Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 6
1. Состав и функции липидов поверхности кожи 6
2. Факторы свободнорадикального повреждения липидов кожи 14
3. Роль клеток эпидермиса в реакциях кожи на УФ-облучение 17
4. Кожа как часть иммунной системы человека 21
5. Лилофильные микроорганизмы эпидермиса и их роль в патогенезе себорейного дерматита и разноцветного лишая 34
Материалы и методы исследования .40
Результаты и их обсуждение 46
1 .Сквален - наиболее фотолабильный компонент липидов поверхности кожи . 46
2. Липоперекиси сквалена в зависимости от дозы активируют или угнетают функциональную активность кератиноцитов 54
3. Продукты фотоокисления сквалена подавляют реакцию контактной гиперчувствительности кожи 65
4. Роль липопероксидации сквалена в патогенезе разноцветного лишая (pityriasis versicolor) 71
5. Сквален - уникальный компонент кожи человека среди высших приматов 81
6. Содержание сквалена в липидах поверхности кожи при себорейном и атоническом дерматитах 84
Заключение 89
Выводы 95
Список литературы : 97
Благодарности 107
- Факторы свободнорадикального повреждения липидов кожи
- Лилофильные микроорганизмы эпидермиса и их роль в патогенезе себорейного дерматита и разноцветного лишая
- Липоперекиси сквалена в зависимости от дозы активируют или угнетают функциональную активность кератиноцитов
- Роль липопероксидации сквалена в патогенезе разноцветного лишая (pityriasis versicolor)
Введение к работе
«Существует сто девяносто три вида мелких и крупных обезьян. Сто девяносто два из них имеют волосяной покров. Исключение составляет голая обезьяна - Homo sapiens» [11]. Этими словами начинается книга известного антрополога и зоолога Десмонда Морриса «Голая обезьяна». Кожа человека, в отличие от всех остальных приматов, действительно имеет ряд уникальных особенностей: 1) отсутствие развитого волосяного покрова; 2) сильное развитие слоя подкожного жира, имеющего низкую точку плавления около 15С; 3) наличие на поверхности кожи многочисленных сальных желез, продуцирующих кожное сало (sebum); 4) расположение по всему телу потовых желез.
Следует также отметить, что особенностью человека как вида является открытость его кожного покрова воздействию факторов внешней среды. Поверхность кожи покрыта липидной плёнкой, возникающей за счёт смешения секрета сальных желез (glandulae sebaceae) с липидами, продуцируемыми кератиноцитами. Образованная таким образом плёнка липидов поверхности кожи (ЛПК) включает в себя триглицериды (60%) и продукты их гидролиза (диглицериды, моноглицериды и свободные жирные кислоты), возникающие за счёт липолитической активности резидентной микрофлоры, эфиры восков (24-26 %), холестерин и его эфиры (2.5 - 3,0 %), а также, сквален (11.5 - 12.5 %) -полиненасыщенный тритерпен, который редко встречается в ЛПК других млекопитающих. Большая площадь контакта ЛПК с кислородом воздуха в сочетании с действием ультрафиолетового (УФ) света, от которого кожа человека не экранирована волосяным покровом, создаёт предпосылки для инициации и развития в ЛПК реакций цепного окисления липидов. Кроме того, резидентные организмы поверхности кожи, в частности, возбудитель разноцветного лишая - грибок Pityrosporum orbiculare, также могут подвергать липопероксидации компоненты ЛПК.
Существует предположение, что окисление молекул, входящих в состав ЛПК может быть одной из первых мишеней действия УФ-света и других прооксидантных воздействий на кожу, запускающих последовательность биохимических реакций, вовлеченных в ответ организма на это воздействие. К числу таких реакций относятся: распознавание повреждений в ДНК, инактивация ферментов, генерация активных форм кислорода, фотоактивация
синтеза витамина D3, фотоизомеризация уроканиновой кислоты, окисление арахидоновой кислоты в каскаде синтеза простагландинов. О важной роли свободнорадикальных процессов в коже свидетельствует корреляция между продукцией активных форм кислорода при УФ-облучении и повреждением иммунокомпетентных клеток кожи [39].
Тритерпен сквален, один из компонентов ЛПК, обладает шестью двойными связями, и поэтому является потенциально наиболее окисляемым липидом. Однако степень подверженности сквалена окислительной модификации при прооксидантных воздействиях на кожу и возможная биологическая активность продуктов его пероксидации остаётся невыясненной.
Актуальность исследования процессов свободнорадикального окисления в липидной плёнке, покрывающей кожу человека, обусловлена не только ролью этих процессов в физиологическом ответе на воздействие УФ-света, но и их значением при фототерапии различных кожных заболеваний, а также при воздействии косметических средств и процедур.
Факторы свободнорадикального повреждения липидов кожи
Основным фактором инициации свободнорадикальных реакций в коже является, безусловно, УФ свет, индуцирующий как местные (эритема, образование солнечноожоговых клеток) так и системные эффекты (иммуносупрессия) [13]. Кроме УФ света свободнорадикальные реакции в коже могут инициироваться озоном как компонентом фотохимического смога [25] и резидентными микроорганизмами кожи, обладающими липоксигеназной активностью, как например, дрожжеподобными грибками рода Pityrosporum [58]. Последние два фактора начали изучаться сравнительно недавно и исследования в этих вопросов пока не вышли за рамки отдельных экспериментов. В то же время механизмам и значению свободнорадикального фотоокисления липидов кожи посвящена обширная литература.
УФ излучение, падающее на кожу человека, может поглощаться, отражаться или рассеиваться. Рассеяние происходит на счёт структурных различий таких элементов, как фолликулы волос и сальные железы, либо компонентов клеток, таких как различные органеллы. Глубина проникновения УФ излучения зависит от длины волны: чем больше длина волны, тем глубже проникновение. Например, на глубину 30 микрон от поверхности кожи проникает 50% УФА (365 нм), 33% УФВ (313 нм), 5% УФС (254 нм) [21].
Инициация свободнорадикальных процессов в липидах поверхности кожи под действием УФ света может быть обусловлена за счёт поглощения квантов: 1) гидродиоксидами (пероксидами) липидов, которые всегда присутствуют в липидных системах вследствие автоокисления; 2) скваленом, поглощающим Уф-свет из-за наличия в молекуле системы сопряженных двойных связей; 3) фотосенсибилизаторами, которые могут использоваться при фототерапии. Вопрос о том, какой из вышеназванных путей доминирует в том или ином случае в зависимости от спектра, дозы, состояния кожи и т. д. представляет значительный интерес для физиологии, косметологии и фототерапии.
В одной из первых работ, посвященных исследованию этого вопроса, была обнаружена корреляция между степенью пероксидации ЛПК и содержанием сквалена [52]. Для выяснения вопроса о роли активных форм кислорода в пероксидации ЛПК проводилось облучение сквалена в присутствии и без фотосенсибилизатора 8-метоксипсоралена, а также при добавлении тушителя синглетного кислорода - азида натрия. Как показали данные экспериментов 8-метоксипсорален увеличивал степень пероксидации липидов, оцененной по накоплению малонового диальдегида, а азид натрия наоборот снижал пероксидацию. Эти данные свидетельствуют о том, что в свободнорадикальном фотоокислении сквалена принимает участие синглетный кислород. В этом же исследовании было показано, что эпидермальный кератин ингибировал накопление малонового диальдегида [52]. Интересно отметить, что как было показано позже, образование малонового диальдегида при облучении сквалена УФВ-излучением было в 20 раз больше по сравнению с действием УФА-излучения [27].
Систематическое применение ПУФА-терапии для лечения псориаза приводит к заметному возрастанию степени пероксидации ЛПК и снижению концентрации сквалена в ЛПК, что по мнению авторов это может играть определенную роль в терапии псориаза [36].
Как было показано в работе [73] под действием УФ-излучения сквален легче окисляется по сравнению с ненасыщенными жирными кислотами себума, его пероксидации способствуют повышение температуры и понижение рН. Хорошее соответствие между спектрами поглощения сквалена и экологического УФ-света, а также спектра эритемы, позволяют предположить, что с одной стороны сквален выполняет роль ультрафиолетового светофильтра на поверхности кожи, а с другой стороны, именно воздействие УФ-света на сквален связано с возникновением эритемы. Оценка роли ЛПК как УФ-фильтров показала, что на коже лба, например, липиды кожного сала снижают пропускание света с длиной волны 300 нм на 10% [15].
Следует иметь ввиду, что УФ-излучение наряду с иммунной супрессией (циклоспорин А с кортикостероидами) являются кофакторами развития гиперплазии сальных желёз. При этом показано, что повышенная экспрессия гена Smad7, связанного со старением, коррелирует с гиперплазией сальных желез, в то время как повышенная экспрессия онкогена с-тус обуславливает усиление продукции себума [109].
В процессе эволюции в коже сформировались защитные механизмы, позволяющие снизить повреждающее действие УФ-излучения. Часть из них уменьшает число фотонов , достигающих уязвимых структур кожи. В качестве химических УФ-фильтров выступают вещества, поглощающие УФ-излучение (меланин, уроканиновая кислота). Роль физического фильтра играет роговой слой, который утолщается в ответ на интенсивное УФ-облучение [8].
Для защиты от повреждающего действия УФ-излучения в коже сформировалась надежная система защиты в виде жирорастворимых антиоксидантов - а-токоферола, Р-каротина, сквалена [42, 8]. Главная функция антиоксидантов на поверхности кожи - защита эпидермальных липидов и кератина от свободнорадикального окисления, инициируемого не только УФ-светом, но и химическими прооксидантами и аэробными микроорганизмами [96]. В областях богатых сальными железами а-токоферол доставляется к поверхности благодаря секреции себума. Снижение уровня токоферола в роговом слое считается самым ранним признаком окислительного стресса в коже. Примечательно, что в роговом слое кожи существует градуальная зависимость увеличения степени окисленности кератина и снижения уровня антиоксидантной защиты по мере приближения к поверхности кожи [94, 96].
Прямые доказательства защитного действия антиоксидантов при УФ-облучении кожи отчётливо проявляются их местной аппликации на кожу. В частности, при нанесении смеси антиоксидантов на участок кожи, подверженный действию УФА-света, наблюдалось как увеличение минимальной дозы, вызывающей эритему, так и ослабление проявлений фотодерматоза [31.
В связи с вышесказанным, роль сквалена как компонента себума в регуляции сободнорадикальных процессов на поверхности кожного покрова человека остаётся не вполне ясной. А именно, наличие шести двойных связей позволяет рассматривать сквален в качестве высоколабильной мишени прооксидантных воздействий, что подтверждается тесной корреляцией между степенью липопероксидации себума и концентрацией сквалена [72]. С другой стороны, имеются сведения о сквалене как одном из наиболее мощных тушителей синглетного кислорода [44]. Возможно, что проявление различных активностей сквалена: про- и антиоксидантной, зависит от конкретной ситуации, т.е. сквален является своеобразным буфером свободнорадикальных реакций, поддерживая их на определенном уровне.
Лилофильные микроорганизмы эпидермиса и их роль в патогенезе себорейного дерматита и разноцветного лишая
Одной из важнейших функций рогового слоя кожи является защита организма от проникновения микроорганизмов. Благодаря непрерывной десквамации корнеоцитов происходит постоянное удаление резидентных микроорганизмов кожи. Другими составляющими защитных свойств кожи является плотное смыкание корнеоцитов, кислотность поверхности кожи (рН от 4 до 6.5) и взаимная конкуренция между населяющими поверхность кожи микроорганизмами, к числу наиболее типичных относятся бактерии {Propionbacterium acnes, Staphylococcus epidermis) и грибки {Pityrosporum ovale) [54]. Будучи представителями резидентной микрофлоры нормальной кожи, эти организмы могут становиться патогенными при травмах кожи и прочих нарушениях её механической целостности.
Липиды поверхности кожи также являются важным элементом антимикробной и антигрибковой защит. Продуцируемые эпидермисом полярные липиды и гликосфинголипиды, а также свободные жирные кислоты, являющиеся результатом действия гидролитических ферментов микроорганизмов на триглицериды себума, обладают антибактериальной активностью в отношении патогенных стафилококков in vitro и in vivo [55, 57].
Липофильный компонент микрофлоры кожи человека представлен дрожжеподобными грибками рода Pityrosporum, которые встречаются более чем у 90% населения [35]. При этом овальная форма - Pityrosporum ovale(P. ovale) чаще встречается на коже волосистой части головы, а круглая Pityrosporum orbiculare (P. orbiculare)- на коже туловища. Грибки концентрируются вокруг сальных желез и используют их секрет как источник жирных кислот, необходимым грибам для развития.
При определенных условиях организм человека теряет способность контролировать рост питироспоровых грибов и удерживать их в сапрофитном состоянии. При этом, если в норме микрофлора волосистой части головы содержит 46% P. ovale, то при перхоти (слабой форме себорейного дерматита) она на 74% состоит из них, а при клинически выраженном себорейном дерматите количество грибов достигает 83% и наблюдается их бурный рост [76]. Экспериментальная модель себорейного дерматита была получена путем втирания в кожу испытуемых культуры P. ovale. В дальнейшем был отмечен регресс экспериментального дерматита под воздействием различных антимикотических препаратов, что подтверждает этиологическую роль P. ovale при себорейном дерматите [105]. Впервые гипотеза об инфекционной природе себорейного дерматита была высказана в 1873 г., а в 1874 г. Malassez предположил, что возбудителем себорейного дерматита является Pityrosporum-подобный микрорганизм, что и было подтверждено в дальнейшем. В честь этого ученого микроорганизмы получили второе название — Malassezia. В настоящее время в научной литературе используются в равной степени оба родовых названия — Pityrosporum и Malassezia, причём P. orbiculare идентичен Malassezia furfur.
Отмечено также, что грибки рода Pityrosporum обладают липазной активностью за счет действия липолитических ферментов, расщепляющих кожное сало на свободные жирные кислоты, которые, с одной стороны, необходимы для их роста, а с другой стороны — провоцируют воспаление кожи в областях колонизации. Недавно высказана точка зрения, что себорейный дерматит является воспалительной реакцией на P. ovale [76].
В настоящее время выявлено большое число факторов, способствующих гиперактивации грибковой микрофлоры и, как следствие этого, возникновению себорейного дерматита. Необходимо отметить, что по своей природе эти факторы в основном являются нейрогенными, гормональными, иммунными.
Общеизвестно, что обострения себорейного дерматита нередко связаны с нервными стрессами. Отмечено также, что пациенты с заболеваниями центральной нервной системы, болезнью Паркинсона, параличами черепных нервов, параличами туловища обладают определенной предрасположенностью к развитию себорейного дерматита, который в данной ситуации имеет склонность к развитию распространенных поражений кожного покрова. Высказано предположение, что себорейный дерматит у данного контингента больных — результат чрезмерного скопления кожного сала на коже вследствие значительного ограничения двигательной активности пациентов [81].
Влияние гормональных факторов на развитие себорейного дерматита доказывают многие факты. Примером подобного влияния могут быть те ситуации, когда себорейный дерматит наблюдается в неонатальном периоде жизни и обычно исчезает в возрасте 6-12 месяцев. По-видимому, в данном случае себорейный дерматит может рассматриваться как реакция на стимуляцию материнскими гормонами. Кроме того, себорейный дерматит часто поражает лиц в постпубертатном возрасте. При этом дополнительные данные о гормональном влиянии подтверждают научные исследования, показывающие, что себоцит человека реагирует на андрогенную стимуляцию. И действительно, у мужчин себорейный дерматит наблюдается чаще, чем у женщин, что согласуется с предположением о контролировании андрогенами деятельности сальных желез. Таким образом, гормональный фактор по сути представляет собой воздействие на продукцию себума [4].
Ярким доказательством влияния иммунных факторов на развитие себорейного дерматита служат данные о его распространенности у пациентов с имму но дефицитами: если у здорового населения себорейный дерматит встречается в 8% случаев, то у ВИЧ-инфицированных он наблюдается в 36 %, а у больных СПИДом — в 80% [105]. Точный механизм, под действием которого вирус иммунодефицита способствует атипичному и взрывному началу себорейного дерматита и других распространенных воспалительных заболеваний кожи, неизвестен. Для его уточнения исследовано много факторов, включая определение СД4+ Т-лимфоцитов, плотность дрожжей P. ovale [81] и влияние факторов питания [4].
Липофильный грибок Pityrosporum orbiculare является возбудителем кератомикоза разноцветного (отрубиевидного) лишая (Pityriasis versicolor) , который проявляется довольно характерными изменениями в виде шелушащихся разноцветных пятен. Впервые описано Robin 1853 году, хотя возбудитель болезни был выделен еще раньше — Eichstedt в 1846 году. Грибок поражает поверхностные чешуйки рогового слоя эпидермиса на гладкой коже и в устьях волосяных фолликулов.
Встречается этот лишай чаще у мужчин молодого возраста, но может быть и у детей, в основном начиная с периода полового созревания. Однако известны случаи заражения грудных детей больной матерью в общей постели. Основным симптомом этого микоза является невоспалительное, не возвышающееся над поверхностью кожи пятно. Первым отличительным признаком болезни служит окраска высыпаний, которая, как свидетельствует ее название, может быть разнообразной. Чаще пятна изначально имеют розоватый или желтоватый цвет, однако довольно скоро приобретают кофейный оттенок, а затем постепенно насыщенность его усиливается до коричневого цвета. Причем у одного и того же больного одно временно могут наблюдаться пятна всех перечисленных видов окраски [6]. Локализация пятен отрубевидного лишая также имеет свои характерные особенности. Располагаются они в основном вокруг устья волосяных фолликулов преимущественно на коже задней поверхности шеи, верхней половины груди и спины.
Вторым главным отличительным признаком данного микоза (что также следует из его названия), является отрубевидное шелушение. Действительно, на поверхности пятен отмечается мелкопластинчатое шелушение, причем отторгающиеся белесоватые частицы рогового слоя весьма напоминают по своему виду и консистенции отруби. Шелушение становится особенно заметным при поскабливании высыпаний.
Липоперекиси сквалена в зависимости от дозы активируют или угнетают функциональную активность кератиноцитов
Как было показано в предыдущем разделе (рис.4,5) сквален является наиболее фотолабильным компонентом ЛПК человека, причем его фотоокисление сопряжено с накоплением продуктов пероксидации. Это, естественно, ставит вопрос о том, обладают ли продукты пероксидации сквалена какой-либо биологической активностью. Для оценки возможной биологической активности фотоокисленного сквалена использовались клеточная культура кератиноцитов человека и тканевая культура эпидермиса уха морских свинок. Добавление фотоокисленного сквалена к культуре кератиноцитов человека вызывало в зависимости от дозы и времени инкубации стимулирующий или ингибирующий эффект на синтез ДНК (рис. 10, табл.2) и белка (табл.3) в клетках, оцениваемый методом радиоавтографии. Подобным эффектом обладали также липоперекиси (гидроперекись кумола и 13-гидроксилинолеат), что может свидетельствовать о наличии среди фотопродуктов окисления сквалена биологически активных ли-поперекисей, запускающих физиологический ответ организма на действие УФ-света (рис. 10, табл.2, 3).
Приблизительно одинаковое (в 1.3-1.4 раза) возрастание синтеза ДНК в культуре кератиноцитов при инкубации 3 часа наблюдалось для различных доз липоперекисей: 0.1 мкг/мл для гидроперекиси кумола, 0.5 мкг/мл для 13-гидроксилинолеата и 1.0 мкг/мл для фотоокисленного сквалена. Однако несмотря на различие концентраций вышеупомянутых веществ, содержание продуктов пероксидации, оцененное в тесте с ДЭФДА было одинаковым и составляло по величине поглощения при 557 нм - 0,5 х 10" . Десятикратное увеличение опти-ческой плотности при 557 нм, равное 5.0 х 10" , вызывало почти одинаковое снижение биосинтеза белка независимо от вида липоперекиси.
Эффект УФ-индуцированных и синтетических липоперекисей также зависел от времени, прошедшего после обработки. Фотоокисленный сквален в концентрации 1.0 мкг/мл стимулировал включение меченого фенилаланина через 1 час после обработки, а также стимуляцию синтезов как белка, так и ДНК через 3 часа после обработки. Однако через 24 часа после обработки фотоокисленный сквален вызывал снижение синтезов белка и ДНК (рис. 12,13). Качественно схожие ответы клеток наблюдались при их обработке синтетическими липоперекисями (табл. 2,3).
Полученные результаты по влиянию фотоокисленного сквалена на кера-тиноциты в зависимости от дозы и времени инкубации для наглядности представлены в виде трёхмерных графиков на рисунках 12 и 13. Из представленных зависимостей видно различие действия фотоокисленного сквалена на синтез ДНК и белков.
Продукты фотоокисления сквалена и липоперекиси вызывали в тканевой культуре клеток эпидермиса уха морских свинок в низких дозах (10 -50 мкг/мл) вызывали изменения аналогичные тем, которые развиваются после воздействия УФ-света: возрастание числа пигментированных клеток со зрелыми меланосо-мами внутри и стимуляция синтеза белков, зарегистрированная методом радиоавтографии (рис.11). Более высокие дозы приводили к повреждению меланоци-тов и клеток эпидермиса, которое проявлялось в вакуолизации и нарушении структуры этих клеток.
Гистологические изменения в клетках эпидермиса уха морской свинки под действием разных концентраций гидроперекиси кумола, по сравнению с необработанным эпидермисом, показаны на рис. 14. Видно, что при стимулирующей синтез белков и ДНК дозе (20 мкг/мл), через 3 часа после обработки возрастает как число меланоцитов, так и степень их пигментации (рис. 14Ь). При более высокой дозе (50 мкг/мл), вызывающей угнетение синтеза белков и ДНК, наблюдаются дезорганизация структур эпителия и появление вакуолизирован-ных клеток (рис. 14с).
При электронной микроскопии клеток эпидермиса уха морских свинок, обработанных стимулирующей концентрацией (20 мкг/мл) гидроперекиси кумола, видно по сравнению с необработанными клетками увеличение как числа зрелых меланосом внутри меланоцита, так и числа меланосом в окружении ке-ратиноцита .
Таким образом, липоперекиси вызывают в коже такие же изменения в эпидермисе как и прямое действие УФ-света на кожу. А именно, небольшие («стимулирующие») дозы липоперекисей вызывают увеличение числа пигментированных клеток с зрелыми меланосомами как внутри меланоцитов, так и в окружающих их кератиноцитов. Высокие концентрации липоперекисей вызывают повреждение как меланоцитов, так и кератиноцитов. В связи с этим интересно отметить, что качественно сходные эффекты, вызываемые ненасыщенными жирными кислотами и эйказоноидами были описаны для клеток эпидермиса [24, 45, 50, 69]. Мишенью, на которую действуют липоперекиси в клетке, вероятно, являются её мембраны, протонная проницаемость которых резко возрастает (примерно в 100 раз) под действием, окисленной линолевой кислоты, как это было показано более 30 лет тому назад [1].
Следует иметь в виду, что липоперекиси, образованные из ЛПК, являются низкомолекулярными веществами, которые легко могут проникать из поверхности рогового слоя вглубь до живых клеток и оказывать там физиологическое воздействие. Таким образом, вышеописанные данные показывают, что фотоокисление сквалена в составе ЛПК может рассматриваться в качестве пускового механизма, запускающего каскад физиологических реакций в эпидермаль-ных клетках после их облучения УФ-светом.
Роль липопероксидации сквалена в патогенезе разноцветного лишая (pityriasis versicolor)
Как уже было сказано, разноцветный (отрубевидный) лишай (pityriasis versicolor) - кератомикоз, вызываемый грибком Pityrosporum orbiculare. Характерными проявлениями заболевания является появление пятен коричневого цвета, поверхность которых шелушится отрубевидными чешуйками. Затем на месте регрессирующих высыпаний, особенно после воздействия УФ-света, часто остаются участки депигментации - псевдолейкодерма. Известно, что P. orbiculare способен окислять in vitro ненасыщенные жирные кислоты, при этом образуются дикарбоновые кислоты, являющиеся ингибиторами тирозиназы. Однако количество этих производных слишком мало, для того чтобы вызвать заметную депигментацию кожи [19]. Обнаружение в культуре P. orbiculare методом газовой хроматографии гидроперекисей указывает на наличие липопе-роксидазной активности грибка. Легкоокисляемый сквален, не являющийся, как и холестерин, источником питания грибка может подвергаться окислительной модификации за счёт вовлечения в реакции цепного окисления, индуцированные ненасыщенными жирными кислотами, формируя при этом физиологически активные метаболиты. Для проверки этого предположения была оценена возможность липопероксидации сквалена в культуре P. orbiculare.
Кинетика роста P. orbiculare, оцениваемая по увеличению сухой массы гриба, в культуре с различными источниками жирных кислот показана на рис. 19. Как видно из приведенных данных, стационарная фаза достигается на 10 день, независимо от источника жирных кислот. Добавление сквалена (2% лино-левой кислоты+1% сквалена) несколько снижает (примерно на 10%) накопление сухой массы по сравнению со средой, содержащей только 2% линолевой кислоты.
Однако добавление сквалена в среду инкубации грибка, как видно из рис.20, приводит к увеличению концентрации продуктов липопероксидации в культуре, содержащей сквален по сравнению с культурой, содержащей только линолевую кислоту. Это, безусловно, свидетельствует об окислении сквалена.
Следует отметить, что идентификация продуктов липопероксидации затруднена из-за их высокой реактивности и короткого времени жизни. Поэтому идентификация возможных продуктов липопероксидации сквалена и линолевой кислоты проводилась в среде культивации после инкубации (90 минут) с порошком Р. orbiculare. Методом масс-спектрометрии были идентифицированы 3 геометрических изомера метил линолеат моногидроперекиси (рис. 21). Как было показано ранее [93], изомер 1 представляет собой смесь 9-гидрокси-цис-транс-метил линолеата и 13-гидрокси- цис-транс-метил линолеата, изомер 2 является 9-гидрокси-транс-транс-метил линолеатом, изомер 3 - 13-гидрокси- транс-трансметил линолеатом. Эти гидроперекиси идентичны получаемым in vitro обработки линолеата липоксигеназой. Поэтому наличие этих веществ может рассматриваться как доказательство липоксигеназной активности клеток P. orbiculare.
Липоксигеназная активность P. orbiculare может привести к появлению дикарбоновых кил от как это изображено на гипотетической схеме (рис. 22). Согласно этой схеме, липоксигеназа отрывает стереоспецифически водород из С-11 атома линолевой кислоты в качестве первого шага оксигенации, образуя при этом радикал I, который быстро изомеризуется в радикал II и в присутствии кислорода образует пероксирадикал при С-9 и затем гидроперекись при С-9. Эта гидроперекись может подвергаться дальнейшим превращениям по двум путям, заканчивающимся формированием азелаиновой или пимелиновой дикарбоновых кислот. Превращение в азелаиновую кислоту происходит путём превращения гидроперекиси при С-9 алкокси радикал при С-9 при участии ионов металлов переменной валентности. Этот радикал превращается сначала в азелаино-вый семиальдегид, а затем в азелаиновую кислоту. При превращении в пимели-новую кислоту гидроперекись при С-9 формирует радикал при С-7 путём интрамолекулярного переноса водорода. А затем все превращения осуществляются аналогично схеме реакций, ведущей к формированию азелаиновой кислоты (рис.22). Согласно этой гипотетической схеме для формирования дикарбоновых кислот необходимо присутствие хотя бы в следовых количествах ионов металлов переменной валентности.
Относительно сквалена, следует иметь в виду, что, во-первых, сквален непосредствено не является источником липидов для P. orbiculare, а также, во-вторых, что липоксигеназа не способна окислять иные липиды, чем ненасыщенные жирные кислоты. Как уже говорилось, продуктов окисления сквалена затруднена в силу их высокой реакционной способности и короткого времени жизни. Методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектроскопией были идентифицированы транс, транс фарнезаль (рис.23) и эпоксиды сквалена (изомеры 1-4) (рис.24). Важно отметить, что такие же продукты липопероксидации сквалена образуются при его фотоокислении. Как было показано ранее (табл. 2,3; рис. 12, 13) продукты фотоокисления сквалена обладают парадоксальным действием на клетки эпидермиса кожи, в том числе и на меланоциты. А именно, при малых концентрациях они стимулируют меланогенез, увеличивая число зрелых меланосом внутри меланоцита. Однако при больших концентрациях или длительной инкубации они вызывают нарушение структуры эпидермиса, вакуолизацию и гибель клеток. Возможно, что именно таким парадоксальным влиянием на меланоциты объясняется гипермеланоз на ранних стадиях заболевания разноцветным лишаем и гипомеланоз на более поздних стадиях, обусловленный повреждением меланоцитов липопере-кисями сквалена.
Возникает также вопрос о том, зависит ли окислительная активность клеток самого грибка от состава среды культивации? Для ответа на этот вопрос гистохимическим методом анализировалась активность пероксисом в мицелии гриба. Пероксисомы совершенно не выявлялись при культивировании грибка в средах с добавлением насыщенной пальмитиновой и мононенасыщенной олеиновой кислот. В присутствии диненасыщенной линолевой кислоты в гифах грибка выявляются многочисленные пероксисомы (рис.25). Как известно пероксисомы продуцируют перекись водорода, вполне возможно, что частично эта перекись не разрушается каталазой и выходит из клетки. В присутствии ионов металлов переменной валентности, таких как Fe + , Н2О2 вступает в реакцию Фентона, образуя при этом гидроксильный «радикал-убийцу», который может атаковать и сквален, вызывая его окисление с образованием липоперекисей сквалена, оказывающих значительный физиологический эффект на клетки эпидермиса.
