Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Краткая характеристика современной экологической ситуации в Мировом океане 9
1.2. Загрязнение внутренних морей стран ЕС и России 13
1.3. Экологическая характеристика залива Петра Великого 16
1.4. Биологический мониторинг 23
1.5. Окислительный стресс 31
ГЛАВА 2. РАЙОН РАБОТ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Район работ 44
2.2. Общая биологическая характеристика объектов исследования 46
2.3. Общие условия проведения экспериментов 51
2.4. Биохимические методики 54
2.4.1. Определение белка 54
2.4.2. Определение глутатиона 54
2.4.3. Определение продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) 55
2.4.4. Количественное определение каротиноидон 56
2.4.5. Определение индекса интегральной антирадикальной активности (ИАА) 56
2.4.6. Определение активности АО ферментов 58
2.4.7. Определение металлов 59
ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ МОРСКИХ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ 60
3.1. Сравнительная характеристика низкомолекулярного звена антиоксиданти ой системы двустворчатых моллюсков 62
3.1.1. Глутатион 62
3.1.2. Каротиноиды 68
3.2. Сравнительная характеристика интегральной антирадикальной активности (ИАА) двустворчатых моллюсков 73
ГЛАВА 4. ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС В ТКАНЯХ РАЗЛИЧНЫХ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ 84
4.1. Реакция антиоксидантной защитной системы двустворчатых моллюсков на влияние абиотических факторов 85
4.2. Реакция антиоксидантной системы на кадмий-индуцированный окислительный стресс 94
4.3. Реакция антиоксидантной системы двустворчатых моллюсков на аккумуляцию тяжелых металлов в условиях аноксии 105
ГЛАВА 5. РЕАКЦИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ НА ЗАГРЯЗНЕНИЕ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ 116
5.1. Сравнительная характеристика антиоксидантной системы С. grayanus из различных акваторий зал. Петра Великого 117
5.2. Реакция антиоксидантной системы С. grayanus на хроническое загрязнение б. Десантная (Активный мониторинг) 125
ГЛАВА 6. БИОМОНИТОРИНГ АКВАТОРИЙ ЗАЛИВА ПЕТРА ВЕЛИКОГО 143
б. 1. Crenomytilus grayanus 145
6.2. Anadara broughtonu , 151
6.3. Crassosrea gigas 155
ВЫВОДЫ 169
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 171
- Краткая характеристика современной экологической ситуации в Мировом океане
- Район работ
- Сравнительная характеристика низкомолекулярного звена антиоксиданти ой системы двустворчатых моллюсков
Введение к работе
Начиная со второй половины XX века, прибрежные акватории постоянно подвергаются влиянию разносторонней деятельности человека, которая нередко приводит к различным негативным последствиям. В настоящее время масштабы загрязнения морских экосистем все сильнее опережают возможности научно-обоснованных оценок и прогнозирования последствий антропогенного воздействия. Гидробиологические индикаторы не позволяют оперативно оценить экотоксикологическую ситуацию в акваториях и нередко информация, собранная с их помощью, может быть проанализирована тогда, когда результаты воздействия проявятся на экосистемном уровне и приобретут необратимый характер. Поэтому, в последние годы в экологических исследованиях с возрастающей интенсивностью разрабатываются новые экспресс-методы, основанные на анализе тонких биохимических изменений, происходящих в организме на ранних стадиях воздействия неблагоприятных факторов среды.
Применительно к биологическому мониторингу, биохимические показатели (маркеры) могут служить для оценки раннего проявления повреждающего действия негативных факторов среды и, по своей сути, являются сигналами возникновения угрозы развития патологических процессов, т.е. носят предупредительный характер. Более того, такие маркеры приобретают особое значение при оценке совместного влияния различных видов антропогенного стресса и варьирующих факторов биотического и абиотического характера, а также при прогнозировании отдаленных последствий воздействия поллютантов на морские экосистемы. Для двустворчатых моллюсков, как и для большого числа водных беспозвоночных, характерны периодические перестройки метаболизма, индуцируемые флуктуирующими абиотическими факторами среды (температура, соленость, доступность кислорода, химическое загрязнение). В результате сдвигов в функционировании биохимических регуляторных систем, сопровождающиеся, как правило, либо активацией процессов
5 генерирования оксирадикалов, либо снижением уровня компонентов с антиоксидантной активностью, возрастает опасность развития окислительного стресса. Не исключена вероятность, что выживать в таких условиях обитания гидробионтам способствует хорошо развитая антиоксидантная система. Поэтому, нагрузки, которые периодически испытывает антиоксидантная система под влиянием экстремальных факторов, в условиях хронического воздействия металлов могут оказаться чрезмерными и привести к вспышке свободноради кального окисления со всеми соответствующими деструктивными последствиями.
В хронологическом отношении накопление иероксидов и дезорганизация в составе основных компонентов АО системы может быть наиболее ранним этапом развития всей совокупности событий, приводящих организм к окислительному стрессу с последующим летальным исходом. Расшифровка биохимических механизмов, лежащих в основе патологических сдвигов, повышает обоснованность и надежность прогнозирования экологических последствий загрязнения гидросферы и грамотного использования биологических ресурсов океана. Тем не менее, имеющиеся в литературе сведения пока не позволяют судить об универсальности и распространенности показателей окислительного стресса в биомониторинге загрязнения морской среды.
Цель и задачи работы. Выявить степень участия антиоксидантной системы в защитной реакции морских организмов, испытывающих воздействие комплексного загрязнения водной среды, исходя из представлений о ведущей роли окислительного стресса в развитии различных патологических изменений.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Разработать метод для оценки общего антиоксидантного потенциала биологической системы;
ч \
Провести сравнительный анализ содержания отдельных компонентов антиоксидантной системы в тканях массовых видов двустворчатых моллюсков;
В экспериментальных условиях оценить степень воздействия аноксии -реоксигенации и аккумуляции тяжелых металлов на биохимические показатели окислительного стресса и охарактеризовать роль антиоксидантной системы у двустворчатых моллюсков в экстремальных условиях;
На основе экспериментов по пересадке моллюсков из относительно чистых районов в загрязненную акваторию проследить динамику развития процессов окислительного стресса и оценить степень чувствительности антиоксидантной системы к комплексу тяжелых металлов, присутствующих в воде и донных отложениях;
Выявить взаимосвязь изменения уровня индивидуальных компонентов и антиоксидантной системы в целом с количеством продуктов ПОЛ в тканях моллюсков, обитающих в акваториях зал. Петра Великого с различной степенью загрязнения.
Решение этих задач способствуют применению показателей окислительного стресса в качестве адекватных биомаркеров в оценке загрязнения прибрежных морских акваторий.
Научная новизна.
Впервые дана комплексная характеристика антиоксидантной системы массовых видов дальневосточных двустворчатых моллюсков.
Выявлена высокая чувствительность отдельных антиоксидантов к воздействию неблагоприятных факторов среды, в частности к тяжелым металлам и аноксии.
Заложены теоретические и практические основы применения биохимических маркеров окислительного стресса в диагностическом и прогностическом мониторинге морской среды.
Практическое значение работы.
Использование результатов при выборе научно-обоснованных критериев рационального природопользования и оценки допустимой нагрузки для морских прибрежных экосистем.
Защищаемые положения.
В основе механизмов действия экстремальных факторов среды лежит окислительный стресс, что выражается в накоплении продуктов перекисной деструкции липидов н снижением антиоксидантного потенциала организма;
Для оценки воздействия неблагоприятных факторов среды на гидробионтов предлагается универсальный биохимический индикатор состояния антиоксидантной системы (ИАА), отражающий предрасположенность организма к окислительному стрессу. Апробация работы.
Результаты и основные положения диссертации были представлены и обсуждены на Международных конференциях: «Прибрежное рыболовство -XXI век, 2001» (Южно-Сахалинск, 2001), «Современные проблемы океанологии шельфовых морей России» (Ростов-на-До ну, 2002), Ocean 2003. Marine Technology and Ocean Science Conference (2003), PRIMO 12 (Florida, 2003), «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2004), «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004), Sixth IOC/ WESTPAC International Scientific Symposium Challenges for Marine Science in the Western Pacific (Hangzhou, China, 2004), «Mollusks of the Notheastern Asia and Nothern Pacific: Biodiversity, Ecology, Biogeography and Faunal History» (Vladivostok, 2004), «Current problems of aquatic toxicology» (Borok, Russia, 2005), «Экологические проблемы использования прибрежных морских акваторий» (Владивосток, 2006), «Проблемы устойчивого функционирования водных и наземных экосистем» (Ростов-на-Дону, 2006); Международный симпозиум Экология 2006» (Солнечный Берег, Болгария, 2006), Всероссийской конференции с участием
8 специалистов из стран ближнего и дальнего зарубежья «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2002); 5-й региональной конференции «Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2002), VII Дальневосточной молодежной школе конференции по актуальным проблемам химии и биологии МЭС ТИБОХ (Владивосток, 2003); Региональной школе-семинаре молодых ученых, аспирантов и студентов «Анализ современного состояния и перспективы развития регионов Дальнего Востока», (Биробиджан, 2003); Конференции молодых ученых Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН. (Владивосток, 2001).
Публикации По теме диссертации опубликовано 18 работ.
Краткая характеристика современной экологической ситуации в Мировом океане
В последние десятилетия Мировой океан все больше вовлекается в сферу активной хозяйственной деятельности человека, что находит свое выражение в возрастании вылова морепродуктов, усилении эксплуатации природных богатств шельфа и т.д. Одновременное глобальное развитие энергетики, промышленности, интенсификация сельского хозяйства приводит к колоссальному увеличению объемов загрязняющих веществ, поступающих в морскую среду. На сегодняшний день пристальное внимание мировой научной общественности привлекает проблема загрязнения и диагностика состояния Мирового океана, в решении которой участвуют многие международные организации, поскольку, по оценке ведущих экологов, усиливающееся антропогенное воздействие может стать мощным эволюционным фактором (Цыбань, 1989; Христофорова, 1989).
Мировой океан представляет собой цепь сложных и разнообразных взаимосвязей с огромными биологическими и минеральными ресурсами. Так как наиболее промышленно развитые районы мира расположены на берегах морей и эстуариев (около 80% населения Земли живут на морском побережье и в пределах 100 км от него), прибрежные воды особенно подвержены опасности загрязнения. Общеизвестно, что в эстуариях и прибрежных районах находятся самые богатые запасы морских биоресурсов, так называемые «прибрежные сгущения» (Вернадский, 1965), разнообразие и обилие которых зависит от природных условий. В последнее время появляется много сообщений о том, что во всех районах мира, особенно вблизи прибрежных городов, происходит обеднение животного и растительного мира. Экосистемы изменяются таким образом, что начинают доминировать прежде малочисленные виды, но более устойчивые к загрязнению. Использование прибрежных морских вод в качестве приемников сбрасываемых отходов создает проблемы для деятельности различных производства, зависимых от состояния окружающей среды, снижая уровень жизни человека. В экологически неблагополучных шельфовых районах ухудшается качество морского сырья и выпускаемой из него продукции.
В настоящее время существует доминирующее предположение, что колоссальный объем Мирового океана (1379х106 км) совместно с процессами естественного самоочищения приведут к уменьшению эффекта воздействия загрязняющих веществ (более 30 тыс. разных химических соединений) на морские экосистемы в связи с разбавлением этих веществ морской водой (Цыбань, 1989). По статистике, в моря ежегодно поступает до 300 млрд. м сточных вод (90% которых не подвергается предварительной очистке), содержащих свыше 300 млн. т растворенных химических веществ и твердых частиц. Основная масса загрязняющих веществ поступает в водные экосистемы в процессе добычи и транспортировки нефти, производства современных синтетических веществ, использования ископаемых энергетических ресурсов и т.д. Приблизительный объем мусора, сбрасываемого в Мировой океан, составляет около 6.5 млн. т, значительная часть которого - устойчивые синтетические вещества (пластики - период их утилизации достигает 50 лет) (Dickhut, Justafson, 1995; Sole et al., 1995). Главная причина опасений в отношении загрязнения Мирового океана связана с тем, что попадающие вещества, поступают и распределяются по его объему неравномерно. Многочисленные исследования влияния загрязнения на морские ресурсы показали, что максимум загрязнения приходится на поверхностные слои и прибрежные районы. Стратифицированность и естественное разделение океана на слои препятствуют вертикальному перемешиванию, равномерному распределению и проникновению загрязняющих веществ из верхних слоев в нижние. В результате возникают поля хронического загрязнения в областях схождения разнородных масс, эстуарийных зонах и зонах квазистационарных круговоротов, отнесенные к экологически напряженным зонам океана (Цыбань, 1989). Необходимо упомянуть о значении сезонного термоклина, который наблюдается на глубинах менее 100 м, и, следовательно, все загрязнители, попадающие в море, сосредоточиваются в слое воды, расположенном выше этого термоклина. Поэтому толща слоя воды, в котором интенсивно растворяются загрязнители, не равна средней глубине океана (около 4 тыс. м), а составляет примерно 100 м. Соответственно объем этого слоя гораздо меньше объема всего океана.
Нефть и нефтепродукты имеют поистине глобальное распространение в Мировом океане. Основными источниками поступления нефти в морскую среду являются сбросы танкеров и других судов, добыча нефти на морском шельфе, ее переработка, нефтяные отходы и аварийные ситуации. Достаточно мощный вклад вносит атмосферный поток антропогенных углеводородов объемом 50-90 млн. т. в год (Патин, 1979; Патин, 1985). Наиболее опасными являются нефтяные масла, которые распространяются на расстояние более чем 300 км от источника. К началу 80-х годов в океан ежегодно поступало около 16 млн. т нефти, что составляло 0,23% мировой добычи. В период за 1962-79 гг. в результате аварий в морскую среду поступило около 2 млн. т нефти. Большие массы нефти поступают в моря по рекам, с бытовыми и ливневыми стоками. Объем загрязнений из этого источника составляет около 2 млн. т в год. Со стоками промышленности ежегодно попадает 0,5 млн. т нефти, с танкерного флота - около 25000 тонн нефти. За последние 35 лет в Мировом океане пробурено свыше 2000 скважин. Снимки поверхности Земли, сделанные со спутников показывают, что уже почти 30% поверхности океана покрыто нефтяной пленкой. Особенно загрязнены воды Средиземного моря и Атлантического океана.
Район работ
Залив Петра Великого расположен в северо-западной части Японского моря. Западной его границей является устье р. Туманной, восточной - мыс Поворотный. Береговая линия сильно изрезана. В пределах акватории зал. Петра Великого находится множество заливов и бухт (Уссурийский, Амурский, Славянский, Посьета, Восток, Находка и др.), островов (Русский, Попова, Рейнеке, Рикорда, Путятина, Аскольд, Большой Пелис, Фуругельма и др.). Характерными особенностями данного района являются относительно небольшая глубина и обширность занимаемой площади. Полуостровом Муравьев-Амурский и группой островов, расположенных к юго-западу от него, зал. Петра Великого разделяется на два больших залива: Амурский и Уссурийский. Владивосток занимает все прибрежное пространство между Амурским и Уссурийским заливами.
Дно большинства бухт и заливов района выстилают алеврито-пелитовыс и пелитовые илы. В районах устьев илы замещаются песками. Мелкие пески создают общий фон осадков в зал. Петра Великого. Вдоль высоких берегов, где развиты процессы волнового разрушения, дно сложено грубообломочным материалом - валунами, галькой, гравием, на некоторых участках наблюдается значительное скопление обломков ракуши. Аналогичная картина распределения донных осадков характерна для островного района. Острова, находящиеся рядом, часто имеют общий цоколь из коренных пород, почти не перекрытый рыхлым материалом.
Для кутовых частей бухт и заливов характерны заросли морских трав и водорослей. При их отмирании и захоронении происходит засорение осадков (в основном илов) гниющей органикой, что вызывает локальное изменение химических свойств морской воды - аномальное содержание кислорода и прочее.
Гидрологический режим зал. Петра Великого определяется географическим положением, геоморфологией берегов, климатическими условиями, материковым стоком, приливно-отливными явлениями, а так же системой течений, которые влияют на характер распределения температуры, солености, плотности и др. (Подорванова и др., 1989).
Наиболее низкая температура воды отмечается в январе-феврале. В прибрежных районах она опускается до -2 -1 С. В июне температура воды повышается от 8 до 15 С, а в августе достигает максимальных значений (23-25 С). С конца августа начинается процесс охлаждения.
Прибрежные воды могут существенно модифицироваться под влиянием местных условий, прежде всего речного стока. Так, если открытая часть зал. Петра Великого представлена япономорской водной массой, то Амурский и Уссурийский заливы, а так же многочисленные мелкие заливы и бухты заняты прибрежными видоизмененными водными массами. Эти воды характеризуются изменением солености от 20 до 31%о и относятся к эстуарпому типу вод (Христофорова и др., 1993).
Амурский залив. Южная граница Амурского залива проходит по линии мыс Брюса с о-вами Циволько и Желтухина. С запада он ограничен континентальным побережьем, с востока - п-вом Муравьева-Амурского и продолжающей его группой островов.
На северо-западе в залив впадает самая крупная река южного Приморья - Раздольная, играющая огромную роль в формировании гидрохимического и гидрологического режима акватории. Северная часть Амурского залива отличается малыми глубинами и большим количеством каменистых и песчано-илистых банок. Особенно много банок в районе, расположенном к северо-востоку от линии, соединяющей острова Речной и Скребцова. Грунт в северной части преимущественно ил, местами песок, покрытый слоем ила (Подорванова и др., 1989).
Уссурийский залив. Самая крупная акватория залива Петра Великого, занимающая северо-восточную его часть. С северо-запада он ограничен п вом Муравьев-Амурский и его островным продолжением (о-ва Русский, Попова, Рикорда, Рейнске и др.), с востока - материковым берегом и о. Аскольд.
В Уссурийский залив впадает большое количество водотоков, но в основном это небольшие реки, ручьи и временные водотоки, возникающие в периоды выпадения ливневых дождей. Наиболее крупными реками являются Артемовка, Шкотовка, впадающие в бухту Муравьиную и р. Петровка, Каменка, впадающие в б. Суходол.
Сравнительная характеристика низкомолекулярного звена антиоксиданти ой системы двустворчатых моллюсков
Тиол-содержащие компоненты, среди которых доминирует глутатион, играют важную роль в организме, защищая его от свободнорадикалыюго окислительного повреждения и участвуя в детоксикации органических ксенобиотиков и ТМ (Meister, 1989).
Анализ литературы, посвященной этому вопросу, свидетельствует, что основные достижения в изучении биохимических свойств глутатиона получены исключительно на примере млекопитающих. Водные организмы и особенно морские беспозвоночные в этом отношении изучены крайне слабо. Среди немногочисленных публикаций, посвященных изучению глутатиона водных организмов, преобладают работы, касающиеся функциональной роли TSH и соответствующих ферментов в детоксикации органических ксенобиотиков и антирадикальных реакциях у рыб (Aksnes, Njaa, 1981; Tappel et al., 1982; Braddon et al., 1985), ракообразных (Livingston, 1991) и отдельных представителях моллюсков (Ramos-Martinez et a]., 1983; Blum, Fridovich, 1984; Wenning ct al., 1988). В связи с этим принято считать, что уровень глутатиона в определенной мере характеризует степень сбалансированности окислительно-восстановительных процессов и общий детоксикационный потенциал в биологической системе.
Учитывая вышесказанное, а также антирадикальные свойства этого цистеин-содержащего трипептида, была поставлена задача по изучению содержания глутатиона в тканях двустворчатых моллюсков. В наших исследованиях были использованы двустворчатые моллюски (С. grayanus, С. gigas, Л. broughtonii, М. karilensis, A. boucardi, М. yessoensis, М. stimpsoni, G. yessoensis), собранные в одно время и обитающие в схожих гидрологических и гидрохимических условиях акватории залива Петра Великого.
Полученные результаты показали, что все исследованные моллюски существенно отличались по уровню глутатиона (рис. 6). Более того, в содержании этого компонента отмечалась ярко выраженная тканевая специфичность. Наиболее высокие концентрации глутатиона были зафиксированы в клетках пищеварительной железы у всех исследованных моллюсков (рис. 6А). Наиболее высокое содержание тиола было отмечено в пищеварительной железе мидии Грея (32.62±1.98 мкг/мг белка) и устрицы С. gigas (19.98±0.99 мкг/мг белка), тогда как у приморского гребешка М. yessoensis был зафиксирован самый низкий уровень глутатиона (1.95±0.12 мкг/мг белка).
В отличие от клеток пищеварительной железы содержание глутатиона в жабрах исследованных моллюсков (рис. 6Б) варьировало в более узких пределах: от 3.5 мкг/мг белка у глицимериса до 5.47±0.29 мкг/мг белка у анадары A. broughtonii. В представленной группе моллюсков резко выделяется мерценария М. stimpsoni, в жабрах которой обнаружена самая низкая концентрация восстановленного трипептида - 0.176 ±0.008 мкг/мг белка.
Особенно отчетливо особенности в тканевом распределении этого антиоксиданта проявляются при сопоставлении соотношений уровней глутатиона в пищеварительной железе и жабрах. У С. grayanus содержание трипептида в клетках пищеварительной железы было почти в 8 раз выше, чем в жабрах. В меньшей степени эти различия были обнаружены в тканях модиолуса, устрицы и глицимериса в 6, 5 и 3 раза, соответственно. В этом отношении среди исследованных моллюсков выделяются два моллюска А. broughtonii и М. yessoensis. В тканях анадары уровень глутатиона был обнаружен практически в равных количествах, тогда как у приморского гребешка концентрация трипептиды в жабрах была почти в 2 раза выше, чем в пищеварительной железе.
В целом, самые высокие уровни трипептида в пищеварительной железе были отмечены у представителей семейства Mytilidae (М. kurilensis и С grayanus), являющимися типичными представителями сублиторали. Учитывая особенности обитания моллюсков следует отметить, что среди эпибионтов выделяются С. grayanus, отличающийся от других моллюсков высоким содержанием глутатиона в пищеварительной железе и М. yessoensis, у которого было зафиксировано низкое значение глутатиона.
