Содержание к диссертации
ОГЛАВЛЕНИЕ 1
Список принятыж сокращений 6
РАЗДЕЛ I. ВВЕДЕНИЕ. АНАЛИЗ СОСТОЯНИЯ ПРОБЛЕМЫ И ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ 7
РАЗДЕЛ П. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 27
ГЛАВА П.1. ДЕЙСТВИЕ СВЕТА И РЕАКЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В СЕТЧАТКЕ И МЕМБРАННЫХ ОБРАЗОВАНИЯХ ФОТОРЕЦЕПТОРОВ 27
11.1.1. Условия, способствующие активации активных форм кислорода и свободнорадикальных реакций в структурах глаза 28
П.1.2. Основные методы и материалы 30
И. 1.2.1. Выделение и очистка фоторецепторных мембран. Условия освещения сетчаток, суспензии наружных сегментов палочек, экстрактов родопсина и условия его регенерациию 30
П. 1.2.2. Условия анализа протекания реакций активных форм кислорода в сетчатке и фоторецепторных мембранах 32
П. 1.3. Светозависимое свободнорадикальное окисление мембранных фосфолипидов фоторецепторов 36
П.1.4. Возможные механизмы активации кислорода и свободнорадикальных состояний в фоторецепторной системе 38
П. 1.5. Ферментные и неферментные системы регуляции образования активных форм кислорода и перекисей липидов в мембранах фоторецепторов 39
П.1.6. Влияние липидного состава на скорость свободнорадикального окисления липидов в мембранах фоторецепторов лягушки и минтая 45
II. 1.6.1. О роли липидного состава в кинетике свободнорадикального окисления липидов в мембранах наружных сегментов палочек сетчатки лягушки и минтая 45
II. 1.6.2. Влияние индукции пере кисного окисления липидов мебран фоторецепторов сетчатки минтая на термоденатурацию родопсина 49
П.1.7. Термостабильность родопсина и белок-липидные взаимодействия в фоторецепторных мембранах гомойотермных и пойкилотермных животных 52
П.1.8. Заключение главы II.1 55
ГЛАВА П.2. ОЦЕНКА РЕАКЦИЙ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА НА МИКРОСОМНОЙ МОДЕЛИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ 57
И.2.1. Краткий анализ состояния проблемы 57
П.2.2.Изучение механизма инициирования активных форм кислорода и ферментативного НАДФН-зависимого перекисного окисления липидов в мембранах эндоплазматического ретикулума печени крыс 60
И.2.2.1. Методологический аспект 60
И.2.2.2. Основные материалы и методы 61
II.2.2.2.1. Приготовление эмульсии линоленовой кислоты, условия ее окисления и анализа продуктов 62
П.2.2.2.2. Индукция системы монооксигеназ. Выделение и очистка микросомной фракции печени. Условия ее инкубации, индукция процесса ПОЛ, определение продуктов ПОЛ, содержания и ферментативных активностей цитохрома Р-450 63
II. 2.2.2.3. Получение фракции микросом, обогащенной цитохромом Р- 450 или НАДФН-цитохром Р-450- редуктазой 65
И.2.2.3. Механизм инициирования реакции перекисного окисления линоленовой кислоты в химической системе феназинметасульфат- НАДН 66
II.2.2.4. Изучение механизма инициирования ферментативного НАДФН-зависимого перекисного окисления липидов в мембранах эндоплазматического реткулума печени 70
П.2.З. Взаимосвязь процессов перекисного окисления липидов и протеолиза в деградации цитохром Р-450-зависимой системы детоксикации ксенобиотиков в микросомах печени крыс 76
П.2.4. Антиокислительная активность некоторых лекарственных препаратов в микросомной системе печени крыс 82
П.2.4.1. Постановка задачи 82
И.2.4.2. Характеристика испытываемых лекарственных средств и методические подходы 83
И.2.4.3. Лекарственные средства прямого и непрямого антиоксидантного действия. Результаты тестирования 85
ІІ.2.5. Применение тест-системы на основе монооксигеназных и конъюгирующих активностей плаценты для оценки развития желтухи новорожденных невыясненной этиологии Алтайского региона 92
ГЛАВА ІІ.З. ОБОСНОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МИКРОСОМНОЙ СИСТЕМЫ ПЕЧЕНИ РЫБ КАК ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ БИОМОНИТОРИНГА ДЕЙСТВИЯ АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА ОСНОВЕ РЕАКЦИЙ С УЧАСТИЕМ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА (ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ И ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ) 104
ІІ.З.І.Исследование монооксигеназ со смешанной функцией в микросомах печени рыб о. Байкал. Методические особенности и некоторые результаты 104
П.3.2. Иммунохимический анализ индукции изоформ цитохрома Р- 450 в печени пресноводных рыб - эффективная тест-система на воздействие полициклических углеводородов и полихлорированных бнфенилов 111
П.3.2.1. Условия отлова и содержания рыб. Индукция цитохрома Р-450. Методика иммунохимического анализа его изоформ в микросомной фракции печени 112
П.3.2.2. Оценка изоформенного состава пула цитохрома Р-450 рыб и определение их ферментативной активности с помощью ингибиторного анализа специфическими антителами и субстратов О- деалкилирования 114
П.3.3. Изучение ферментных и неферментных систем перекисного окисления липидов в микросомах печени рыб о. Байкал 117
П.3.4. Изучение роли фенольных производных бенз(а)пирена и фенолов - компонентов промстоков в регуляции процесса окисления липидов в микросомах печени рыб о. Байкал 120
ГЛАВА П.4. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ПРОДУКТОВ ГИДРОЛИЗА ФОСФОЛИПИДОВ ФОСФОЛИПАЗОЙ А2 НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МИКРОСОМНЫХ СИСТЕМ, АКТИВИРУЮЩИХ КИСЛОРОД 125
П.4.1. Ингибирование деалкилазной активности изоформ цитохрома Р-450 в микросомах печени крыс продуктами гидролиза фосфолипидов фосфолипазой А2 125
П.4.2. Влияние лизофосфолипидов на монооксигеназные активности микросом печени крыс после индукции ксенобиоиками метилхолантренового типа 138
П.4.2.1. Влияние субстратов цитохрома Р-450 и лизолецитина на гидрофобные и вязкостные свойства микросомных мембран 141
П.4.2.2. Действие лизолецитина на активность 7- этоксикумариндеэтилазы 144
П.4.2.3. Действие лизолецитина на бенз(а)пирен гидроксилазную активность 147
П.4.2.4. Действие лизолецитина на О-деметилирование р- нитроанизола 149
И.4.3. Сравнительное действие продуктов гидролиза фосфолипидов фосфолипазой Аг на деалкилазную активность изоформ цитохрома Р-450 в микросомах печени крыс и карпа 151
ГЛАВА П.5. МОДЕЛЬ ИЗОЛИРОВАННЫХ ГЕПАТОЦИТОВ КАК БИОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ЦИТОХРОМА Р-450 154
П. 5.1. Методические аспекты 155
П.5.1.1. Процедура выделения изолированной фракции клеток печени крыс 155
П.5.1.2. Условия инкубации гепатоцитов, индукция процесса ПОЛ, определения продуктов ПОЛ и количества цитохрома Р-450 156
П.5.2. Механизмы деструкции цитохром Р-450-зависимой детоксицирующей системы в гепатоцитах 159
П.5.3. Антиоксиданти как стабилизаторы цитохрома Р-450 в гепатоцитах 161
П.5.4. Продукты гидроксилирования бенз(а)пирена стабилизаторы цитохрома Р-450 в гепатоцитах 164
ГЛАВА ІІ.6. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ОТКЛИК НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ КРЫС НА ВОЗДЕЙСТВИЕ МЕТИЛХОЛАНТРЕНОМ И СОВОЛОМ IN VIVO 168
II.6.1. О взаимосвязи активности иммунекомпетентных клеток с индукцией монооксигеназных систем организма ксенобиотиками 168
П.6.2. Методы выделения вейтрофилов из крови крыс. Оценка функциональной активности (развитие окислительного взрыва) и монооксигеназной системы вейтрофилов. Методы хемилюминесценции иЭПР 170
П.6.3. Влияние ксенобиотиков метилхолантрена и совола на интенсивность окислительного взрыва, активированного в нейтрофилах ФМА. Изменение вязкости мембран нейтрофилов 173
И.6.4. Гомологичность оксидазных и оксигеназных редокс-систем (краткое обсуждение и обоснование результатов) 179
ГЛАВА II.7. РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КРОВИ 182
П. 7.1. Сверхслабое излучение является функционально-значимой характеристикой электронного возбуждения в живых системах 182
П.7.2. Роль активных форм кислорода в регуляции обмена кислорода в нативной крови человека. Методические аспекты и результаты исследований 187
П.7.3. Сверхслабое излучение и хемилюминесценции цельной крови - результат функционирования ее АФК-генерирующих компонентов и систем 196
П.7.4. Изменение хемилюминесценции неразведенной крови у больных ишемической болезнью сердца в ходе лазеротерапии 200
РАЗДЕЛ III. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 206
ВЫВОДЫ 222
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 225
Благодарности 273
Введение к работе
АНАЛИЗ СОСТОЯНИЯ ПРОБЛЕМЫ И ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.
Подавляющее большинство всех живых организмов, составляющих сложные экологические системы, в своей жизнедеятельности не могут обходиться без потребления кислорода, за счет которого они способны выполнять разнообразные энергоемкие метаболические функции, а также производить субстраты, богатые энергией, другими словами говоря, осуществлять реакции ассимиляции и диссимиляции, поддерживая устойчиво-неравновесное состояние гомеостаза (Бауэр Э., 1930, 1935; Воейков В.Л., 2002, 2003).
В отличие от практически всех известных молекул, как присутствующих в окружающей среде, так и входящих в состав живых организмов, обитающих в этой среде, молекула кислорода в основном электронном состоянии является триплетной, т.к. имеет на валентных орбиталях два электрона с параллельными спинами (Mattheus P.C.S., 1986). Молекулы в триплетном состоянии обладают избыточной энергией по сравнению с их синглетными формами в основном (невозбужденном) состоянии, когда все их электроны спарены. У молекулы кислорода в этом смысле есть уникальная особенность: она не имеет основного синглетного состояния, а может пребывать только в возбужденном синглетном состоянии.
Как известно, главным путем энергетического метаболизма считается окислительное фосфорилирование, которое происходит в митохондриях, когда в результате сложных ферментативных актов превращений молекулы глюкозы и трикарбоновых кислот в цикле Кребса окисляются до СОг в цепи переноса электронов с высвобождением 32 молекул АТФ и 4 молекул ГТФ и образованием молекул воды (Chance В. and Williams G.R. 1956; Ernster L.and Lindberg O., 1958; Green D.E., 1959; Green D.E. and Hatefi Y., 1961; Racker E., 1965; Ленинджер A.,1966; Рэкер Э., 1967; Boyer P.D., 1967; Кондрашова M.H., 1989; Скулачев В.П., 1962, 1971, 1989, 2000 и др.). Об участии кислорода в процессах окислительного фосфорилирования в данной работе речь идти не будет. Отметим лишь, что в митохондриях на определенном этапе этого сложного процесса образуется супероксиданион радикал (Ог ) [значок " " обозначает неспаренный электрон] -продукт одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода, а затем и перекись водорода (Boveris A. and Chance В., 1973; Boveris A. et al, 1976; Chance В. et al, 1979; Ksenzenko M. et al, 1983; Imlay J. A. and Fndovich I., 1991; Skulachev V.P., 2002). Их образование в митохондриях осуществляется в условиях высокой степени восстановленности переносчиков дыхательной цепи, и ответственными за этот процесс считаются НАДН-дегидрогеназа и убихинон. Максимальная его активация происходит в присутствии сукцината.
Реакции одноэлектронного восстановления кислорода относятся к типу окислительно-восстановительных реакций, в результате которых происходит последовательное восстановление молекулярного кислорода до его активных форм (АФК). Способов активации кислорода немного. Практически все доступные ему доноры электронов - синглетные молекулы, а прямая реакция триплетной молекулы с синглетной с образованием продуктов в синглетном состоянии невозможна (Eyring Н., 1935). Именно поэтому молекулы, которые могут отдавать кислороду электроны, не сгорают немедленно в его присутствии. Активации кислорода, например, способствует поглощенный соответствующий квант энергии, переводящий молекулу кислорода в возбужденное синглетное состояние. В этом состоянии ему уже легко взаимодействовать с синглетными молекулами. Кислород также могут активировать металлы с переменной валентностью (наиболее изучаемыми в этом смысле являются ионы железа), в поле действия которых меняется спиновое состояние О2. Наконец, кислород легко взаимодействует со свободными радикалами - частицами атомной или молекулярной природы, имеющими нечетное число электронов. Свободные радикалы реагируют как с синглетными, так и с триплетними молекулами, а также с другими свободными радикалами. Эти реакции, как правило, сопровождаются освобождением больших квантов энергии. Так как кислород, превращаясь в свободный радикал 02 " или надперекисный радикал Н02\ приобретает дополнительный электрон, он намного легче может захватывать последующие электроны с освобождением на каждом этапе значительных порций энергии (Метелица Д.И., 1982). Из 02 (НОг") может образовываться перекись водорода Н2О2, как продукт реакции дисмутации супероксида:
2 V" + 2Н = Н202 + 10 2.
Вторым продуктом этой реакции является как раз возбужденная молекула синглетного кислорода - 0 2 [значок " " обозначает электронно-возбужденное состояние - ЭВС]). Константа скорости этой реакции - 5 105 MV1 при рН 7,0. Следовательно, время жизни (V" в водной среде, особенно в слабокислых условиях очень мало.
К АФК также относятся гидроксил-радикал ОН , нитроксильный радикал NO , радикалы органических перекисей ROO [R обозначает остаток органической молекулы], в специфических случаях гипохлорит ОСҐ". Результатом последовательного присоединения 4-х электронов к молекуле кислорода является образование Н20 (Boveri A. and Chance В., 1973; Chance В. et al, 1979; Лукьянова Л.Д. и др., 1982; Vlessis А.А. et al, 1995). Превращения АФК идут по типу цепных разветвленных реакций (Метелица Д.И., 1982). Если объединить все последовательные стадии одноэлектронного восстановления кислорода до воды, то получится следующая система уравнений:
402+4Е + 4Н - 4Н02« + 20 ккал/моль X 4 = 80 ккал/моль
4 Н02 - 2Н202 + 202 + 23 ккал/моль X 2 = 46 ккал/моль
2Н,Р2 - 2HzO + О? + -50 ккал/моль 402 + 4е + 4Н - 2Н20 +302 + - 180 ккал/моль
Единица энергии "кал/моль" подразумевает тепловую энергию, затрагивающую трансляционный, вращательный и частично колебательный возбужденные уровни. Максимальные порции энергии, соответствующие этим уровням, не превышают 10-15 ккал/моль и быстро рассеиваются в тепло, если нет возможности их затраты на выполнение какой-либо работы. Порции энергии, превышающие этот диапазон, относятся к качественно другому типу энергетических переходов - изменению энергии внешних валентных электронов или энергии электронного возбуждения. Эти кванты энергии относятся к диапазонам от ближней инфракрасной (синглет-триплегный переход возбужденной молекулы кислорода) до видимой и даже УФ-области электромагнитного спектра (Воейков В.Л. и др., 1992, с. 156).
К АФК можно отнести и другие соединения, легко продуцирующие свободные радикалы (озон - Оз, пероксинитрит - ONOOH, хлорноватистая кислота -НС10, гидроперекись - ROOH, органическая перекись ROOR), а также монооксид углерода - СО.
N0" и СО в настоящее время посвящено достаточно много работ, в которых им отводится роль сигнальных молекул в регуляции жизненно важных функций, связанных, в частности, с работой гемсодержащих белков таких, как гуанилатциклаза, цитохром Р-450, гемоглобин (Ingi Т. et al 1996; Maulik N. et al, 1996a,b; Otterbein L.E., 2002; Vural C. and Gungor A., 2003). О некоторых аспектах этой проблемы будет сказано при изложении и обсуждении основного экспериментального материала рассматриваемой работы.
По мнению ряда авторитетных ученых О2 " представляет собой побочный, нежелательный продукт как цикла Кребса, так и других биохимических процессов (Harman D., 1956; Chance В. et al, 1979; Fridovich I., 1974; Голубев, 1996). От супероксиданион радикала и образующихся далее других АФК, как считают, клетке необходимо избавляться, чтобы не получить пагубных последствий. Такая досужая точка зрения сложилась на основе огромного фактического материала, указывающего на то, что АФК, генерация которых неизбежна в клетках и тканях организма, запускают цепные свободно-радикальные реакции, приводящие к химической модификации важных биологических структур - нуклеиновых кислот, белков, липидов (Richter С, 1987; Pattison D.I. et al, 2002). Основным таким процессом считается перекисное окисление липидов (ПОЛ), радикальные и молекулярные продукты которого обладают выраженным повреждающим действием, нарушающим нормальный метаболизм и приводящим к развитию патологических состояний (Harman D., 1956; Beckman К.В., Ames B.N. et al, 1993; Liochev S.I. and Fridovich L, 1999; Fridovich I., 1999).
Список работ, охватывающих проблему пероксидации липидных компонентов клеточных мембран, очень большой, трудно даже установить приоритет какой-либо из них в изучении основополагающих закономерностей протекания процесса ПОЛ в живой клетке.
Однако, безусловно, вряд ли кто-нибудь из исследователей не отдаст предпочтение крупному русскому биохимику Алексею Николаевичу Баху, который более 100 лет назад (Bach А., 1897) впервые указал на важную роль образования перекисных соединений в процессах медленного окисления различных соединений неорганического и органического происхождения, в том числе и в живых системах. Одновременно, но независимо от него, перекисную теорию окисления предложил немецкий химик К.О. Энглер (Engler С. und Wild. Е., 1897). С тех пор эта теория носит имя Баха-Энглера. В последующих своих работах А.Н. Бах продолжал развивать эту теорию (Chodat R. und Bach А., 1902; Бах А.Н., 1912; 1937; 1950). Одна из его главных заслуг, на наш взгляд, в том, что он уже в своих первых работах на тему химизма дыхательных процессов придавал основополагающее значение активированному кислороду в нормальном метаболизме пищевых веществ. А.Н. Бах писал: "Объяснить быстрое разрушение пищевых веществ в организме окислением можно ... только двояким предположением: или эти вещества расщепляются в организме на части, способные окисляться за счет недеятельного, молекулярного кислорода; или же организм обладает средством переводить свободный кислород из недеятельного состояния в деятельное. Так как известные нам продукты распада пищевых веществ в общем не легче окисляются свободным кислородом, чем сами эти вещества, то первое предположение приходится отвергнуть. Остается последнее, т.е. перевод кислорода из недеятельного состояния в деятельное или так называемое активирование кислорода." (Бах А.Н., 1912: стр. 1). И далее в этой же работе он пишет: "Переход кислорода из недеятельного состояния в деятельное мыслим лишь, как разрыв или ослабление связей, которыми удерживаются атомы в молекуле... при медленном сгорании первоначальная энергия, необходимая для выведения кислорода из его недеятельного состояния, может быть доставлена лишь самими окисляющимися телами.
Другими словами, тела,окисляющиеся при обыкновенной температуре, обладают способностью активировать свободный, молекулярный кислород. Мы подходим тут к узловому пункту проблемы дыхания: к механизму активирования кислорода." (Бах А.Н., 1912: стр. 3). Таким образом еще в те годы предполагалось, что АФК должны участвовать в нормальных метаболических процессах. А.Н.Бах во времена создания и развития своей теории не мог знать о первоначальной АФК С 2 \ но ведь супероксид анион радикал при своей дисмутации приводит к образованию перекиси водорода, а этому веществу и другим перекисным соединениям в работах А.Н.Баха всегда уделялось основное внимание. И суть теорииБаха-Энглерасо слов первого автора состоит в следующем: "...Все окисляемые тела первоначально присоединяют к себе целые молекулы кислорода с образованием перекисе й." (Разрядка текста везде принадлежит А.Н.Баху). "Все способные к окислению тела, независимо от их химической природы, присоединяют к себе такие группы —О—О—, образуя первоначально перекиси /О" R -O-O-R или R О (Бах А.Н., 1912: стр. 11, 15).
Вернемся же вновь к процессу перекисного окисления липидов. Субстратом ПОЛ в живой клетке прежде всего являются ненасыщенные жирные кислоты, как основные компоненты фосфолипидов, осуществляющих структурно-функциональную организацию биологических мембран (Козлов ЮЛ., 1977; Кребс Е.М., 1981; Бергельсон Л.Д., 1982; Болдырев А.А., 1985; Кагава Я., 1985). Не представляется возможным обсудить здесь все многочисленные результаты исследований в этой области, но следует сказать о пионерских работах школы профессора Б.Н.Тарусова (Тарусов Б.Н., 1954, 1967, 1972; Тарусов Б.Н. и др., 1961, 1965, 1967; Журавлев А.И., 1965, 1972; Перелыгин В.В. и Тарусов Б.Н., 1966 и др.), последователи которой много сделали для понимании механизмов свободно - радикальных реакций в живых организмах, как в условиях нормальной жизнедеятельности, так и при развитии различных патологических состояний. Мы останавливаемся на этих работах в первую очередь потому, что на первой в мире кафедре биофизики Московского университета, основанной Б.Н.Тарусовым, с середины 50-х годов XX столетия начало развиваться направление исследований сверхслабых излучений (ССИ) биологических объектов. Именно здесь впервые удалось зарегистрировать эти излучения в видимом диапазоне электромагнитного спектра с помощью особо чувствительной аппаратуры, основанной на регистрации одиночных фотонов фотоэлектронными умножителями (ФЭУ). Эти ССИ являются результатом свободнорадикальных процессов в клетках и тканях живых организмов и, как было показано в исследованиях школы Б.Н.Тарусова, под воздействием ионизирующей радиации, опухолевого роста и некоторых других патологических процессов повышается интенсивность излучения, и основным субстратом, ответственным за него, являются липиды клеточных мембран. Именно в этих компонентах клетки и протекают процессы ПОЛ.
Изучение реакций ПОЛ с использованием различных методов и в разнообразных объектах получило развитие на кафедре биофизики в созданной профессором Ю.П.Козловым лаборатории физико-химии биомембран, в которой и были получены все основные результаты настоящей работы. ЮЛ.Козлову принадлежит заслуга в развитии метода привитой сополимеризации (Багдарасьян Х.С., 1966), который оказался очень чувствительным и позволял обнаруживать свободнорадикальные продукты в клетках и тканях в еще незначительных концентрациях, например, на начальных стадиях развития лучевого поражения, канцерогенеза (Козлов Ю.П., 1970), что было недоступно другим методам. В нашей лаборатории изучали различные механизмы протекания ПОЛ в мембранных образованиях зрительной, нервной, мышечной системах (Kagan V.E. et al, 1973; Каган В.Е. и др., 1977; Елуашвили И.А. и др., 1978; Shvedova А.А., 1979; Каган В.Е. и др., 1983), свободнорадикальные реакции в тканях при радиационном поражении организма животных, канцерогенезе, злокачественном росте и других патологических процессах при одновременном сочетании разных методов in vivo и in vitro (Данилов B.C. и др., 1972; Козлов Ю.П. и др., 1972; Каган В.Е. и др., 1973), а также под влиянием повреждающих и загрязняющих факторов окружающей среды, приводящих к интенсификации ПОЛ (Козлов Ю.П. и др., 1984; Бейм А.М. и Новиков КН., 1987) и т.д. При этом, наряду с упомянутыми методами регистрации сверхслабой люминесценции и привитой сополимеризации, в лаборатории применяли другие адекватные методы обнаружения свободных радикалов и продуктов ПОЛ в тканях, клетках и мембранных образованиях. Основными из них были радиоспектроскопия, спекгрофото- и флюориметрия (регистрация диеновых и триеновых конъюгатов в липидных фракциях биомембран (Bolland J.L. and Koch Н.Р., 1945), шиффовых оснований (Bidlack W.R. and Tappel A.L., 1973)), определение концентрации гидроперекисей (ГП) с помощью полярографии с ртутно-капельным электродом (Данилов B.C. и др., 1972), определение содержания молекулярного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) (Kohn H.Y., Liversedge М., 1944) и др.
Специально следует остановиться на исследованиях в области свободнорадикальных процессов школы академиков Н.Н.Семенова и Н.МЭмануэля в стенах института Химической физики АН СССР (ныне Институты Химической и Биохимической физики РАН). Особенно примечательны работы под руководством профессора Е.Б.Бурлаковой, посвященные раскрытию механизмов, ответственных за образование и трансформацию АФК, продуктов ПОЛ, за регуляцию свободнорадикальных процессов на разных уровнях организации живого (Бурлакова Е.Б. и др., 1965; Burlakova Е.В. et al, 1980; Burlakova E.B. et al, 1998 и др.). Наибольший интерес на наш взгляд представляют работы, выполняющиеся под руководством Е.Б.Бурлаковой в течение последних нескольких лет и связанных с влиянием малых и сверхмалых доз веществ антиоксидантной природы на протекание свободнорадикальных реакций и ряда других реакций, в частности, определяющих пути генерации и трансформации АФК и продуктов ПОЛ в организме (PalminaKP. et al, 1997; Maltseva E.L. et al, 1998 и др.).
Природа предусмотрела такие ферментные и неферментные защитные механизмы, которые осуществляют в клетках, тканях и организме в целом антиоксидантные функции (Ланкин В.З., 1985).
В конце 1960-х годов было открыто семейство ферментов -супероксиддисмутаз (СОД), которые ускоряют реакцию дисмутации Ог " в тысячи раз (McCord, Fridovich, 1969). Весьма широкая распространенность СОД, многообразие ее форм, отличающихся и по структуре апофермент и по иону металла в активном центре (Mn, Zn или Fe) (Fridovich I., 1974) послужили веским доказательством того, что АФК образуются в живых системах регулярно. Именно с открытия СОД началась систематическая работа по изучению роли АФК в процессах жизнедеятельности. Поэтому СОД с самого начала стали рассматривать, как возникший в ходе эволюции главный инструмент защиты организма от "окислительного стресса", определяемого как совокупность разрушительных явлений, сопутствующих кислородному дыханию за счет неизбежного побочного образования АФК, как представлялось и представляется по сей день многим исследователям (Fridovich I., 1999). В катализируемой СОД реакции дисмутации продуктом является триплетный кислород, а не возбужденный синглетный, как при спонтанной дисмутации Ог ". СОД -чрезвычайно активный фермент: число ее оборотов (k ) - одно из самых высоких для ферментов - порядка 106 с 1, а константа скорости (k /Km) 108 М" с 1 (Walsh С, 1979), следовательно, она должна практически немедленно устранять образующийся Ог " до ничтожно низкого стационарного уровня. По ряду имеющихся оценок, стационарный уровень Ог " в клетках и тканях, несмотря на наличие многих и достаточно интенсивных источников его генерации, чрезвычайно низок,- порядка 10"10 -10 11 М (Niviere V. and Fontecave М., 1995; Imlay J. A. and Fridovich I., 1991). Это как раз и способствует тому, чтобы в клетках и тканях не развивались повреждающие их структуры окислительные процессы, но в то же время, чтобы был некий достаточный "запас" этой АФК, необходимый для генерации ЭВС.
Следующим ферментом, стоящим на пути превращений АФК, является каталаза. Она предотвращает неконтролируемое гемолитическое расщепление перекиси водорода и с громадной скоростью - число оборотов более 10 с , константа скорости 4х107 M V1 (Walsh С, 1979) превращает Н202 в кислород и воду. Поэтому даже в пероксисомах, где перекись водорода непрерывно продуцируется в ходе ферментативных реакций, стационарный уровень Н202 не превышает 100 нМ, а в цитоплазме он оценивается в диапазоне 10"7 - 10"9 М (Oshino N. et al., 1973; Tyler D.D., 1975).
Еще один широко распространенный фермент, который устраняет Н202 -глютатионпероксидаза (ГПР) (Панкин В.З., 1985; Liu et al., 1993), катализирующая реакцию окисления восстановленного глютатиона пероксидами, превращая последние в спирты (или воду в случае Н202).
Помимо ферментных защитных систем существуют неферментативные способы предотвращения чрезмерного развития свободнорадикальных процессов в живых организмах. Прежде всего к таким антиоксидантним системам следует отнести систему витамина Е, аскорбиновую кислоту, каратиноиды и др.
В дальнейшем мы неоднократно будем возвращаться к вопросу о роли антиоксидантных систем в жизнедеятельности организмов, в частности, как различных биологических тест-систем, особенно на клеточном и мембранном уровнях, поэтому во введении мы останавливались только на общих современных представлениях об их структуре и механизмах действия. К сожалению, не все исследователи уделяли должное внимание именно регулирующей роли антиоксидантных систем в свободнорадикальных окислительных процессах. Действительно, ведь не только для полной элиминации "вредных" продуктов реакций свободнорадикального окисления они, вероятно, существуют, но и для поддержания динамического баланса, необходимого концентрационного уровня и скорости генерации тех же АФК.
Мы остановились только на наиболее значимых направлениях исследований в области свободнорадикальных процессов в живых организмах, развивавшихся и развивающихся в нашей стране. Безусловно работами других отечественных ученых и зарубежных исследователей также внесен значительный вклад в выяснение механизмов протекания и проявления реакций с участием АФК в жизнедеятельности организмов. Среди них все больше и больше появляется работ, указывающих на двойственную роль АФК, продуктов их взаимодействия с биосубстратами, свободных радикалов другой природы в функционировании живого - с одной стороны, как факторов повреждающих, но и с другой стороны, как необходимых регуляторов многих процессов в организме (McCord, 1995; Гамалея И.А., Клыбин И.В. 1996; Воейков В.Л., 1998; Dalton Т.Р et al, 1999; Воейков В.Л., 2000, 2001; Allen R.G. and Tresini M, 2000; Meier В., 2001; Sauer H. et al, 2001; Voeikov V.L., 2001; Ermak G. and Davies K.J., 2002; Турпаев K.T., 2002). Интересно, что задолго до этих работ, еще в 1902 г. опять же А.Н.Бах в сотрудничестве с Р.Шода, экспериментально показал, что "...некоторые организмы (культуры низших грибов Penicillium glaucum, Rhizopus nigricans и Sterigmatocystis nigra - КНН) могут существовать в питательных средах, содержащих до 1% перекиси водорода. Присутствие перекиси таким образом не является несовместимым с жизнью протоплазмы" и далее: "Перекиси, образующиеся первично в клетке, используются двумя путями: как окислители в собственном смысле этого слова, для трудно окисляемых составных частей клетки и как переносчики химической энергии..." (Bach А., 1902; Бах А.Н., 1937).
В связи с выше сказанным обратимся снова к работам школы профессора Б.Н.Тарусова и подчеркнем, что в 1950х - 1960х годах на кафедре биофизики Биологического ф-та МГУ активно велись исследования, посвященные роли свободнорадикальных состояний, в том числе и АФК, в процессах нормальной жизнедеятельности различных организмов (Журавлев А.И., 1982).
Убедительные доказательства положительного влияния АФК на функционирование митохондрий были получены под руководством проф. М.Н.Кондрашовой в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино-на-Оке). В работе Саакян И.Р. с соавт. (1998) показано усиление индуцируемого перекисями освобождения ионов кальция из предварительно нагруженных катионом митохондрий. При продолжительном воздействии потока отрицательных аэроионов (супероксиданион радикалов) на гомогенати, хранящиеся на льду, и последующей инкубации в средах, обработанных отрицательными аэроионами (т.е. О2 ) , в них наблюдалось нарастание уровня продуктов ПОЛ при исходно низком их содержании и его снижение при исходно высоком уровне. Диапазон изменений концентраций продуктов ПОЛ в этих условиях оказался существенно ниже, чем при его патогенной интенсификации. Обнаруженная авторами мягкая активация процессов ПОЛ рассматривается как первичный физико-химический механизм благотворного действия отрицательных аэроионов. В другой работе (Temnov A.V. et al, 1997) показано, что под воздействием аэроинов происходит активизация фосфорилирования в митохондриях, что обусловлено более полным сохранением их нативной структурной организации in vitro.
Здесь уместно отметить, что и сами АФК, по крайней мере, в виде отрицательных аэроионов, находящиеся в воздухе, являются полезными для жизнедеятельности факторами окружающей среды. Установлено, что отрицательно заряженные аэроионы - это гидратированные супероксид анион радикалы (02# )(Н20)т и что свое действие они оказывают благодаря тому, что представляют собой свободно-радикальные частицы, порождающие все другие формы АФК, а не за счет того, что несут электрический заряд (Гольдштейн Н.И., 2000). Важно подчеркнуть, что нормальный "свежий" воздух должен содержать, по меньшей мере, 500 таких ионов в см3, тогда как содержание кислорода в том же объеме в 1016 раз больше.
Еще в 20-30-е годы XX столетия А.Л. Чижевский установил, что воздух, содержащий не менее этого количества «легких» отрицательных ионов, действует на организмы благотворно, а при существенном превышении в нем содержания положительных аэроионов состояние здоровья ухудшается, замедляется рост, вес, падает аппетит, наблюдаются негативные изменения в поведении и внешнем виде животных (Чижевский А.Л., 1922, 1999). Если же воздух вообще лишен аэроионов, то животные в скором времени погибают с симптомами удушья. Если у животных, пребывающих в такой атмосфере, еще не произошли необратимые органические изменения, в первую очередь, в мозгу и нейроэндокринных органах (Goldstein N.I. et al, 1992), то при обогащении воздуха отрицательно заряженными аэроионами явления асфиксии у животных исчезают (Чижевский А.Л., 1960, Goldstein N.I. and Arshavskaya T.V., 1997).
Аэроионизация воздуха отрицательно заряженными ионами сейчас используется довольно широко. Установлено, что при повышении содержания аэроионов в среде у многих больных с различной патологией нормализуется состояние, повышается устойчивость организма к неблагоприятным факторам (Васильев Л.Л., 1960; Каценович Р.А., 1966; Гольдштейн Н.И., 2002). В работах (Кондрашова М.Н. и др., 1997; Kondrashova M.N. et al., 2000) показано, что при воздействии отрицательных аэроинов, генерируемых люстрой Чижевского, выявляется физико-химические механизмы их благотворного эффекта на ассоциаты митохондрий, а именно, усиление структурной организации и интесификация энергетических процессов в митохондриях. В этих же работах продемонстрирована активация образования АФК в "ослабленных" нейтрофилах в среде, предобработанной аэроионами; активирование препаратов СОД после помещения их в растворы, обработанные аэроионами. Непосредственным активатором является перекись водорода, образующаяся в микромолярных концентрациях из супероксид аниона в этих растворах.
Таким образом, совершенно не умаляя возможных нежелательных последствий от возникновения свободных радикалов в клетках и тканях, следует иметь ввиду и их положительную роль в жизнедеятельности организмов. В связи с этим возникает сложная задача выяснить, в чем различие механизмов действия АФК в малых и больших дозах, когда наступает сбой в системах, отвечающих за определенное сбалансированное состояние в организме, не позволяющее развиваться зависимым от свободных радикалов повреждениям и патологиям и др.
Отвлекаясь от процессов, происходящих в митохондриях и зависящих от АФК, следует также отметить, что есть еще по краней мере три системы, довольно подробно изучаемые в настоящее время, где роль АФК, пожалуй, является главной в функционировании этих систем. Первая система - это монооксигеназная цитохром Р-450-зависимая система гепатоцитов, ответственная за метаболизм таких эндогенных субстратов, как, например, холестерин и стероидные гормоны (Колл.монография "Гепатоцит" /отв. ред. Л.Д.Лукьянова/, 1985; Goeptar A.R. et al, 1995; Peltola V. et al, 1996). Другая важная функция этой системы - это детоксикация чужеродных для организма химических гидрофобных веществ - ксенобиотиков (Арчаков А.И., 1975; Парк Д.В., 1973 и др.). Вторая система - это оксидазная система нейтрофилов и других лейкоцитов крови (Babior В.М. et al, 1973; Владимиров Ю.А. и Шерстнев М.П., 1989) и третья - NO-синтаза эпителиальной выстилки сосудов и других тканей (Beckman J.S. et al, 1990; Knowles R.G. and Moncada S., 1994; Silverton S.F. et al, 1995; Xia Y. et al, 1998; Зотова И.В. и др., 2002). О первых двух системах достаточно подробно будет сказано в соответствующих главах диссертации.
Этот, далеко не весь перечень примеров систем указывает нам на важность оценки роли АФК в организме как минимум с двух сторон. К настоящему времени уже накоплен значительный экспериментальный материал, показывающий, что практически во всех клетках и тканях животных организмов присутствуют ферментные системы оксидазного типа, образующие АФК (Babior В.М., 1999; Jones R.D. et al, 2000).
Показано, например, что многие другие ферменты в процессе выполнения своих прямых функций продуцируют АФК, что все иммуноглобулины независимо от их класса могут интенсивно продуцировать Н2О2 (Wentworth A.D. et al, 2000). Обнаружение в каждом конкретном случае того порога, после которого кардинально меняется роль АФК в гомеостазе организма, как раз и представляет собой важную и непростую биологическую задачу.
При ее решении необходима сравнительная оценка свойств и механизмов действия АФК на биологические структуры и процессы, диагностика, тестирование и корректировка состояния живых объектов при их функциональном отклике на воздействие определенных факторов окружающей среды на всех уровнях биологической организации - от субклеточных структур до сообществ разных видов, вплоть до человека. В конечном итоге может быть выявлено влияние АФК и его последствий на экологические закономерности сосуществования живых организмов в биогеоценозе.
По большому счету именно выше перечисленные проявления жизнедеятельности связаны с инициирующей ролью АФК в различных жизненно важных или патологических процессах. Главная роль принадлежит здесь супероксиданион радикалу, как первоначальному продукту одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода.
В дальнейшем мы будем рассматривать биологические системы, ответственные за генерацию энергии ЭВС (Шляпинтох В.Я. и др., 1966; Владимиров Ю.А. и Арчаков А.И., 1972), которая напрямую связана с образованием супероксид анион радикала и других продуктов восстановления молекулы кислорода. Эта энергия может передаваться от мест генерации к местам реализации как с некоторой потерей в виде излучения, так и путем безызлучательного переноса и играть важную роль в разнообразных физиологических процессах (Cilento G., 1973, 1975, 1988; Cilento G. and Adam W., 1995; Баскаков И. В. и Воейков В.Л., 1996). Бразильский физико-химик Джузеппе Чиленто, активно работавший в этой области, назвал такое явление "фотобиохимия без света" (Cilento G., 1988).
За счет накопления электронно-возбужденных частиц и молекул (например, карбонильных соединений) и освобождения энергии ЭВС при их релаксации в клетке, могут осуществляться энергоемкие процессы (Риль Н., 1948; Рид С, 1960; Phillips G.O., 1965; Журавлев А.И., 1965, 1972; Adam W. et al, 1986; Campbell A.C., 1988; Cilento G. and Adam W., 1995; Баскаков И. В. и Воейков В.Л., 1996). Кроме того, создаваемые ансамблями возбужденных частиц электромагнитное поле и излучения, сопровождающие его осцилляции, могут, по-видимому, играть информационную роль в биосистемах (Gurwitsch A.G., 1924; Guillery, 1929; Гурвич А.А., 1968; Казначеев В.П. и Михайлова Л.П., 1981; Galantsev V.P. et al, 1993; Novikov K.N. et al, 1994; Кузин A.M., 1995, 2000; Белоусов Л.В. и др., 1997; Voeikov V.L. and Novikov C.N., 1997; Burlakov A.B., 1999; Бурлаков А.Б. и др., 2000). Все эти феномены в совокупности реализуются для осуществления некоторых важных реакций в клетках, живых организмах, обеспечивая их целостность.
Итак, к настоящему времени известен довольно широкий спектр систем, генерирующих АФК, и, следовательно, ЭВС, к которым прежде всего надо относить ферментные НАДФН- и НАДН-зависимые оксидоредуктазные комплексы, распространенные в различных клеточных и тканевых системах живых организмов: в соединительной ткани, эндотелии, фагоцитирующих клетках, гепатоцитах, клетках коры надпочечников, некоторых видах нервной и мышечной ткани и т.д. у животных (Владимиров Ю.А. и Шерстнев М.П., 1989; Babior В.М. et al, 1973; Babior В.М., 1999; Furukawa К. et al, 1992; Goeptar A.R. et al, 1995; Kalsi J.K. et al, 1993; Meier B. et al, 1991; O Donnel V.B.and Azzi A., 1996; Jones S.A. et al, 1996; Peltola V. et al, 1996), а также у фотосинтезирующих водорослей, в зеленых листьях растений и в некоторых других растительных тканях (Доскоч Я.Е. и др., 1969; Honeycutt R.C. and bCrogmann D.W., 1970; Elstner E.F. and Heupel A., 1974; Шульцман Ф.М. и др., 1976; Dalton D.A., 1992; Hirayama S. et al, 1996; Самуилов В.Д. и др., 2001; Kasahara M. et al, 2002). Приведем один важный пример. Увеличение потребления кислорода с превращением его в АФК - событие, без которого невозможно оплодотворение сперматозоидом яйцеклетки (Klebanoff S.J. et al., 1979), а, значит, и развитие многоклеточного организма. Одно из первых событий при оплодотворении - резкая активация НАДФН-оксидаз обоих партнеров (Heinecke J.W. and Shapiro В.М, 1989; de Lamirande E. and Gagnon C, 1993).
Оксидазные комплексы непосредственно локализованы в мембранных образованиях клеток (плазматическая мембрана, эндоплазматический ретикулум (ЭР), мембраны фагосом, граны хлоропласта и т.д.). Ответственными за генерацию АФК и в то же время чувствительными к их воздействию в организме животных являются также фотобиологические системы, такие как зрительная (фоторецепторные мембраны (ФРМ) палочек и колбочек сетчатки, хрусталик), светочувствительные пигментные системы кожи, в которых развиваются фотодинамические процессы (Kagan V.E. et al, 1973; Новиков К.Н. и др., 1974; Братковская Л.Б. и др., 1981; Островский М.А. и др., 1987; Донцов А.Е. и др., 1999; Kagan V.E. et al, 2002).
На сегодняшний день разработано достаточно большое количество методов, позволяющих регистрировать образование АФК, различных продуктов их взаимодействия с клеточными структурами, другими субстратами молекулярного и надмолекулярного происхождения. Прежде всего к таким методам надо отнести метод ЭПР, хемилюминесценции (ХЛ), спектрофото- и флюориметрии, методы определения активностей ферментов, участвующих в генерации или элиминации АФК (ксантиноксидазная, пероксидазная, гидроксилазная, супероксиддисмутазная, каталазная, глютатионпероксидазная и др. активности), гистохимические реакции, в которых участвуют АФК и т.д (см. ниже). В частности, с помощью этих методов идентифицированы радикальные и молекулярные продукты последовательной окислительной деградации липидов (процесс ПОЛ), белков, пептидов, аминокислот и аминов, Сахаров (реакции неферментативного гликозилирования) (Maillard L.C., 1912; Richter С. et al, 1987; Mullarkey C.J. et al, 1990; Pattison D.I. et al, 2002). Прослежены возможные пути вовлечения АФК в регуляцию трансдукции сигнала в клетке, процессов экспрессии генов, клеточной дифференцировки, индивидуального развития, старения, апоптоза, некроза и др. (Allen R.G. and Balin А.К., 1989; Del Bello В. et al, 1999; Sauer H. et al, 2001; Воейков В.Л., 2002 и др.). Однако до сих пор еще не поняты до конца конкретные механизмы вовлечения свободнорадикальных производных и ЭВС в метаболические и патологические процессы.
Особое место занимают процессы с участием АФК, отвечающие за поддержание жизнедеятельности организмов в окружающей среде, за их адаптивные реакции, за надежность работы защитных систем организма (иммунная, система детоксикации), короче говоря, такие процессы, которые могут обеспечивать определенный гомеостаз, физиологический статус и взаимоотношения организмов в биоценозах (Fridovich I., 1974; Bingham Е., 1991; Котелевцев СВ., 1997; Stepanova L.I. et al, 2000; Regoli F. et al, 2002 и др.).
Таким образом, реакции с участием АФК в живых системах могут быть основой для оценки различных изменений физиологического состояния организмов, в том числе и после воздействий внешних факторов физической /радиация, различные физические поля и излучения, среди которых особый интерес представляют слабоинтенсивные воздействия (Пресман А.С., 1997)/ и химической природы (токсические вещества, наркотические средства, канцерогенные агенты, отходы химических производств, промвыбросы других предприятий, в особенности, целлюлозно-бумажной промышленности).
В настоящей работе представлены и обсуждены данные наших многолетних исследований (1972-2003гг), выполненные в основном в лаборатории физико-химии биомембран и на кафедре биоорганической химии Биологического факультета МГУ и охватывающие тот круг проблем, на которых мы остановились во введении.
Целью работы явилось выяснение регуляторной роли АФК в биологических системах от мембранного до организменного уровня, а также исследование механизмов протекания и регуляции реакций с участием АФК при воздействии различных факторов окружающей среды.
На примере оценки многообразного проявления реакций с участием АФК в живых организмах был обобщен имеющийся в наших руках материал с целью предложения комплексного подхода к использованию различных биологических объектов как тест-систем на основе реакций АФК.
Мы прежде всего ставили задачу показать, какую качественно новую роль при биотестировании могут играть сочетанные и не используемые в обычной практике разные подходы к оценке проявлений одного и того же процесса. Например, как неоднозначно действуют канцерогенные углеводороды и продукты их гидроксилирования фенольной природы, некоторые загрязнители этой же природы на работу монооксигеназной системы печени, иммунокомпетентных клеток животных, а также плаценты людей, обитающих и проживающих в определенных зонах риска (район Байкальского ЦБК, Алтайский край и др.). Мы применили ряд сравнительных подходов к выяснению механизмов действия этих и других веществ на природных и экспериментальных моделях живых организмов и их систем, где всегда выявляется мозаика последствий процессов активации кислорода.
Основными объектами изучения явились лягушки, рыбы, лабораторные крысы, другие млекопитающие, включая человека. Часть работы была связана с кровью крыс, а также здоровых и больных людей.
Мы охарактеризовывали эти объекты, как оптимальные биотест-системы для, например, идентификации загрязнителей окружающей среды, состояния внутренней среды животных и человека, для оценки антиоксидантного действия некоторых лекарственных препаратов и т.д. Для этого исследовали светозависимые и индуцированные реакции ПОЛ в мембранах фоторецепторов сетчатки, процессы генерации АФК, реакции гидроксилирования, ПОЛ, фосфолипаз типа А2 в монооксигеназной цитохром Р-450-зависимой системе микросом печени и плаценты, клеточных системах гепатоцитов и нейтрофилов in vivo и in vitro. Изучалась работа НАДФН -зависимой оксидазной системы на моделях изолированных нейтрофилов и цельной крови (окислительный взрыв -ОВ). Рассматривали нормально протекающие процессы при воздействии таких факторов окружающей среды, как аэрация и свет. Изучали возможные причины развития некоторых патологических состояний, в основном связанных с загрязнениями окружающей среды, недостаточностью кислорода.
Полученные результаты позволили разработать ряд рекомендаций для использования реакций АФК в тестировании состояния организмов при воздействии факторов окружающей среды, а также для оценки динамики и последствий некоторых патологических процессов (ишемическая болезнь сердца - ИБС, желтуха и т.д.) в ходе их развития и лечения (действие лекарств и низкоинтенсивная лазеротерапия).
В задачу данной работы входило не только получение и обсуждение конкретных экспедиционных, лабораторных экспериментальных и клинических материалов и результатов, но и рассмотрение определенных моделей и методических подходов, позволяющих подойти к разработке комплексных биологических тест-систем на основе реакций АФК. Уделялось также серьезное внимание теоретическому обоснованию свойств этих реакций и процессов их реализации, и тех результатов, которые отражают последствия изменений в системах организмов при различных условиях воздействия на них внешних факторов, и если это было возможно, на экологические системы в целом.
Основной принцип исследования, которому мы старались следовать, это принцип информационного единства биосферы, обеспечивающий целостность живых организмов. Это единство, на наш взгляд, определяется системой факторов окружающей среды, необходимых для жизнедеятельности. Одними из самых важных факторов этой системы, как теперь уже становится ясным, можно назвать находящиеся в воздухе в незначительных концентрациях отрицательные аэроионы. Мы пытались на основе анализа роли АФК в функционировании отдельных молекулярных, мембранных, клеточных систем и целых организмов в нормальных условиях их жизнеобитания, а также при неблагоприятных воздействиях или при моделировании подобных условий в эксперименте, сравнивать реакцию биологических систем разных уровней организации на идентичные воздействия, используя адекватные методы или наблюдение за их поведением. При таком анализе, в частности, выявлялись компоненты и свойства систем, определящие наиболее значимые адаптационные механизмы организмов в изменяющихся экологических условиях.
Остановимся теперь подробнее на конкретных моделях исследования роли АФК в жизнедеятельности живых организмов и отклика их на различные факторы окружающей среды, в том числе неблагоприятные. Рассмотрим сначала мембранные модели, в которых непосредственно осуществляется активация кислорода и которые могут быть использованы как тесты для оценки степени воздействия внешних факторов.
