероксидных радикалов в митохондриях сердца в комплексе iii дыхательной цепи 63
3.3. Генерация супероксидных радикалов в изолированных митохондриях сердца: эффект гипоксии-реоксигенации 63
3.4. Образование супероксидных радикалов в изолированных митохондриях сердца: эффект адриамицина (доксорубицина) 69
3.5. Взаимодействие л/о и д н кж с митохондриями, генерирующими супероксид 78
3.6. Свободнорадикальные интермедиа ты (семихиноны) митохондриально-направленныхантиоксидантов и их аналогов 82
Заключение 98
Выводы 101
Список цитируемой литературы 102
- Активные формы кислорода и некоторые их свойства
- Динитрозильные комплексы железа с тилоловыми лигандами
- Определение функциональной активности митохондрий
- Генерация супероксидных радикалов в митохондриях сердца в комплексе iii дыхательной цепи
Введение к работе
В настоящее время можно считать доказанным, что вклад митохондрий в функции клеток сердечной мышцы значительно шире, чем только роль в энергетическом метаболизме кардиомиоцитов в качестве основного поставщика АТР. Митохондрии сердца имеют ключевое значение в регуляторных и сигнальных процессах, являющихся ответом на физиологические стрессы, такие как гипоксия и реоксигенация, нарушение баланса между прооксидантными и антиоксидантными процессами в клетках, действие различных гормонов и фармакологических препаратов. В связи с крайне важной ролью митохондрий в жизнедеятельности клеток, в последнее десятилетие огромное внимание уделяется исследованию т.н. митохондриальных болезней, которые включают нарушения, тем или иным образом влияющие на митохондриальные функции и/или вызваны повреждениями митохондриальной ДНК. В случае митохондриальных болезней, клетки подвержены окислительному дисбалансу. Основное воздействие при этом испытывают органы с интенсивным окислительным метаболизмом и высокой энергетической потребностью: сердце, скелетные мышцы, почки и печень.
Необратимые повреждения компонентов клеток миокарда, являющиеся, в конечном счете, причиной их гибели в результате апоптоза и/или некроза, в первую очередь, обусловлены избыточным образованием активных форм кислорода и токсичных метаболитов оксида азота в условиях окислительного стресса. Образование свободных радикалов кислорода в биологических системах происходит постоянно и является как прямым результатом функционирования специальных ферментативных систем, так и следствием побочного процесса множества окислительно-восстановительных реакций. Значительный интерес в отношении короткоживущих свободных радикалов кислорода (время жизни супероксида ~10'6 с, гидроксильного радикала ~10"9 с) обусловлен, прежде всего, их высокой химической активностью. Наличие неспаренного электрона на л*2р-орбитали кислорода приводит к тому, что окисление практически любого клеточного компонента (мембранных липидов, белков и нуклеиновых кислот)
становится термодинамически выгодным процессом. В обычных условиях, когда скорость образования активных форм кислорода и азота относительно невысока, антиоксидантные системы клетки в состоянии не допускать возникновения окислительного стресса. Однако, в условиях пониженного энергетического метаболизма клеток миокарда, при существенном увеличении внутриклеточной концентрации кислорода, могут происходить значительные сдвиги в редокс-потенциалах переносчиков дыхательной цепи, способствующие резкому возрастанию скорости генерации митохондриями свободных радикалов кислорода. Применение ингибиторов элекгронного транспорта, обладающих специфичностью по отношению к различным участкам дыхательной цепи, позволяет установить расположение центров, наиболее активно генерирующих супероксидные радикалы, а также оцепить относительный вклад каждого из этих центров в суммарную величину скорости образования активных форм кислорода в митохондриях.
Хорошо известно, что активные формы кислорода и азота участвуют в развитии патологических состояний сердечной мышцы, возникающих после длительной ишемии. Ишемия характеризуется недостаточным снабжением ткани кислородом и необходимыми метаболитами и обусловлена нарушениями в системе кровообращения. Вследствие энергетической недостаточности во время ишемии происходит активация анаэробного гликолиза, направленного на синтез АТР, тем не менее, гликолиза оказывается недостаточно для обеспечения потребностей клеток миокарда. Как результат, в клетках возникают множественные нарушения ионного гомеостаза, следствием которых является невозможность нормального функционирования сердечной мышцы. Следующая за длительной ишемией реоксигенация миокарда сопровождается значительными тканевыми повреждениями и нарушениями сократительной функции - появлением аритмий и временной механической дисфункции. Это явление, получившее название "кислородный парадокс", обусловлено резким увеличением образования активных форм кислорода при восстановлении нормального уровня внутриклеточного кислорода.
Адриамицин (доксорубицин) - антибиотик, являющийся одним из наиболее часто применяемых лекарственных препаратов при химиотерапии злокачественных опухолей человека. В то же время хорошо известно, что адриамицин характеризуется рядом нежелательных побочных эффектов, в первую очередь, значительной кардиотоксичностью. Опубликовано множество работ, авторами которых были предложены разнообразные молекулярные механизмы, объясняющие вызываемую адриамицином кардиотоксичность. В настоящее время считается, что терапевтическое и кардиотоксическое действия адриамицина представляют собою единый мультифакторный процесс, инициированный окислительным стрессом и приводящий, в конечном счете, к апоптозу - процессу запрограммированной гибели клеток. Важным фактором, который может опосредовать токсическое действие адриамицина на клетки сердечной мышцы, является высокое сродство адриамицина к кардиолипину — анионному фосфолипиду, специфичному для внутренней мембраны митохондрий. Кардиолипин важен не только для структуры и функций митохондрий, но также для общего энергетического метаболизма и выживания клетки. Связывание адриамицина с митохондриальной мембраной ведет к изменению ее свойств, при этом изменяется функционирование электронных переносчиков в мембране. Таким образом, накопление редокс активного адриамицина в митохондриях сердца должно усиливать генерацию активных форм кислорода и азота этими органеллами.
В связи с тем, что митохондрии являются главным источником активных форм кислорода в клетке, эти органеллы нуждаются в постоянной защите от повреждений, вызываемых окислительным стрессом. Такая защита обеспечивается ферментативными системами, а также различными низкомолекулярными антиоксидантами. Наиболее важными среди антиоксидантов оказались коэнзим Q и витамин Е. Однако, их использование недостаточно эффективно. Одной из причин этого, возможно, является то, что только очень малые количества таких антиоксидантов могут проникнуть сквозь клеточные мембраны и достигнуть митохондрий. Поэтому решением этой проблемы было изобретение антиоксидантов, избирательно накапливающихся в митохондриях.
Такие митохондриально-направленные антиоксиданты получили, присоединив трифенилфосфоний - липофильный катион к убихинону (mitoQ) или сс-токоферолу QnitoVitE). Полученные антиоксиданты легко проходят через биологические мембраны и в несколько сот раз лучше накапливаются внутри митохондрий, обеспечивая эффективную защиту от окислительного стресса. Оказалось, что при незначительном увеличении дозы mitoQ он может вести себя как прооксидант, что ограничивает его применение в медицине. Поэтому были предприняты попытки создать другой возобновляющийся антиоксидант, не обладающий подобным побочным действием. Этого удалось добиться, заменив убихинон на пластохинон {SkQI). В одинаковых условиях для mitoQ концентрации, вызывающие анти- и прооксидантное действие, различались меньше, чем в два раза, а для SkQI это различие возросло до тридцати раз.
Диссертация посвящена исследованию механизмов образования и превращения свободных радикалов кислорода и метаболитов оксида азота в организме и изучению характеристик свободнорадикальных интермедиатов митохондриально направленных антиоксидантов — производных убихинона и пластохинона.
Цель работы
Целью работы являлось выяснение закономерностей регуляции процессов образования и гибели активных форм кислорода и азота в клетках сердечной мышцы и модельных системах в условиях, моделирующих окислительный стресс и защитное действие антиоксидантных систем клетки.
Задачи работы
Исходя из поставленной цели, в диссертации решались следующие задачи: 1. Изучение влияния длительности гипоксии и реоксигенации на генерацию активных форм кислорода митохондриями сердца и функциональные характеристики дыхательной цепи митохондрий.
Изучение воздействия адриамицина — противоопухолевого препарата широкого спектра действия — на генерацию супероксидных радикалов митохондриями сердца.
Выяснение взаимосвязи между генерацией активных форм кислорода митохондриями сердца и образованием и деструкцией динитрозильных комплексов железа.
Определение спектральных и кинетических характеристик ссмихинонов митохондриально-направленных антиоксидантов - производных убихинона и пластохинона — и их аналогов.
Научная новизна
Основными новыми результатами и положениями, которые составляют предмет диссертации, являются:
С помощью спектроскопии ЭПР спиновых ловушек впервые изучена кинетика образования и гибели активных форм кислорода в изолированных митохондриях сердца в условиях небольшого парциального давления кислорода в среде инкубации.
Впервые показано, что гипоксия и последующая реоксигенация изолированных митохондрий сердца приводят к увеличению скорости генерации супероксидных радикалов, однако, в отличие от митохондрий, выделенных после ишемии-реперфузии миокарда, эффект не зависит от длительности периода гипоксии.
Впервые продемонстрировано, что адриамицин - противоопухолевый препарат широкого спектра действия - вызывает изменения в митохондриях сердца, приводящие к значительному увеличению скорости генерации супероксидных радикалов, обусловленному взаимодействием с молекулярным кислородом электронных переносчиков комплекса III и свободнорадикальных интермедиатов редокс-цикла адриамицина.
Впервые обнаружено, что динитрозильные комплексы железа могут являться перехватчиками активных форм кислорода в системах, моделирующих окислительный стресс в клетках сердечной мышцы.
Проведено исследование спектральных и кинетических характеристик семихинонных свободных радикалов митохондриально-направленных антиоксидантов - производных убихинона и пластохинона — и их аналогов. Впервые показано, что анион-радикалы mitoQ, SkQl, SkQ3 и их коротко-цепочечные аналоги отличаются существенным образом распределением плотности неспаренного электрона по атомам хиноидного кольца.
Впервые установлено, что митохондриально-направлснные антиоксиданты mitoQ и SkQl могут действовать также как прооксиданты и образовывать в модельных системах супероксидные радикалы в процессе одноэлектронного окисления молекулярным кислородом.
Научно-практическая ценность диссертации
Представленные в диссертации экспериментальные данные могут быть использованы для выяснения молекулярных механизмов процессов, влияющих на энергетический метаболизм сердечной мышцы в условиях ишемии миокарда, а также для разработки методов лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы с помощью митохондриально-направленных антиоксидантов.
Активные формы кислорода и некоторые их свойства
Термин активные формы кислорода (АФК) испльзуется для обозначения различных молекул и свободных радикалов - производных кислорода. Молекулярный кислород в основном состоянии является би-радикалом, содержащим два неспаренных электрона па внешней оболочке (триплетное состояние). Основными активными формами кислорода являются супероксидный радикал (02 ), перекись водорода (Нг02), гидроксильный радикал (ОН ) и синглетный кислород ( 02). Первичной формой и предшественником большинства активных форм кислорода принято считать супероксид, образующийся в результате одноэлектронного восстановления кислорода. Основными источниками супероксидных радикалов в биологических системах являются фагоцитирующие клетки, где образование супероксидного радикала является ферментативным процессом, который запускается при активации лейкоцита в результате взаимодействия с чужеродным агентом, комплекс ксантин-ксантиноксидаза, участвующий в распаде пуринов, в котором ксантин, метаболит распада пуринов, окисляется кислородом до мочевой кислоты с образованием 0 2 и дыхательная цепь митохондрий, переносящая электроны от субстратов окисления на кислород с восстановлением его до воды. Обнаружено, что при функционировании дыхательной цепи 2% 02 восстанавливается до супероксидного радикала в результате прямого взаимодействия кислорода с переносчиками дыхательной цепи. Супероксид может выступать в качестве окислителя многих биологически важных молекул.
Молекула Н202 не песет электрического заряда. Она легко проникает сквозь мембраны, преодолевает относительно большие расстояния, способна добираться до важнейших участков клетки и оказывать на них разрушительное воздействие [5]. В литературе имеются данные о том, что перекись водорода путешествует внутри клетки не только в свободном виде, но и в виде комплексов с различными соединениями, включая амипо- и дикарбоновые кислоты, пептиды, основания нуклеиновых кислот, нуклеотиды. Предположительно, в этих случаях создаются связи типа водородных, причём не происходит деформации в структуре молекул- партнёров. Комплексы возникают быстро и легко, значительно увеличивают растояние переноса Н202, за счёт повышения в сотни раз порога её разложения, а именно, за счёт недоступности перекиси водорода в составе комплекса для утилизирующих её молекул, таких, как каталаза, глутатион-пероксидаза и др. [6].
Время жизни перекиси водорода косвенно может повышать её предшественник - супероксидный радикал. Он инактивирует каталазу и глутатионпероксидазу, которые являются тушителями перекиси водорода [4].
Гидроксильный радикал считается наиболее токсичной формой активного кислорода. ОН способен окислить любую биомолекулу, в том числе ДНК. Однако, именно крайне высокая активность не позволяет ему проникать далеко от места появления: ОН практически моментально вступает во взаимодействие с молекулами ближайшего окружения. Взаимодействие гидроксильных радикалов с молекулами ненасыщенных жирных кислот играет основную роль в инициации цепных реакций перекисного окисления липидов в биологических мембранах. НО +RH H20 + R R + 02 ROO Для образования синглетного кислорода необходимо обратить спин одного из неспаренных электронов в молекуле кислорода [7]. Необходимая энергия может быть поставлена, например, молекулой сенсибилизатора, предварительно возбужденной светом. Преимущественно 102 взаимодействует с фосфолипидами, а-токоферолом, а также каротиноидами сетчатки. Роль активных формы кислорода в передаче сигналов На протяжении длительного времени в биологической и медицинской литературе основной акцент делали на вредных эффектах супероксидных радикалов. Они действительно существуют, но также очевидно, что образование АФК приносит и пользу. Их роль в защите организма велика. Они не только включают фагоцитоз опасных клеток, но и запуск воспалительных реакций и иммунных процессов. Эйкозаноиды - гормоны, производные С?о-полиненасыщенных жирных кислот типа арахидоновой. Их разделяют на циклические (простаноиды) и линейные (например, лейкотриены). Промежуточными метаболитами являются пероксиды. Простаноиды защищают от повреждений клетки сердца и других органов. Лейкотриены, как и простаноиды, способствуют развитию воспаления (это первично защитная реакция организма), лейкотриен С4 и его метаболит D4 стимулируют сокращения мышц [8].
Активные формы кислорода стимулируют накопление в клетке вторых посредников - циклических нуклеотидов: сАМР и cGMP, при этом cGMP образуется в результате активации НО гиалоплазматической гуанилилциклазы. АФК вызывают накопление ионов СсГ в цитозоле и стимуляцию фосфорилирования белков в результате активации протсинкиназ и протеинтирозинкиназ и ингибирования протеинфосфатаз [9].
В кардиомиоцитах супероксидные радикалы генерируются главным образом в митохондриях, но, кроме того, активные формы кислорода могут образовываться 7У/Ш(РЩ-оксидазой, цитохром р -оксидазой и синтазой оксида азота [10]. Кардиомиоциты подвержены постоянному воздействию небольшого количества свободных радикалов, образующихся в результате прямого взаимодействия электронных переносчиков митохондрий с молекулярным кислородом. При нормальном протекании реакций клеточного метаболизма появившиеся в кардиомиоцитах активные формы кислорода нейтрализуются эндогенной антиоксидантной системой клеток, представленной антиоксидантными ферментами - супероксиддисмутазой (СОД), каталазой, глутатионпероксидазой (GSH-Px) и низкомолекулярными антиоксидантами (а-токоферол, фенольная форма коэнзима Q!0, /?-каротин, аскорбиновая кислота и другие) [11,12,13]. Марганцевая супероксид дисмутаза наиболее интересна, так как способна катализировать превращение супероксида в перикись водорода в месте его образования в митохондрии. После чего перикись водорода обезвреживается каталазой в пероксисомах и цитозоле или глутатион пероксидазой в митохондрии и цитозоле. Антиоксидантные ферментов, которые по разному регулируется, в том числе фактором роста, цитокинами [5].
Динитрозильные комплексы железа с тилоловыми лигандами
Динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с тиоловыми лигандами были обнаружены в тканях животных и дрожжах в 60-х годах XX в. одновременно тремя группами исследователей в СССР, США и Великобритании [118,119]. Для ДНКЖ характерен анизотропный сигнал ЭПР с g=2,03. Парамагнитные центры (2,03 комплексы) были определены после того, как удалось продемонстрировать, что форма и другие параметры сигнала ЭПР полностью совпадают с формой и параметрами сигнала ЭПР водорастворимых низкомолекулярных ДНКЖ с цистеиновыми лигандами в замороженном растворе [120]. При обработке тканей животных и дрожжевых клеток газообразным оксидом азота интенсивность сигнала 2,03 возрастала, что подтверждает их принадлежность к динитрозильным комплексам железа. Такие же результаты были получены при пероральном введение нитрита животным [121]. В настоящее время, нитрит считается одним из основных источников NO в организме животных и человека, что обусловлено способностью его протонированной формой (азотистой кислота) после восстановления образовывать NO [122]. Источником NO для образования ДНКЖ в культуре клеток животных и человека может также быть МЭ-синтазная реакция [123].
До сих пор исследовалась биологическая роль либо свободного оксида азота, либо 5-нитрозотиолов, однако, в последнее время, благодаря наличию ряда свойств ДНКЖ с тиоловыми лигандами стали вызывать значительный интерес.
Объединение двух молекул NO в ДНКЖ способствует их окислению в нитрозильные катионы (NO1 ), которые удерживаются внутри комплекса и принимают участие в 5-нитрозилировании тиолов [124]. Кроме того, ДНКЖ сами могут являться сигнальными агентами и регуляторами экспрессии генов, апоптоза, ферментативной активности и метаболизма железа. Белковые ДНКЖ играют роль депо N0, но их основная функция, как и в случае с ДНКЖ содержащими нетиоловые лиганды, состоит в стимулировании S-нитрозилирования тиолов. Вместе с тем, низкомолекулярные ДНКЖ контролируют обратную реакцию, то есть, передачу Fe(NO)2 групп белкам, что ведет к разрушению железо-серных кластеров белков и стимулирует экспрессию генов. Этот процесс сопровождается ингибированием ряда ферментов, таких как Na,K-ATPa3a, глутатион- -трансфераза, глутатион пероксидаза. [125]. И, наконец, ДНКЖ с тиоловыми лигандами обладают мощными гипотензивными и вазодилятаторными свойствами: они подавляют агрегацию тромбоцитов, ускоряют восстановление повреждений.
Сильное (по сравнению с NO) релаксирующее действие ДНКЖ с тиоловыми лигандами на изолированный сосуд было показано уже в 1990 гг [126]. Считается, что в этой системе ДНКЖ являлись донорами NO, вызывающими расширение сосудов.
Доскональные знания о происхождении и механизмах образования ДНКЖ с тиоловыми лигандами (комплекс 2.03) является важным условием для объяснения их функциональной активности. Важной чертой ДНКЖ с тиоловыми лигандами, их индикатором, является их сигнал ЭПР (так называемый сигнал с -фактором 2.03). В живой природе встречается огромное разнообразие ДНКЖ связанных с тиоловыми группами белков (белковых ДНКЖ). Форма и ширина их сигналов ЭПР определяются анизотропией g-фактора (g±= 2,04; gD= 2,014) и сверхтонкой структурой (СТС) [127], которая не меняется при возрастании температуры от 77К до температуры окружающей среды. При таких условиях подвижность белка слишком мала, чтобы получить усреднение анизотропии g-фактора и СТС; такие различия более характерны для низкомолекуляриых цистеиновых и глутатиоиовых ДНКЖ. При комнатной температуре ДНКЖ дает синглетный сигнал с полушириной 0,7 мТл при gis0= 2,03 и разрешенной СТС с 13 компонентами. Образование этого сигнала является результатом сверхтонкого взаимодействия неспаренного электрона с ядрами азота двух NO -лигандов и протонами четырех метиленовых групп, находящихся вблизи от атома серы двух цистеиновых или глутатионовых лигандов [128].
Анализ различных характеристик сигнала 2,03 показывает, что ДНКЖ имеющим этот сигнал соответствует формула: {(RS )2Fe+(NOv)2}+, где RS тиоловые группы белков; однако, также возможна замена тиоловых групп нетиоловыми лигандами. Заряд нитрозильных катионов (NO ) может быть нейтрализован отрицательно заряженными ионами, например низкомолекулярными тиолами. В этом случае ДНКЖ характеризуются формулой: {(RS)2Fe+(NO+ SR )2} [129]. Эффективный электронный спин S=l/2; неспаренный электрон в основном локализован на dz2 орбирали атом железа с d электронной конфигурацией. Образование парамагнитных ДНКЖ с тиоловыми и нетиоловыми анионными лигандами включает диспропорционирование двух нейтральных молекул N0, что приводит к образованию нитрозильных катиона и нитроксильного аниона: 2NO NOi+NO\ Эта реакция является стехиометрической и завершается образованием N02 и N20: 3NO- N02 + N20 [130]. При образовании ДНКЖ две молекулы NO связываются с Fe" ионами, d-орбитали которых способствуют миграции электронов между молекулами NO и образованию парамагнитных ДНКЖ. Исходя из этого общая реакция может быть записана в таком виде: Ft +2Г + 3NO + Fe2" -+ {(L)2Fe+(NO+)2}+2 + Vz(N20 + H20), где L анионные лиганды (включая тиолы). Основной вклад в образование ДНКЖ дает слабо связанная форма эндогенного негемового железа, которое формирует лабильный пул железа [131]. Биологическое действие NO во многом зависят от способности его ионизированной формы, то есть нитрозильного катиона, вызывать S 37 нитрозилирование белков и ферментов. Исследование этих реакций, с использованием ионов Fe"+ показали, что вновь образовавшиеся ДНКЖ способствуют превращению N0 в NO+ и защищают последний от гидролиза. Низкомолекулярные формы ДНКЖ стимулируют S-нитрозилирование белков и низкомолекулярных тиолов (глутатион или цистеин) путем передачи нитрозильного катиона. Другой путь состоит в передаче Fe(NO)2 групп на тиолы и ведет к образованию ДНКЖ с тиоловыми лигандами. Однако, быстрое накопление ДНКЖ вряд ли возможно, если учитывать разрушающее действие супероксида на ДНКЖ. З -нитрозотиолы более устойчивы к действию супероксида [132], поэтому реакции низкомолекулярных ДНКЖ с тиолами ведут к быстрому накоплению S-нитрозотиолов в клетках и тканях. Видимо это действие ДНКЖ является его главной физиологической ролью в живых системах.
В отличие от NO влияние динитрозильных комплексов железа на процессы свободнорадикального окисления остается малоизученным, хотя все входящие в состав ДНКЖ компоненты могут участвовать как в анти-, так и в прооксидантных реакциях. Недавно показано, что динитрозильные комплексы железа с тиоловыми лигандами ингибируют индуцированное миоглобином и органическими гидропероксидами окисление /?-каротина [133]. Установлено также, что эти ДНКЖ более эффективно, чем б -нитрозотиолы восстанавливают оксоферрилформу миоглобина. В связи с перечисленным несомненный интерес представляет исследование взаимодействия ДНКЖ с активными формами кислорода, органическими радикалами и феррилформами гемопротеидов, особенно миоглобина. Несомненный интерес представляет изучение механизмов образования ДНКЖ в модельных биологических системах.
Определение функциональной активности митохондрий
Для определения скорости генерации супероксидных радикалов митохондриями в качестве спиновой ловушки использовали TIRON (4,5-диоксибензол-1,3-дисульфонат натрия). Многими исследователями установлено (см., например, [32,33]), что T1RON может использоваться как эффективный антиоксидант - проникающая в клетки ловушка для супероксидных радикалов. TIRON имеет высокую, почти сравнимую с супероксид дисмутазой, константу скорости взаимодействия с 0{ ( Ю8 М"1 с"1 для TIRON и 109 М"1 с"1 для Мп2+-SOD, соответственно). Образовавшиеся в митохондриях супероксидные радикалы окисляли TIRON до семихинонной формы, интенсивность сигнала ЭПР которой определялась скоростью генерации радикалов 0 2 . Среда инкубации содержала: 250 мМ сахарозы, 20 мМ HEPES, 1 мМ EGTA, 4 мМ КН2Р04, 3 мМ MgCU и 10 мМ TIRON; рН 7,4. Использовали следующие добавки: 5 мМ сукцината, 3 мМ глутамата, 4 мМ малата, 1 мкг/мл антимицина А, 2 мкМ ротенона, 1 мкМ миксотиазола, 1-2 мг/мл SOD. Концентрация митохондрий в среде инкубации составляла 1 мг/мл.
Спектр ЭПР анион-радикала TIRON состоит из четырех линий равной интенсивности, возникающих вследствие расщепления на двух неэквивалентных протонах молекулы (рис. 4а). Условия регистрации спектров: СВЧ мощность 5 мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0,05 мТл. Выбор величины СВЧ мощности определялся требованием достижения максимальной чувствительности при неискаженной форме сигнала (рис. 46). Для обеспечения постоянства газового состава образцы помещали в газопроницаемые капилляры PTFE 22 (внутренний диаметр 0,635 мм, толщина стенок 0,051 мм) фирмы Zeus Industrial Products, Inc. (США), а запись спектров проводили при непрерывной продувке соответствующим газом. Содержание кислорода в образце определяли по ширине компонент спектра ЭПР нитроксильного радикала TEMPONE- 5N-D16 (4-оксо-2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-)/б-1-оксил- N). Спектры ЭПР этого нитроксильного радикала регистрировали при СВЧ мощности 0,5 мВт, СВ частоте 9,15 ГГц, амплитуде ВЧ модуляции 0,01 мТл. Низкопольная компонента спектра ЭПР TEMPONE- N-Djg в инкубационной среде в условиях различного газового состава представлена на рис. 5. Измерение ширины и амплитуды компонент спектра ЭПР позволило также определить время установления стационарного газового состава в образце при постоянной скорости продувки, которое оказалось равным 4-5 мин.
Содержане кислорода во время опытов контролировалось с помощью измерителя ОХ2000 фирмы Oldham (Франция), а также с помощью стандартного образца фталоцианина лития (ЫРс). На рис. 6 показана калибровочная кривая ЫРс.
Для определения абсолютных значений скоростей образования ОТ в митохондриях и модельных системах была использована супероксид-генерирующая система ксантин-ксантиноксида. Скорость генерации супероксидных радикалов в модельной системе измеряли на спектрометре DU-8 фирмы Beckman (США) по реакции восстановления цитохрома с. Реакционная смесь содержала 250 мМ сахарозы, 20 мМ HEPES, 1 мМ EGTA, 0,2 мМ ксантина, 0,1-200 мкг/мл ксантиноксидазы и 27 мкМ цитохрома с; рН 7,4. Реакция инициировалась добавлением ксантина. За восстановлением цитохрома с следили по изменению разностного оптического поглощения при 550 и 557 нм. Молярный дифференциальный коэффициент экстинкции был принят равным 21,1 мМ " -см " . Регистрация спектров ЭПР спиновой ловушки TIRON в ксантиноксидазной системе проводилась в условиях, аналогичных условиям регистрации в митохонриальной суспензии. Образцы таюке помещали в газопроницаемый капилляр PTFE 22 и непрерывно продували воздухом. Реакция инициировалась добавлением ксантиноксидазы (0,1-200 мкг/мл) в реакционную смесь, содержащую 10 мМ TIRON и основные компоненты среды спектрофотометрических исследований, за исключением цитохрома с.
Скорость генерации 0 { в ксантиноксидазной системе принимали равной чувствительной к супероксиддисмутазе скорости восстановления цитохрома с (Кх 1,5x105 Мчс ). На рис. 7 приведена экспериментально установленная зависимость скорости воссіановления цитохрома с от концентрации ксантиноксидазы, которая проявляла линейный характер на всем диапазоне использованных концентраций. Отклонения от линейности, наблюдаемые со временем при больших количествах ксантиноксидазы, обусловлены восстановлением значительной части цитохрома с реакционной среды.
Семихинонные свободные радикалы являются промежуточными продуктами в окислительно-восстановительных реакциях, протекающих с участием хиноидных соединений. Методы ЭПР позволяют изучать электронную структуру образовавшихся парамагнитных интермедиатов путем определения значений g-тензора и констант сверхтонкого взаимодействия, чувствительных к локальному окружению радикала, в частности, образовавшимся водородным связям. Нами исследованы характеристики спектров ЭПР свободнорадикальных (семихинонных) форм mitoO (2,3-диметокси-5-метил-6-децилтрифенил-фосфоний-1,4-бензохинона), SkQl (2,3-диметил-6-децилтрифенилфосфоний-1,4-бензохинона), SkQ3 (2,3,5-триметил-6-децилтри-фенилфосфоний- 1,4-бензо-хинона), SkQ5 (2,3-диметил-6-пентилтрифенилфосфоний-1,4-бензохинона) и ряда их аналогов: CoQ; (2,3-диметокси-5-метил-6-(3-метил-2-бутенил)-1,4-бензохинона), CoQ0 (2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинона), decyl PQ (2,3-диметил-6-децил-1,4-бензохинона), РОо (2,3-диметил-1,4-бензохинона) и TMQ (2,3,5-триметил-1,4-бензохинона). Хиноны были растворены в этаноле, для их перевода в восстановленную форму использовали NaBH4. Семихиноны образовались в процессе автоокисления соответствующих хинолов в этаноле или в смеси этанол-водный буфер (рН 7,8-8,5), спектры ЭПР регистрировали на спектрометре Е-109Е при комнатной температуре ( 25С). Образцы помещали либо в стеклянные капилляры, либо в газопроницаемые капилляры PTFE 22, что позволяло проводить запись спектров при варьируемом парциальном давлении кислорода. Содержание кислорода в инкубационной смеси определяли по ширине компонент спектра ЭПР нитроксильного радикала TEMPONE-D-I5N или по ширине синглетного сигнала ЭПР ЫРс. Все экспериментальные спектры производных пластохинона и убихинона были симулированы с помощью программы WinEPR SimFonia фирмы Bruker (ФРГ) (рис. 9). Для исследования кинетики образования и стабильности семихинонных форм SkQl и mitoQ использовались липосомы, их получали из кардиолипина и фосфатидилхолина с арахидоновой или линоленовой кислотой. Кардиолипин и фосфатидилхолин брали в молярном соотношении 1:2 и растворяли в этаноле, далее добавляли фосфатный буфер (рН = 7,4). Для образования липосом содержание этанола в смеси не должно превышать 10%. Полученную таким образом смесь пропускали через устройство фирмы Hamilton Inc. (США) для получения липосом.
Генерация супероксидных радикалов в митохондриях сердца в комплексе iii дыхательной цепи
На рис. 12 приведены спекірьі ЭПР спиновой ловушки TIRON в супероксид-генерирующей системе ксангиноксидаза-ксантин, записанные в варьируемых условиях оксигенации. Как показано на этом рисунке, при переходе к гипоксии (замена внешней газовой среды с воздуха на азот) интенсивность сигнала ЭПР от TIRON стремительно падает, что соответствует установлению равновесия между новой газовой средой и реакционной смесью. Реоксигенация сопровождается быстрым появлением сигнала ЭПР от TIRON (рис. 12, спектр 4), достигающим прежней интенсивности за 4-6 минут. Цикл оксигенация/гипоксия/реоксигенация может быть повторен несколько раз без значимого изменения максимальной интенсивности сигнала ЭПР от TIRON. Полученные результаты демонстрируют, что генерация супероксидных радикалов в модельной системе ксантиноксидаза-ксантин возможна даже при низком парциальном давлении кислорода в реакционной смеси, а скорость образования Ог во время реоксигенации практически не зависит от предшествующего периода гипоксии.
С помощью спиновой ловушки TIRON нами проведено детальное исследование зависимости закономерностей генерации супероксидных радикалов изолированными митохондриями сердца от условий оксигенации. На рис. 13 представлены спектры ЭПР от TIRON в суспензии митохондрий, генерирующих супероксид в присутствии сукцината (субстрата для комплекса II) и антимицина А. Из этого рисунка видно, что переход из аэробных условий в условия гипоксии (смена газовой среды с воздуха на азот) сопровождался падением интенсивности сигнала от семихинонов TIRON , образовавшихся в результате окисления спиновой ловушки TIRON супероксидными радикалами. Реоксигенация, в свою очередь, приводит к быстрому возрастанию сигнала ЭПР от TIRON, а после нескольких минут реоксигенации скорость образования супероксидных радикалов окажется больше, чем до гипоксии. При этом, повторный цикл гипоксии-реоксигенации не приводил к дополнительному росту интенсивности сигнала ЭПР, т.е. к значимому увеличению скорости генерации 0{ . В случае использования субстратов комплекса I - глутамата и малага -кинетическое поведение сигнала ЭПР от TIRON было похоже на предыдущий эксперимент (спектры не показаны). Следует отметить, что инициированное относительно короткой гипоксией (ишемией) увеличение скорости генерации супероксидных радикалов митохондриями сердца может иметь отношение к запуску процесса ишемического прекондициоиирования в клетках миокарда.
Обращает на себя внимание быстрый рост интенсивности сигнала ЭПР от TIRON после замены газовой среды с азота на воздух (начало реоксигенации, см. рис. 13). В связи с этим обстоятельством, представляло интерес исследовать генерацию супероксидных радикалов изолированными митохондриями сердца при разных значениях парциального давления кислорода. Проведенные нами эксперименты показали, что скорость образования супероксида в митохондриях уменьшается при снижении концентрации кислорода в среде инкубации. Однако, еще при 2% содержании кислорода в среде митохондрии продолжают генерировать 0{ , хотя и со скоростью в четыре раза меньше, чем при 21% содержании кислорода (как в атмосферном воздухе при нормальном давлении). Образование супероксида при малых концентрациях кислорода может быть одной из причин возникновения необратимых повреждений в клетках миокарда в условиях длительной ишемии, когда некоторое количество кислорода продолжает поступать в клетки в результате существования коллатерального кровотока.
На рис. 14 показана зависимость скорости генерации супероксидных радикалов изолированными митохондриями от длительности гипоксии при использовании субстратов дыхания комплексов I и П. Длительность гипоксии была в обоих случаях 10 мин и 30 мин. Из рис. 14 видно, что скорость образования Oi возрастала, по сравнению с контрольным уровнем, уже после 10-минутной гипоксии, однако, увеличение длительности гипоксии не приводило к существенным изменениям. Для целого перфузируемого сердца крысы, после 30- или 45-минутной ишемии ранее нами наблюдались значительные изменения как сократительной функции, так и содержания АТР в кардиомиоцитах. В митохондриях, выделенных из этих сердец, скорость генерации супероксида была значительно выше, чем в митохондриях, которые были выделены из сердец, не подвергавшихся длительной ишемии. В то же время, для изолированных митохондрий сердца ни 30 мин, ни 45 мин (данные не приведены) гипоксии не были критическими временами для значительного роста скорости образования супероксида.
