Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Нормальная микрофлора организма человека 10
1.2. Свойства микробоценоза ротовой полости 17
1.2.1. Ротовая полость как среда обитания микроорганизмов 17
1.2.2. Микроорганизмы ротовой полости человека 18
1.3. Свойства микробоценоза кожи 25
1.3.1. Особенности кожи как среды обитания 25
1.3.2. Микроорганизмы кожи человека 26
1.4. Антимикробная фотодинамическая терапия 32
1.4.1. Механизмы фотоповреждения 34
1.4.2. Внутриклеточные механизмы защиты 37
1.4.3. Вещества, применяемые при фотовоздействии 41
1.4.4. Фотодинамическое воздействие на микроорганизмы 47
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 55
2.1. Объекты исследования 55
2.2. Источники излучения и фотосенсибилизаторы 58
2.3. Постановка эксперимента 62
2.4. Методы статистической обработки результатов 65
Глава 3. ВЛИЯНИЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ НА ОТНОСИТЕЛЬНУЮ ЧИСЛЕННОСТЬ БАКТЕРИЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ 66
Глава 4. ДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ИЗЛУЧЕНИЯ НА БАКТЕРИИ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ. 73
4.1. Действие светодиодного синего (405 нм) излучения на бактерии ротовой полости 73
4.2. Влияние светодиодного красного (660 нм) излучения на бактерии ротовой полости 80
4.3. Чувствительность бактерий ротовой полости к действию лазерного инфракрасного (805 нм) излучения 84
Глава 5. ДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ИЗЛУЧЕНИЯ НА БАКТЕРИИ ИЗ МИКРОБОЦЕНОЗА КОЖИ 90
5.1. Влияние светодиодного комбинированного (405, 625 нм) излучения на бактерии микробоценоза кожи 90
5.2. Чувствительность микроорганизмов кожи к действию светодиодного синего (405 нм) излучения 97
5.3. Действие лазерного инфракрасного (805 нм) излучения на бактерии микробоценоза кожи 101
5.4 Действие лазерного инфракрасного (805 нм) излучения на бактерии микробоценоза кожи 105
Заключение 112
ВЫВОДЫ 122
Список использованных литературных источников 124
- Нормальная микрофлора организма человека
- Действие светодиодного синего (405 нм) излучения на бактерии ротовой полости
- Влияние светодиодного комбинированного (405, 625 нм) излучения на бактерии микробоценоза кожи
Введение к работе
Актуальность исследования. Нормальная микрофлора представляет собой неотъемлемую часть» макроорганизма и играет важную роль в поддержании его гомеостаза (Шендеров, 1994, 1998; Белобородова, 1998; Грачева и др., 2006). Большинство имеющихся в современной литературе работ посвящены детальному изучению микробного сообщества желудочно-кишечного тракта человека и животных в норме и' при различных патологических состояниях (Доронин, Шендеров, 2002; Ильина, 2006). Не менее значимо состояние микрофлоры таких биотопов, как ротовая полость и кожа, индивидуальная и анатомическая специфичность состава микроорганизмов которых способствует обеспечению колонизационной резистентности организма в целом (Митрохин, 1998; Ильин и др., 2005). Разработка методических подходов к оценке адаптационного потенциала бактерий, в том числе и представителей микробоценозов> организма человека, а также выбор параметров и характеристик, наиболее^ полно отражающих состояние отдельных микробных популяций на фоне действия стрессовых факторов различной природы являются актуальными задачами экологии микроорганизмов (Митрохин, 2000; Нетрусов и др., 2004; Shrivastava, 2007).
Изменения в- видовом составе и количественных показателях микробного сообщества под влиянием внешних или внутренних факторов могут привести к нарушению функционирования макроорганизма' (Нетрусов и др., 2004). Для оценки действия стрессовых факторов физической природы (в том числе антропогенного характера) на микроорганизмы современные исследователи оценивают изменение их жизнеспособности: по количеству колониеобразующих единиц - КОЕ, оптической плотности бактериальных суспензий, хемилюминесценции микробных клеток (Фомичев др., 1991; Страховская и др., 2002). В то же время использование традиционных микробиологических методов (описание морфологии клеток и колоний, исследование тинкториальных, культуральных и биохимических свойств)
б .
позволяет быстро^ и объективно оценить in vitro состояние микробных популяций;
В настоящее, время* в клинической практике и биомедицинских исследованиях широко используется, оптическое излучение различного спектрального состава (400; — 420; 600 - 660; 800; - 850' нм); для; лечения гнойно-воспалительных заболеваний; бактериальной природы, а-., также, при физиотерапевтических и косметических! процедурах (Тучин,. 1998; Hamblin, Hasans 2004). Антибактериальная.фотодинамическая терапия (ФДТ) является альтернативой антибиотикотерапии и заключается' в избирательной окислительной деструкции патогенных микроорганизмов при комбинированном; воздействии, красителя? - фотосенсибилизатора и света с определенной! длиной- волны. Контролируемый эффект действия» светового и лазерного излучения может быть использовании для»коррекции^численности определенного* вида; бактерий» в. составе нормальной; микрофлоры при явлениях дисбиоза;. поскольку применение антимикробных препаратов- в таких случаях не допустимо? Однако данные:
Цель и; заданиг исследования. Цель работы заключается в< оценке действия* светодиодного; синего, красного и лазерного инфракрасного излучений в сочетании-; с фотосенсибйлизаторами» на бактерии, представляющие нормальную микрофлору кожи и ротовой полости. Для достижения указанной цели решались следующие задачи::
Г. Определить оптимальные условия* применения
фотосенсибилизаторовї (необходимую концентрацию, время; инкубации и облучения): при фотодинамическом воздействии; на бактерии, представляющиенормальную микрофлору макроорганизма.
2. Изучить влияние светодиодного синего (405 нм), красного (660 нм) и лазерного инфракрасного (810 нм) излучений в сочетании с
7 ... фотодинамическими, красителями? (метиленовым синим,, индоцианином' зеленым) на жизнеспособность, численность популяций; культуральные свойства и морфологические характеристики бактерий ротовой полости.
3; Выявить чувствительность бактерий' микробоценоза кожи при действии светодиодного синего (405 нм), красного (625 нм), комбинированного (405, 625 нм) и лазерного инфракрасного (805 нм) излучений^ в сочетании с фотодинамическими красителями (метиленовым синим, индоцианином зеленым);
4. Отобрать наиболее информативные показатели изменения состояния in vitro популяций, бактерий, представляющих нормальную микрофлору, и характеристики их адаптационного потенциала при фото динамическом воздействии.
Научная новизна. Впервые проведено исследование in vitro}влияния
на бактерищ представляющие нормальную микрофлору организма человека,
лазерного и; светодиодного излучений с параметрами, используемыми при,
ФДТ в медико-биологической практике. Показано: изменение
жизнеспособности, численности популяций; морфологии клеток: и
культуральных свойств, бактерий микробоценоза ротовой полости под
влиянием светодиодного' синего (405 нм), красного (660 нм). и' лазерного
инфракрасного (810 нм) излучений. Исследована чувствительность бактерий
микробоценоза кожи к действию, этих излучений. Выявлены особенности
действия света на: бактериальные: клетки, обработанные
фотосенсибилизаторами; (метиленовым синим и индоцианином зеленым). Впервые разработан комплекс наиболее информативных показателей, позволяющий: объективно оценить in vitro состояние микробных популяций кожи и ротовой*полости на фоне действия.разных типов излучения.
Практическая значимость. Были разработаны и методически обоснованы подходы к изучению влияния различных типов излучения на бактерии — представители нормальной микрофлоры, которые могут быть рекомендованы к применению в практике биологических и медицинских
8
исследований. Определены условия обработки бактериальных клеток
растворами фотосенсибилизаторов: их концентрация и длительность
предварительной инкубации. Выявлены параметры светодиодного и
лазерного излучения, способные привести к увеличению или уменьшению
численности ряда микроорганизмов. Предложен комплекс
микробиологических тестов, позволяющих оценить адаптационный потенциал бактерий нормальной микрофлоры организма при действии различных типов излучения. Результаты исследований могут быть использованы в клинической практике с целью выбора оптимальных режимов излучения при фотодинамической терапии при сочетании обычных косметических процедур с профилактикой гнойно-воспалительных заболеваний. Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций общих и специальных курсов студентам биологического и физического факультетов СГУ; полученные результаты использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами этих факультетов.
Апробация работы. Основные результаты и положения работы представлены на: 2-й региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004); съездах фотобиологов России (Саратов, 2005; Пущино, 2008); 1-й конференции молодых ученых медико-биологической секции ПАГУ (Ульяновск, 2007); 11-й Пущинской школе - конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007); Всероссийских форумах «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006, 2007); международных симпозиумах по оптическим технологиям в биофизике и медицине «Saratov Fall Meeting» (Саратов, 2004 - 2008); научных конференциях студентов и аспирантов биологического факультета СГУ им. Н.Г. Чернышевского (Саратов, 2004 - 2006, 2008).
Декларация личного участия автора. Автор лично участвовал в проведении экспериментов по фотодинамическому воздействию на бактерии из микробоценозов кожи и ротовой полости. Анализ полученных данных, их
9 интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно. В совместных публикациях вклад соискателя составил 70 - 90%. Работа выполнена в рамках гранта CRDF RUB1-570-SA-04 при финансовой поддержке Palomar Medical Technologies, Burlington, USA. Исследования проводились в рамках НИР «Исследование взаимодействия оптического излучения с биологическими тканями и разработка когерентно-оптических и спектральных методов медицинской диагностики и фототерапии» тематического плана научно-исследовательских работ СГУ по заданию Федерального агентства по образованию РФ № 1.4.06
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 3 в изданиях перечня ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 139 страницах, иллюстрирована 19 рисунками и содержит 15 таблиц. Список использованных литературных источников включает 170 наименований, в том числе 90 зарубежных авторов.
Нормальная микрофлора организма человека
Одним из наиболее перспективных и непрерывно развивающихся направлений в рамках микробиологии является экология микроорганизмов. Использование современных методов исследований позволили по-новому взглянуть на взаимоотношения микро- и макроорганизмов.
Современное определение микробиоценоза дано профессором А.И. Нетрусовым: «микробиоценоз (микробное сообщество) представляет собой совокупность видов микроорганизмов, ограничивающих друг друга и-подвергающихся постоянному отбору под влиянием внешних условий, благодаря размножению устойчиво занимающих определенную территорию» (Нетрусов и др., 2004).
В микробиоценозе первостепенными являются кооперативные отношения, когда продукты обмена одних организмов служат субстратами для других. Пути взаимодействия в сообществе обычно разветвлены и опосредованы прямыми и обратными, положительными и отрицательными, трофическими и топическими связями. В результате микробиоценоз выступает как единое целое, способное реагировать на условия окружающей среды (Иванов, 1989; Бабин и др., 1994; Митрохин, 1998; Коротяев, Бабичев, 2002; Нетрусов и др., 2004; Goldmann, 1981).
Микробное сообщество, как и любой другой биоценоз, можно охарактеризовать на основании таких параметров, как видовой состав, сопряженность видов, видовое разнообразие. В составе микробиоценоза различают автохтонную (индигенную) и аллохтонную флору. Автохтонные виды являются для конкретного сообщества типичными, встречаются часто и обильно. Аллохтонные виды для микробиоценоза случайны, по видовому составу могут быть разнообразны, но немногочисленны (Нобл, 1986; Белобородова, 1998; Гусев, Минеева, 2003; Таппоск, 1995).
Все многообразие факторов внешней среды, действующих на микроорганизмы в сообществе, принято разделять на абиотические, биотические и антропогенные (Нетрусов и др., 2004; Таппоск, 1995). К абиотическим факторам относят температуру, рН, влажность, кислородный показатель, действие солнечной радиации и др. В ходе эволюции микроорганизмы, занимающие определенную экологическую- нишу, адаптируются к определенным значениям каждого из факторов, и данные значения становятся для них оптимальными. Реакция организма на изменение любого внешнего фактора может в высокой степени зависеть от того, на каком уровне находятся остальные факторы (Громов, Павленко, 1989; Шендеров, 1998; Нетрусов и др., 2004).
Другая группа факторов отражает все многообразие влияния человека на микробное сообщество. Антропогенные факторы весьма разнородны и включают как непосредственное воздействие человека на количественный и качественный состав микробных сообществ (применение различных видов бактериостатических, бактерицидных и дезинфицирующих веществ, лекарственных препаратов, антимикробной терапии), так и опосредованное (использование ксенобиотиков, полимерных материалов, продуктов промышленного производства и т.п.) (Красильнков, Романовская, 1999; Коротяев, Бабичев, 2002; Гусев, Минеева, 2003; Нетрусов и др., 2004).
Под биотическими факторами понимают взаимодействие микробов с другими живыми организмами внутри и вне сообщества. Внутривидовая конкуренция за питательный субстрат, симбиотические или паразитические отношения с растениями и животными - характерные примеры биотических факторов (Высоцкий, 1993; Нетрусов, Котова, 2006). Если средой обитания микробного сообщества служит макроорганизм, то действие биотических факторов становится определяющим. Режим температуры, влажности, аэрации, поступление питательных веществ, рН будут зависеть от физиологических особенностей организма-хозяина (Митрохин, 1998; Белобородова, 1998; Шендеров, 1998; Нетрусов и др., 2004; Tannock, 1995).
Нормальная микрофлора организма - это совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным видовым составом и занимающих тот или иной биотоп. Нормальная-микрофлора играет важную роль в поддержании гомеостаза организма человека (Шендеров, 1998; Нетрусов и др., 2004). Ряд ученых рассматривают нормальную микрофлору как самостоятельный экстракорпоральный орган с характерным строением и функциями (Митрохин, 1998; Белобородова, 1998; Goldmann, 1981).
Колонизация микроорганизмами различных областей тела человека начинается в момент рождения и продолжается в течение всей жизни. Формирование качественного и количественного состава нормальной микрофлоры регулируется сложными антагонистическими и синергетическими отношениями между отдельными ее представителями в составе биоценоза (Goldmann, 1981).
Микроорганизмы, составляющие нормальную микрофлору, образуют типичную морфологическую структуру — биопленку. Толщина биопленки изменяется в пределах от 0.1 до 0.5 мм. Основу биопленки составляет каркас (матрикс), состоящий из микробных полисахаридов и муцина, который продуцируют клетки макроорганизма. В этом каркасе иммобилизованы микроколонии бактерий-симбионтов, расположенные в несколько слоев (Куваева, Кузнецова, 1993; Шендеров, 1998; Коротяев, Бабичев, 2002; Нетрусов и др., 2004; Costerton et al., 1995).
Действие светодиодного синего (405 нм) излучения на бактерии ротовой полости
Были проведены исследования по изучению влияния некогерентного синего излучения (405 нм) на относительную численность и морфологические характеристики бактерий — представителей микробоценоза ротовой полости. На микроорганизмы воздействовали светодиодным излучением с дозами 3, 24, 54 и 72 Дж/см", что соответствовало экспозициям облучения 1,5, 10 и 15 мин и мощности 23 мВт/см".
При анализе полученных данных было установлено подавление размножения клеток Rothia mucilaginosa на фоне действия синего излучения. При воздействии этого излучения в течение 1 мин снижение числа КОЕ данного вида бактерий происходило на 29.46±1.23%. При последующем облучении в течение 5, 10, 15 мин отмечено сокращение показателя КОЕ через сутки инкубации на 36.71±3.30, 39.08±2.22 и 45.42±0.13% соответственно (рис. 9, А). Микроскопирование препаратов облученных и необлученных бактерий показало, что клетки, подвергнутые воздействию, приобретали правильную форму и окрашивались более ярко. Кремовая пигментация колоний облученных микроорганизмов была более выражена по сравнению с контролем.
Было показано, что изменение времени и дозы синего излучения оказывало сходное действие на размножение бактерий вида R. dentacariosa. После облучения данных микроорганизмов в течение 1 мин сокращение их числа КОЕ через 24 часа инкубации происходило на 19.62±2.14% относительно контроля. Дальнейшее увеличение времени облучения до 15 мин приводило к уменьшению показателя КОЕ R. dentacariosa на 29.53±2.49% (рис. 9, Б). Анализ микропрепаратов окрашенных по Граму бактерий, подвергнутых и не подвергнутых облучению, показал, что палочки приобретали нитевидную форму (табл. 9) и располагались парами и цепочками. Отмечено так же изменение культуральных свойств — S-колонии R. dentacariosa после действия излучения приобретали признаки, характерные для R-типа.
Оценка жизнеспособности вида Curtobacterium albidum после воздействия синего излучения также позволила отметить ее снижение. Угнетающее действие синего излучения носило дозозависимый характер: изменение дозы облучения от 1 до 15 мин приводило к последовательному сокращению числа КОЕ более чем на 63% (рис. 9, В). Изменений в морфологии облученных клеток и их колоний показано не было.
Влияние светодиодного комбинированного (405, 625 нм) излучения на бактерии микробоценоза кожи
Известно, что использование комбинированного синего и красного (405, 625 нм) излучения для лечения угревой сыпи давало положительный результат (Papageorgiou et al., 2000), поэтому на следующем этапе изучали комбинированное влияние красного (625 нм) и синего (405 нм) излучений на относительную численность бактерий - представителей микробоценоза кожи. На микроорганизмы воздействовали светодиодным излучением с дозами 8 и 84 Дж/см", что соответствовало экспозициям облучения 1 и 10 мин и плотности мощности 33 и 31.5 мВт/см". В качестве объекта исследования были выбраны микроорганизмы рода Staphylococcus и P. acnes, как наиболее типичные обитатели кожных покровов. В ходе экспериментов использовали фотосенсибилизатор метиленовый синий в концентрации 0.005%.
Установлено, что светодиодное излучение (625, 405 нм) обусловливало снижение числа КОЕ бактерий вида S. epidermidis MS на 14.78±3.45% по отношению к контролю после 1 мин облучения. Действие света в течение 10 мин приводило к чуть менее выраженному эффекту — уменьшение КОЕ по сравнению с контролем происходило на 8.87±3.24%. Используемая концентрация метиленового синего 0.005% при варьировании времени облучения от 1 до 10 мин определяла снижение КОЕ S. epidermidis MS на 80 - 95% относительно контроля (рис. 14, А). При анализе микропрепаратов бактерий, подвергнутых облучению, было показано, что диаметр клеток S. epidermidis MS был меньше, чем в контрольных образцах (табл. 12).
Наблюдалась частичная инактивация микроорганизмов при влиянии светодиодного излучения (625, 405 нм) на культуру S. hominis. Если после 1 мин облучения подавление размножения данных бактерий происходило на 4.96±2.23%, то после 10 мин воздействия оно составило 35.04±2.89%. Независимо от времени воздействия светодиодного излучения (625, 405 нм) на бактериальные клетки S. hominis, фотосенсибилизированные метиленовым синим, их выживаемость сокращалась на 63.56±3.37% (рис. 14, Б). Существенных изменений в морфологии облученных клеток, их расположении или культуральных свойствах отмечено не было.
Показано, что наиболее выраженный угнетающий фотодинамический эффект светодиодное излучение (625, 405 нм) оказывало на микроорганизмы S. aureus 209 Р. После 1 мин облучения снижение числа КОЕ составляло 38.78±4.03% относительно контроля. Полного подавления роста бактерий данного вида нами отмечено не было, поскольку даже после 10 мин воздействия излучения уменьшение КОЕ происходило только на 27.31±3.85% (рис. 14, В).
Похожие диссертации на Оценка фотодинамического воздействия in vitro на бактерии из микробоценозов ротовой полости и кожи человека
