Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1 Влияние свинца на организм
1.1.1. Свинец как неблагоприятный экологический фактор 10
1.1.2. Поступление, депонирование и выведение свинца в организме человека 11
1.1.3. Механизмы токсичности свинца 14
1.1.4. Особенности влияния свинца на систему кроветворения 17
1.2. Особенности строения и функционирования эритроцитов 23
1.2.1, Особенности структуры эритроцитов 23
1.2.2. Перекисное окисление липидов в эритроцитах 25
1.2.3.Особенности энергетического обмена в эритроцитах 27
Глава II. Материалы и методы исследования 33
2.1. Методы оценки состояния мембран эритроцитов 34
2.1.2. Методы оценки состояния энергетического обмена эритроцитов 38
2.2. Гематологические методы исследования 40
2.3 Статистическая обработка полученных результатов 43
Глава III. Изменение структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов под действием свинца .
3.1 Состояние ПОЛ и антиоксидантной защиты мембран эритроцитов 44
3.2 Изменение липидного состава мембран эритроцитов 50
3.3.Электрофоретическая подвижность эритроцитов при свинцовой интоксикации 55
Глава IV. Особенности энергетического обмена в эритроцитах при свинцовой интоксикации 59
Глава V. Изменение показателей красной крови крыс на фоне свинцовой интоксикации и сочетанного действия свинца и алкоголя 69
Обсуждение результатов собственных
Исследований 85
Выводы 100
Список литературы
- Свинец как неблагоприятный экологический фактор
- Методы оценки состояния мембран эритроцитов
- Состояние ПОЛ и антиоксидантной защиты мембран эритроцитов
- Особенности энергетического обмена в эритроцитах при свинцовой интоксикации
Введение к работе
Актуальность исследования
Современную токсикологическую обстановку в промышленно развитых странах следует расценивать как экологически опасную для здоровья, о чем свидетельствуют многочисленные публикации в отечественной и зарубежной литературе (Нагорный. П.А., 1984, Рейли К., 1985, Базарбаева Ш.Т., Айтбаев Т.Х., 1990, Авцьга А.П. с соавт., 1991,Тактамысова З.С., Кайракбаева Г.М., 1994, Трах-тенберг И.М. с соавт., 1994, Kunimoto М., et al.,1985). ВОЗ называет более 20 млн. соединений, каждое из которых, является потенциальным ядом для биологических объектов, что в полной мере относится и к микроэлементным аномалиям антропологического происхождения (Зербино Д.Д., Поспишило Ю.А., 1990, Егоров Ю.Л., Кириллов В.Ф.,1996). Среди них особый интерес вызывает свинец (РЬ) как приоритетный загрязнитель окружающей среды, ежегодные выбросы которого превышают 400 000 тонн, угрожая здоровью миллионов людей, особенно детей, период полувыведения которого составляет 10-20 лет (Жукова Т.В., 1997, Ланд-риган Ф„ 1991, Тиунов В.А., 1986, Chisholm Y.Y. et al, 1995).
Нагрузка организма свинцом растет с момента рождения до старости (Розанов Б.Г.,1984), причем 94 - 95% от общего количества поступившего металла депонируется в костной ткани, К группе повышенного риска развития свинцового токсикоза относятся дети, так как всасывание этого микроэлемента из пищеварительного тракта в детском возрасте происходит в 3 раза интенсивнее, чем у взрослых. Более того, свинец начинает накапливаться уже в организме плода, так как он легко проникает через плаценту, и поэтому, концентрация свинца в крови новорожденного не отличается от крови матери. Поступление избыточных количеств металла в организм еще в антенатальном периоде повышает риск преждевременных родов и рождения недоношенных детей, а также развития энцефалопатии, нефро-патий и рахитоподобных заболеваний у новорожденных (Ландриган Ф., 1991).
При свинцовом токсикозе поражаются в первую очередь органы кроветворения, нервная система и почки. Классическим клиническим проявлением токсического действия металла является микроцитарная анемия, которая морфологически схожа с железодефицитной, и обусловлена нарушением синтеза гема и глобина. Опасность анемии, вызванной свинцом, находится в прямой корреляционной связи с его уровнем в крови. Второй мишенью воздействия металла на органном уровне является периферическая нервная система, в частности, двигательные пути. Особое беспокойство вызывают сообщения о возможности развития легких психоневрологических нарушений, угнетения функционального состояния ЦНС и отставания в умственном развитии у детей даже при сравнительно низких уровнях экспозиции свинца (Трахтенберг И.М., 1994). Хроническая нефропатия, которая может привести к почечной недостаточности, представляет собой еще одно классическое проявление токсического действия металла, однако она выявляется лишь при длительном времени его воздействия и относительно высоких концентрациях (Landrigan F., 1995).
Хотя необходимость РЬ для протекания физиологических и биохимических процессов в организме доказана рядом исследователей (Fowler В.А, 1978, MahafTey Ph., 1984), механизм его действия, особенно в условиях низких концентраций, изучен и расшифрован в значительно меньшей степени, чем действие других микроэлементов. По существующей концепции (Трахтенберг И.М., 1994) считается, что одним из основных токсических последствий действия тяжелых металлов на системы организма является нарушение метаболических процессов вследствие угнетения активности ряда ферментов и дестабилизации биологических мембран. Так, свинец в большей степени воздействует на клеточные и ми-тохондриальные мембраны (Victory W., Fowler В.А., 1984,), причем интенсивность процесса во многом зависит от дозы введенного металла. В исследованиях на эритроцитах установлено, что он ингибирует микросомальные монооксигеназы (Тиунов В.А., 1986), вызывает агрегацию низкомолекулярных мембранных белков с образованием крупных фрагментов высокомолекулярных протеинов (Apostoli et.al., 1988). В экспериментах на животных показано, что введение свинца приводит к перераспределению отдельных фосфолипидов в мембранах клеток, что сопровождается изменением их функции (Кухта В.К., Шкребнева И.И., 1993). Кроме того, ионы металла связываются сульфгидрильными, фосфатными и карбоксильными группами мембраны, повышая ее жесткость и снижая устойчивость к осмотическому шоку, что в свою очередь, приводит к нарушениям в функциональной активности клеток (Lessler M.A.et. al., 1973).
Таким образом, длительное поступление металла в организм даже в низких концентрациях может привести к срыву систем, ответственных за поддержание гомеостаза организма. Однако в первоначальный период диагностика свинцового отравления практически всегда затруднена и в большинстве случаев истолковывается и лечится неправильно (Эйхлер Ю., 1989).
Более того, следует учитывать, что изолированное влияние свинца на организм чаще всего сочетается с воздействием других химических, физических, биологических и социальных факторов, усугубляющих его токсичность, в частности, все возрастающим потреблением алкоголя (Немцов А.В., 1995, Telimman S., Cvitkovich Р.,2000). Учитывая социальную значимость данного явления с одной стороны и повсеместное загрязнение окружающей среды свинцом, с другой, нельзя исключить возможности модификации этанолом токсическго действия металла, который способен вызывать субклинические эффекты, не обнаруживаемые при обычных медицинских обследованиях
Все вышеизложенное и послужило предпосылкой для проведения настоящей работы.
Цель работы и задачи исследования.
Целью настоящей работы явилось изучение влияния малых доз свинца на функциональное состояние мембран эритроцитов и систему эритрона белых крыс при введении ионов металла в виде ацетата изолированно и при сочетании с этанолом.
Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:
1 .Исследовать интенсивность перекисного окисления липидов и интенсивность фосфолиполиза в мембранах эритроцитов при введении малых доз ацетата свинца в организм.
2.Выявить влияние ионов свинца на особенности энергетического обмена эритроцитов в зависимости от сроков воздействия металла.
3.Сопоставить изменения функционального состояния мембран и энергетического обмена эритроцитов при изолированном введении свинца и при его со-четанном воздействии с алкоголем.
4.Исследовать изменения в системе красной крови как при изолированном действии свинца и спирта, так и при совместном введении.
5.Установить последовательность включения компенсаторно- приспособительных реакций по мере увеличения сроков свинцовой и свинцово-алкогольной интоксикации.
Научная новизна.
В работе показано, что изменения функциональных свойств эритроцитов под действием малых доз свинца по мере увеличения сроков интоксикации носят неоднозначный характер, обусловливая течение как дезадаптивных, так и компенсаторных реакций организма.
Выявлены коррелятивные связи между функциональными изменениями мембраны эритроцитов и морфо-функциональными характеристиками эритроид-ного ростка красного костного мозга и периферической крови.
Установлено, что при совместном присутствии свинца и этанола происходит усиление неблагоприятного воздействия металла на организм, обусловленное суммированием эффектов, производимым каждым из токсикантов в отдельности.
Показано, что одним из компенсаторных реакций, развивающихся в ответ на введение свинца, является активация 2,3-дифосфоглицератного шунта в эритроцитах, повышающая устойчивость организма к возникающей гипоксии.
Установлено, что при совместном введении свинца и спирта происходит более быстрое раздражение красного ростка костного мозга, выражающееся в функциональной перестройке эритропоэза в целом, сокращении времени созревания эритроцитов, снижении среднего содержания гемоглобина в одном эритроците, что в дальнейшем сказывается на более раннем старении макрофага.
Практическая значимость. Предложен способ оценки степени связывания ионов свинца мембраной клетки посредством измерения электрофоретической подвижности эритроцитов (патент № 2199733 от 27.02.03).
Полученные новые данные и сформулированные теоретические положения об особенностях действия свинца в малых дозах, как при изолированном введении, так и в присутствии этанола являются основой для выявления наиболее быстрых и точных способов диагностики сатурнизма с последующим проведением соответствующего лечения.
Материал, представленный в диссертации, может быть рекомендован к использованию при дальнейшей разработке вопросов токсикологии свинца, экологической физиологии и химии биогенных элементов.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались и обсуждались на конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири (Челябинск, 1999), 6-ой Международной конференции *' Молекулярная биология, химия и физика неравновесных систем" (Иваново, 2002), а также на итоговых научных конференциях Ивановской государственной медицинской академии (Иваново J 998,1999,2002,2003). По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
Полученные в ходе работы результаты внедрены в учебный процесс на кафедрах общей, биоорганической и биологической химии, клинической лабораторной диагностики ФДГШО и гигиены с курсом экологии Ивановской государственной медицинской академии.
Свинец как неблагоприятный экологический фактор
Свинец вызывает повышенный интерес как загрязнитель окружающей среды антропотехногенного происхождения, ежегодные выбросы которого превышают 400000 т., угрожая здоровью миллионов людей, особенно детей (Жукова Т.В., 1997, Ландриган Ф., 1991, Тиунов В.А., 1986, Chisholm Y.Y. et al, 1995).
Большая часть территории России подвергается его неблагоприятному действию, превышающему критический порог для нормального функционирования экосистем, составляющий 0,3 мкг/м3 (Иванов В.Н., 1995, Измеров М.Ф., 1998). В нашей стране прогнозируется около 2 млн. детей в возрасте до 7 лет с " увеличениемЬодержания свинца в крови (Баранова А.А., 1995, Демин В.Ф., 1995). В то же время в США число детей в возрасте до 5 лет с повышенной концентрацией свинца в крови (более 15 мкг/дл) при допустимом содержании до 10 мкг/дл еще больше и достигает 3-4 миллионов (Измеров М.Ф., 1998, Розанов Б.Г.,1984).
Значительная опасность повышенного содержания свинца в окружающей среде обусловлена тем, что он может вызывать субклинические токсические эффекты даже при относительно низких концентрациях, которые ранее считались безопасными (Трахтенберг И.М., 1999). В районах, где есть угроза хронического сатурнизма, было вьшвлено повышение удельного веса детей с низким уровнем умственного развития, нарушением зрительного восприятия, отклонениями электроэнцефалограммы (Агаджанян Н. А,1994, Снакин В. В., 1999).
Ранняя диагностика субклинических проявлений свинцовой интоксикации затруднена (Эйхлер Ю., 1989), ввиду того, что свинец, являясь кумулятивным ядом, накапливается в организме и действует на различные органы и ткани в течение длительного времени. Особо следует отметить его токсическое действие на репродуктивную систему, повреждение которой у лабораторных животных даже было положено в качестве критического признака в основу разработки гигиенических стандартов (Семенова Л.С, Павловская Н.А., 1983, Найди С.С., Ганич ММ, 1986), оценивающих популяционную опасность металла. Есть сведения, что его избыточное введение данного металла нарушает женскую и мужскую репродуктивные функции, что приводит к росту числа выкидышей и врожденных заболеваний (Демин В.В., Османов И.М.,1997, Иванов В.Н., 1995). Однако прямое экстраполирование экспериментальных данных на человека затруднено, так как с одной стороны не всегда выявляется достоверное изменение показателей репродуктивной функции (Вылежагина Т.А., Кузнецова Т.Е., 1993), а с другой - маловероятна ранняя оценка последующей репродуктивной способности у человека (Трахтенберг И.М.,1999, Целковиц Л.С, 1998).
Анализ литературных данных показал, что при длительном вдыхании паров свинца отмечается высокий уровень заболеваний сердечно-сосудистой системы, появление и рост злокачественных образований, раннее развитие нейроциркулярной дистонии и артериальной гипертензии (Артамонова В.Г., Плющ О.Г., Шевелев МА.,1998), а также нарушения внутрисердечной и периферической гемодинамики (Гатагонова Т.М.,1995). При этом выраженность данных изменений находится в прямой зависимости от времени и дозы воздействия на организм (Трахтенберг И.М.,1999).
По классификации Красовского Г.И. свинец относится к 2-ой по токсичности группе веществ, поступающих в организм в виде различных соединений пероральным, ингаляционным путем, а также через кожу и слизистые оболочки. В среднем с пищей его поглощается 200-300 мкг/сутки, однако данные пределы могут изменяться в зависимости от возраста, пола, места проживания, а также профессии человека (Грибова И.А., Евлашко Ю.П. и др., 1983, Подунова Л.Д., 1998). Степень поглощения свинца легкими зависит от величины частиц; при этом частицы менее 5 миллимикрон абсорбируются полностью и поступают непосредственно в кровоток (Зербино Д.Д., Поспишило Ю.А., 1990, Зорина Л.А., 1974, ИзмеровМ.Ф., 1998).
При пероральном поступлении, на долю которого приходится около 10% из возможных путей поступления металла (у детей данный показатель может достигать 50%), соединения свинца всасываются в ионизированном виде, чему способствует присутствие хлоридов в желудочном соке и щелочная реакция кишечного сока (Привалова Л.И., Каунельсон Б.А.,1997, Степнов СМ., 1997). При внутривенном введении большая часть металла (95%) связывается с эритроцитами, а около 5 % остается в крови в форме коллоидных частиц, которые впоследствии захватываются ретикуло-эндотелиальной системой (Ершов Ю.Л., Плетнева Т.В., 1989, Соколов В.В., 1988,Соловьев А.Г., Дегтева Г.Н. и др., 1993).Основной участок всасывания - двенадцатиперстная кишка и начальный отдел тонкого кишечника (Ершов Ю.Л., Плетнева Т.В., 1989, Лужников Е.А., 1994, Филова В.А., 1990).
Существенное влияние на развитие эндогенной свинцовой интоксикации может оказать нарушение минерального баланса пиши. Так, проявлению клиники отравления металлом могут способствовать дефицит железа, кальция и фосфора в пище (Андрунайте Р.Е., 1982, Зербино Д.Д., Поспишило Ю.А., 1990), недостаточное содержание цинка, приводящее к усиленному накоплению про-топорфирина в печени и эритроцитах (Millstone Е., Russell J., 1995), а также избыток витамина D (Бауман В.К.,1989, Smith МД983). Известен физиологический антагонизм между свинцом и железом: при пищевом дефиците последнего существенно возрастает риск свинцовой интоксикации (Лужников Е.А.,1982). Однако к этим данным необходимо отнестись критически, так как имеются сведения, наоборот, о синергизме этих двух металлов (Нищий Р.А., Мамырбаев А. А., 1989). Особое значение в токсикологической характеристике металлов, в частности свинца, имеет транспорт клетками крови. (Гольдберг Е.Д.,1989). Наряду с эпителием почек, печени и кишечника, являющимися важнейшими сферами избирательной токсичности всех тяжелых металлов, свинец, как было указано выше, частично проникает в эритроциты, где сорбируется на молекуле гемоглобина, и в то же время, как и другие тяжелые металлы (ртуть, кадмий), может также циркулировать в крови в виде ионов в комплексе с амино- и жирными кислотами (Соколов В.В., 1988, Семенова Л.С, Павловская Н. А., 1983, Pounds G.G., Wright R.,1982). Распределение и депонирование свинца происходит в течение нескольких месяцев практически во всех органах, а накопление в наибольшей концентрации в почках и печени объясняется высоким содержанием в ткани этих органов белков, богатых тиоловыми группами (Сает Ю.Е.,1987).
Вместе с тем, немаловажная роль принадлежит депонированию свинца в костях, которое в значительной мере зависит от функционирования остеокластов и остеобластов. Установлено, в частности, что при концентрации ацетата свинца (II) 6,5-65 мкмоль/л остеокласты быстрее и в больших количествах, чем остеобласты, абсорбируют его ионы, причем этот процесс в значительной мере усиливается паратгормоном (Авцын А.П., Жаворонков А.А., 1991,Трахтенберг И.М.,1994).
Методы оценки состояния мембран эритроцитов
Для оценки липидного состава состояния мембран эритроцитов исполь зовался метод тонкослойной хроматографии на пластинах «Сорбитол», описан ный В.Н.Ростовцевым и Г.И. Резником (1982). Сухой остаток липидов, выде ленных из эритроцитарной массы, растворялся в хлороформ-этаноловой смеси (2:1) из расчета 1 мл смеси на 4,8 мг липидов. Полученный раствор наносился на пластинки «Сорбитол». Хроматофафия проводилась в системе гексан - эфир - ледяная уксусная кислота (80:20:2) на предварительно обработанных этой смесью пластинах адсорбента. Фракции липидов выявлялись с помощью кон центрированного раствора фосфорно-молибденовой кислоты на абсолютном спирте при 37 С в виде синих пятен различной интенсивности, которые иден тифицировались по величине Rf. Относительное содержание липидных фракций проводилось путем подсчета площадей треугольников ( S =ах У2 h ) на лен тографической записи, полученной на денситометре «Биан-170». Для оценки микровязкости липидов мембран эритроцитов определяли коэффициент соот ношения количества холестерина и фосфолипидов.
Показатели функциональной активности красного костного мозга (центральное звено) Непосредственно повреждающее действие свинца, связанное с высоким сродством его ионов к мембранным структурам, биохимическими методами определить достаточно сложно; для этой цели нами использовался метод оценки электрофоретической подвижности клеток, как функции заряда мембраны, характеризующей ее состояние.
Физико-химические методы определения свойств биологических систем позволяют изучать процессы в клетках без нарушения их жизненно важных структур. Несомненный интерес в этом отношении представляет электрофоре-тическая подвижность (ЭФП), изменяющаяся под действием различных факторов, в частности, адсорбции поверхностью клетки ионов металлов, в связи с чем, сдвиги в ее значениях позволяют определять морфологические, биохимические и другие изменения на самых ранних стадиях (Аталлуханов Ф.И., Вит-вицкий В.М., 1993).
Если заряженную частицу подвергнуть действию внешнего электрического поля, она будет двигаться к противоположному по знаку электроду с определенной скоростью и амплитудой колебания, обусловленной зарядом поверхности клетки. При деструктивных процессах, происходящих как внутри, так и на поверхности клетки, в первую очередь изменяется ее заряд, что сразу же приводит к снижению электрофоретической подвижности.
В качестве камеры для электрофореза применялась сконструированная на основе камеры Горяева система с впаянными платиновыми электродами. Проведение измерений электрофоретической подвижности проводилось по методу Смирнова СТ., Голубева О.А., 1965) в нашей модификации (патент № 2199733 от 27.02.03). Для исключения участия примесей перед началом исследований камера промывалась дистиллированной водой и рабочим раствором глюкозы (5%), а затем заполнялась подготовленной, как указано выше, взвесью эритроцитов в 5% растворе глюкозы. Измерения проводились методом относительного смещения - на электроды камеры подавался ток от генератора низких частот (0,1 - 1 Гц); при этом каждая клетка перемещалась параллельно оси измерения окуляра пропорционально заданной частоте с амплитудой, определяемой собственным зарядом. Для каждого образца выполнялись измерения электрофоре-тической подвижности 100 клеток, по результатам которых вычислялись средние показатели. В эксперименте использовалась как взвесь эритроцитов животных, получавших раствор свинца в течение 1 месяца, так и взвесь эритроцитов интактных животных. Для оценки непосредственного действия ионов металла на мембранные структуры клеток красной крови также было проведено определение степени адсорбции ионов металла посредством внесения взвеси эритроцитов в рабочий раствор глюкозы в присутствии ионов свинца заданной концентрации (опыты in vitro). По окончании измерений для каждой пробы проводился расчет (в процентах) клеток с наибольшей амплитудой колебания, по результатам которых была выведена зависимость между уровнем воздействия свинца и изменением ЭФП.
Интенсивность ПОЛ в мембранах эритроцитов определялась по содержанию малонового диалъдегида (МДА) методом Yagi К.(1976), основанном на образовании комплексного соединения МДА с 2-тиобарбитуровой кислотой, интенсивность окраски которого определялась спектрофотометрически при длине волны 532 нм. Состояние антиоксидантной системы оценивалось по определению: суммарной антиокислительной активности мембран эритроцитов (A.L Timiti, D.L.,Dormandy T.U.,1977 в модификации МЛІ. Промыслова, Д.Л.Демчук,1990) по определению разницы МДА до и после инкубации в присутствии ионов Fe + и линолевой кислоты; активности супероксиддисмутазы (СОД) в мембранах эритроцитов по методу С. Чевари, (1991), основанному на способности СОД конкуриро t вать с нитросиним тетразолием за супероксидные анионы, образующиеся в результате взаимодействия восстановленной формы НАД и феназинме-тасульфата. Активность выражалась в % торможения реакции, которая рассчитывалась по калибровочной кривой; активности каталазы, определяемой по методу АеЫ Н. (1970), принцип которого, основан на способности фермента разрушать в нейтральной среде перекись водорода до молекулярного кислорода и воды. Убыль со держания Н202 измерялась спектрофотометрически при длине волны 240 нм. Активность фермента выражалась в единицах активности на 1 мг гемоглобина в секунду. Для анализа механизмов наблюдаемых изменений в эритроцитах также исследовались: активность фосфолипазы А? по методу Безруковой Г.А. и Рубина В.ЩІ989), концентрация внутриэритроцитарного кальция с помощью набора реактивов Cormay caIcium-240 фирмы "Cormay" (Польша).
Для оценки состояния энергетического обмена в эритроцитах определялось содержание компонентов адениловой системы, 2,3-дифосфоглицерата, молочной кислоты и активность транспортных Na+, К+ и Са2+ - зависимых АТФаз.
Для количественной оценки содержания компонентов адениловой системы был использован метод тонкослойной хроматографии на пластинах «Silu-fol -UV-254» (Захарова Н.Б., Рубин В.И.,1980). После предварительного трех 39
кратного отмывания эритроцитов физиологическим раствором к полученному осадку добавлялось эквивалентное количество 5% ТХУ для осаждения белков с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин при О С. Надосадочная жидкость использовалась для нанесения на пластины «Silu-fol -UV-254». Сорбционно-динамическое разделение смеси нуклеотидов проводилось в плотно закрытой камере, куда предварительно помещался растворитель слоем 1,5 см, состоящий из пропанола, аммиака и воды в соотношении 6:3:1 по объему соответственно. Пластины с содержащимися в поверхностном слое компонентами аден иловой системы высушивались и с использованием УФ лампы определялись места расположения аденилатов, которые впоследствии элюировались раствором ТХУ. Количественное определение АТФ, АДФ, АМФ проводилось спектрофотометрически, учитывая, что аденин и его производные в разбавленной соляной кислоте имеют максимум поглощения при 257 нм.
Состояние ПОЛ и антиоксидантной защиты мембран эритроцитов
Интенсификация процессов ПОЛ является одним из механизмов, приводящих к повреждению клеточных мембран. Хотя на ранних стадиях она носит в определенной степени адаптивный характер, умеренно увеличивая проницаемость мембран и облегчая функционирование мембранных белков, при нерегулируемом усилении этот процесс приобретает патологическую направленность (Франк Е.М., 1970, Сиевекиц А.Р., 1980). К механизмам повреждающего действия продуктов ПОЛ можно отнести изменение липидного микроокружения мембраносвязанных ферментов, рецепторов, каналов ионной проводимости, а также открытие новых каналов для ионов Са2+» способствующих его накоплению в клетке. Помимо этого, продукты распада фосфолипидов вступают во взаимодействие со свободными аминогруппами мембранных белков и ферментов, инактивируя их с образованием поперечных сшивок, так называемых шиффовых оснований - биологически инертных соединений, с накоплением которых происходят деструктивные изменения в клетках (Арчаков А.Ю., Владимиров Ю.А., 1972, Калмыкова В.Н., 1981).
В связи с вышесказанным для оценки влияния малых доз свинца на структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов нами было проведено определение содержания малонового диалъдегида и исследование состояния антиоксидантной системы.
Необходимо отметить, что на повышение интенсивности процессов ПОЛ при свинцовой интоксикации указывал еще Макашев К.К. в 1976 г., выявивший одновременно и угнетающее влияние металла на тканевое дыхание. По его мнению, в условиях гипоксии, сопровождающей свинцовую интоксикацию ферментативный липолиз фосфолипидов идет не до конца, способствуя накоплению продуктов ПОЛ.
В группе животных, подвергнутых комплексному воздействию свинца и этанола, динамика изменений концентрации МДА была несколько иной (таблица 1). Через 1 мес. от начала эксперимента она повысилась лишь в незначительной степени и составила 0,77+0,04 ммоль/мл (116%), однако к концу второго месяца эксперимента в отличие от группы животных, которым вводился только свинец, содержание МДА продолжало нарастать и значительно превысило исходный уровень еще в большей степени - 0,92+0,22 мкмоль/мл (139 %). Как известно, в поддержании интенсивности ПОЛ на определенном уровне важная роль принадлежит антиоксидантной системе (АОС), которая обеспечивает "тушение" активных форм кислорода, связывание и модификацию свободных радикалов, предупреждение образования и разложения перекисей, защиту от окисления функциональных групп белков (Козлов А.В., Вдовин А.В., 1984). Она включает в себя природные антиоксиданты и ферменты, встроенные в структуру мембраны, функции которых заключаются в уменьшении доступа кислорода к липидам (Бурлакова Е.Б.,1982). В соответствии с этим, немаловажная роль в поддержании нормальной функциональной активности принадлежит балансу ПО Л-АОС.
Определение общей антиоксидантной активности выявило существенное ее снижение в эритроцитах обеих групп исследуемых животных. Так, через 1 мес. от начала введения свинца она уменьшилась с 68,13±0,77% до 61,89±1,38% (р 0,05), а при продолжении эксперимента, к концу второго месяца составила 64,24±2,37% (таблица 2). В группе животных, подвергнутых комбинированному воздействию свинца и этанола общая антиоксидантная активность также уменьшилась (табл.2) по сравнению с интактными животными: через 1 мес. она составила — 63,58 ± 1,38%, а через 2 мес. - 62,50 ± 0,21%.
При исследовании активности одного из основных ферментов АОС — су-пероксиддисмутазы (СОД), стимулирующего дисмутацию свободных радикалов кислорода до перекиси водорода и молекулярного кислорода, было выявлено, что процент блокирования восстановления НСТ супероксиддисмутазой мембран эритроцитов снижен почти в 1,5 раза (до 35,45±2,37% и 30,76±1,18% в конце 1-го и 2-го месяца соответственно по сравнению 51,36±4,13% у интакт-ных животных, р 0,05), что свидетельствует о нарушении антиокислительной защиты на стадии генерации активных форм кислорода. Подобные изменения активности СОД в эритроцитах были отмечены нами и при сочетанном воздействии свинца и этанола, однако, выраженные в меньшей степени (рис.4). РисАУровень перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в группах экспериментальных животных.
Можно полагать, что выраженное снижение активности этого фермента обусловлено непосредственным действием свинца, способного вытеснять ионы цинка из различных белков, а следовательно, и из активного центра СОД, яв-ляющейся Zn - содержащим ферментом (Авцын А.П.,1991).
В результате низкой активности СОД в мембранах эритроцитов животных, подвергнутых свинцовой интоксикации, появляется избыточное количество супероксидных анионов, действие которых усиливается в результате инициирования цепной реакции образования свободных радикалов. Их накопление приводит к серьезным нарушениям в клетках вследствие повреждения и инактивации ферментов и окисления SH-групп белков (Bannester S.V., Allen Н., Hell 0.,1982,FridovichJ.,973).
По-видимому, нарушением дисмутации свободных радикалов до перекиси водорода можно объяснить и тот факт, что при определении активности ка-талазы, расщепляющей образующиеся в ходе пероксидации избыточные количества пероксида, не было обнаружено ее повышения, а даже наоборот, через 1 месяц после начала эксперимента в группе животных, подвергнутых изолированному действию свинца она была несколько снижена (10,07± 0,33 усл. ед/л, р 0,05), однако через 2 месяца активность фермента практически не отличалась от уровня контрольных животных (12,93±0,32 усл.едУл против 12,22±0,57 усл.едУл соответственно, р 0,05) (таблица 2). При совместном действии свинца и этанола активность каталазы также оставалась практически без изменений, хотя и имелась тенденция к снижению: 12,12 0,46 и 11,28±0,85 усл.едУл через 1 и 2 месяца эксперимента соответственно (р 0,05). Нельзя, однако, отрицать возможности нарушения биосинтеза фермента, так как каталаза является гем-содержащим энзимом, а образование гема, как известно, ингибируется даже малыми дозами свинца (Трахтенберг И.М.,1994).
Анализируя причины снижения антиоксидантной защиты, можно предположить, что наблюдаемые изменения обусловлены также и уменьшением активности Se-содержащей глутатион-пероксидазы, являющейся, как известно ферментативным антиоксидантом, расщепляющим образовавшиеся перекисные соединения. Подобное предположение основано на данных Fowler В.А.(1978) и Mahaffey Ph.(1984) о связывании свинцом SH-rpynn глутатиона и, как следствие, уменьшении содержания его восстановленных форм.
Таким образом, можно полагать, что механизмы действия свинца на мембрану эритроцитов, как при изолированном введении, так в комбинации с этанолом идентичны и заключаются в индуцировании свободных радикалов, вызывающих стимуляцию перекисного окисления липидов. В свою очередь усиление процессов пероксидации не может не отразиться на содержании компонентов, входящих в состав билипидного слоя эритроцитарных мембран, в частности, количестве фосфолипидов.
Особенности энергетического обмена в эритроцитах при свинцовой интоксикации
Ключевое положение в энергетическом обмене, протекающем в клетках, занимают адениловые нуклеотиды. Так, необходимый уровень АТФ обеспечивает поддержание формы эритроцитов, необходимую скорость переноса катионов через эритроцитарную мембрану, а также выполнение их специфической роли — транспорта кислорода и освобождения его в тканях, что, в свою очередь, связано с их функциональной полноценностью в кровотоке в течение всей жизни (Федоров Н.А., 1976).
Дефицит АТФ является одной из причин, приводящей к повышенной деструкции эритроцитов и играет решающую роль в патогенезе ускоренного гемолиза (Щукина М.Я.,1986).
Как известно, концентрация АТФ в клетках зависит от соотношения энергопродуцирующих и энергопотребляющих процессов (Андросов К.М., 1986, Ефименко А.М., 1980). Центральное место в образовании энергии в эритроцитах принадлежит гликолизу, в ходе которого с участием ферментных систем клетки, происходит анаэробное расщепление 89-97% потребляемой глюкозы (Muiphy Y.R.,1960, Deuticke B.,et al.,1980). При этом образуется две молекулы лактата и продуцируется две молекулы АТФ на каждую молекулу субстрата.
Существенной особенностью гликолиза в эритроцитах является образование больших количеств по сравнению с другими промежуточными продуктами 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ). Он образуется из 1,3-дифосфоглицерата под влиянием фосфоглицератмутазы и участвует в осуществлении 2,3-ДФГ-шунта, обходящего один из участков синтеза АТФ - фосфоглицераткиназную реакцию. Прохождение глюкозы по этому пути приводит также к образованию двух молекул лактата на каждую потребленную молекулу глюкозы, однако в конечном итоге образуется лишь одна молекула АТФ в результате пируватки назной реакции, а свободная энергия, обусловленная наличием высокоэнергетического фосфата в молекуле 2,3-дифосфоглицерата, рассеивается в виде теплоты (Гольдберг Е.Д.,1987).
Наряду с этим в энергетическом метаболизме эритроцитов существенное место занимает аденилаткиназная реакция: 2АДФ = АТФ+ АМФ, так как активность эритроцитарнои аденилаткиназы по сравнению с другими клетками достаточно высока (ВеретенниковаГ.И.,1997).
Затраты энергии в эритроцитах обусловлены, главным образом, транспортом ионов через эритроцитарнуго мембрану и функционированием Na+,K -зависимой- и Ca2+,Mg2+-3aBHCHMO& АТФ-аз, локализованных в мембране эрит 61
роцитов. Интенсивность потребления АТФ при транспорте ионов Na+ и К+ со-ставляет 20-30% от скорости воспроизводства АТФ, а при переносе ионов Са - около 1% (Гаврилов O.K.,1985). При этом необходимо подчеркнуть, что Mg2+-зависимая АТФ-аза тесно связана с фибриллярными белками мембраны, ответственными за поддержание формы эритроцитов (Новицкая В.П.,1995,Сорокина Н.С.,1996).
В литературе имеется достаточное количество сведений о нарушениях метаболизма эритроцитов, обусловленных изменением скорости гликолиза и уменьшением выработки АТФ. В частности, показано, что уровень АТФ изменяется при гипоксии, а также при воздействии ряда таких неблагоприятных факторов, как введение химических веществ или ряда лекарственных препаратов (Юшкова Л.А.,1990).
В связи со всем вышеизложенным для характеристики особенностей метаболизма эритроцитов при свинцовой и смешанной свинцово-алкогольной интоксикации мы прежде всего провели определение содержания адениловых нуклеотидов.
Как показали проведенные исследования (табл.5), в эритроцитах животных, получавших свинец в течение одного месяца, содержание адениловых нуклеотидов изменялось незначительно: концентрация АТФ снизилась на 14% по сравнению с интактными животными (0,169±0,012 против 0,196±0,01б мкмоль/мл соответственно, р 0,05) при практически неизменном содержании АДФ (0,140±0,018 и 0,150i0,005 мкмолъ/мл) и АМФ (0,135±0,029 и 0,138± 0,012 мкмоль/мл).
Анализируя причины наблюдаемых изменений, можно полагать, что снижение концентрации АТФ могло быть результатом, прежде всего, понижения интенсивности анаэробного гликолиза из-за недостаточной активности гликолитических ферментов, в частности, пируваткиназы.
Однако при определении количества молочной кислоты, как результирующего показателя интенсивности протекания процесса в целом, наблюдалось увеличение ее содержания в экспериментальной группе крыс до 111% относительно группы интактных животных (0,693±0,037 против 0,622+0,066 мкмоль/мл соответственно), что не позволило подтвердить высказанное предположение об угнетении гликолиза под действием малых доз свинца.
И действительно, определение содержания 2,3-дифосфоглицерата в эритроцитах животных, подвергнутых воздействию свинца, выявило его существенное повышение (табл.5). Объяснить это увеличение нам представляется возможным, исходя из данных Freedman J.C., Novak I. S. (1983), показавших, что при возрастании количества лактата развивающийся метаболический ацидоз способствует активации 2,3-ДФГ шунта.
Наблюдаемые изменения содержания 2,3-ДФГ могут рассматриваться как компенсаторные, так как известно, что он понижает сродство гемоглобина к кислороду и оказывает положительное влияние на его доставку к тканям, улучшая их оксигенацию. Увеличение содержания 2,3-ДФГ сдвигает кривую диссоциации оксигемоглобина вправо. Данный механизм не вызывает значительных энергозатрат и изменяет лишь функциональные свойства гемоглобина. Поэтому мы можем рассматривать активацию 2,3-ДФГ шунта как важную адаптационную реакцию, развивающуюся в ответ на гипоксию в условиях свинцовой интоксикации.
Наряду с этим нельзя отрицать, что в поддержании достаточно высокого уровня АТФ при введении малых доз свинца, в свою очередь может играть определенную роль и активация аденилаткиназной реакции, в результате которой из 2-х молекул АДФ образуется по одной молекуле АТФ и АМФ. Подобное предположение представляется обоснованным, исходя из достаточно высокого уровня АДФ в эритроцитах, способствующего активации аденилаткиназы, а также практически не измененного содержания аденозин монофосфата.
Полученные результаты определения адениловых нуклеотидов нашли свое отражение при расчете величины аденилатного энергетического заряда, который выявил его понижение по сравнению с эритроцитами интактных животных (0,53 и 0,56 соответственно). Это свидетельствует о сохранении определенной интенсивности энергосинтезирующих процессов, однако явно недостаточных, что подтверждается снижением содержания АТФ.
Несколько иная направленность изменений энергетического обмена была выявлена в эритроцитах животных, подвергнутых в течение месяца сочетанно-му воздействию свинца и этанола.
Вполне очевидно, что одной из первых систем, чутко реагирующих на действие алкоголя и обеспечивающих компенсаторный ответ на развивающуюся при этом гипоксию, является система эритрона. Патогенез действия спирта сложен и является совокупностью различных изменений. В основе его многочисленных проявлений лежат нарушения обмена практически всех соединений: углеводов, белков, липидов, микроэлементов, а также гипоксия, гормональные сдвиги, изменения структуры биологических мембран, накопление биогенных аминов и другие биохимические нарушения (Викулин СВ., 1989, Гладилов В.В.,1981).В литературе имеется достаточно данных о влиянии этанола на гематологические показатели. Так, было выявлено сокращение продолжительности жизни эритроцитов у крыс при хронической алкогольной интоксикации (Быкова И.А.,1993, Дегтева Г.Н.,1987, Колпаков А.Ф., 1993, Соловьев АГ.,1993); повышение интенсивности разрушения красных клеток крови при действии спирта в различных концентрациях вплоть до развития гемолитических кризов (Немцов А.В. 1996, Строжак С.А.,1984).
