Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. некоторые вопросы применения динамической межфазной тензиометрии для исследования биологических жидкостей 10
1.1. Поверхностное натяжение жидкостей. Теория вопроса и методы изучения 10
1.2. Влияние химических соединений и факторов среды на поверхностное натяжение жидкостей 13
1.3. Липосомы как модели для исследования биологических систем 18
1.4. Поверхностное натяжение биологических жидкостей людей при разном физиологическом состоянии 21
Собственные исследования 29
2. Материалы и методы 29
2.1. Метод максимального давления в пузырьке 31
2.2. Метод висящей капли 35
2.3. Анализ тензиограмм 37
2.4. Расчёт и определение достоверности коэффициента корреляции 43
3. Результаты собственных исследований 45
3.1. Модификация методики определения динамического поверхностного натяжения сыворотки крови животных 45
3.2. Показатели динамического поверхностного натяжения крови у лошадей 50
3.2.1. Становление показателей динамического поверхностного натяжения крови у лошадей в разные сроки постнатального онтогенеза 51
3.2.2. Становление показателей динамического
поверхностного натяжения у лошадей в зависимости от пола 53
3.3. Становление биохимических показателей поверхностного натяжения крови у лошадей в разные сроки постнатального онтогенеза в зависимости от возраста и пола 55
3.4. Корреляционные взаимодействия между отдельными биохимическими показателями и данными межфазной тензиометрии у лошадей в разные сроки постнатального онтогенеза и пола 59
3.5. Особенности становления показателей динамического поверхностного натяжения и его зависимость от количественного и качественного состава крови у лошадей и крупного рогатого скота с возрастом 69
3.6. Показатели тензиометрии систем, моделирующих сыворотку крови животных 75
3.6.1. Поверхностное натяжение модельных систем на основе липидных везикул 75
3.6.2. Поверхностное натяжение модельных систем на основе липид-белок-солевых смесей 82
3.6.3. Поверхностное натяжение модельных систем на основе ферментов и их комплексов с полимерами 100
3.7. Показатели тензиометрии и биохимического анализа крови животных разного вида 107
4. Выводы
5. Сведения о практическом использовании и рекомендации по использованию результатов исследований 112
6. Библиографический список 113
7. Приложения 125
- Поверхностное натяжение жидкостей. Теория вопроса и методы изучения
- Метод максимального давления в пузырьке
- Модификация методики определения динамического поверхностного натяжения сыворотки крови животных
- Корреляционные взаимодействия между отдельными биохимическими показателями и данными межфазной тензиометрии у лошадей в разные сроки постнатального онтогенеза и пола
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время всё более очевидной становится значимость определения физиолого-биохимического статуса животного при определении процессов развития и жизнедеятельности его органов, тканей, систем и организма в целом. Физиолого-биохимический статус животного определяется складывающимися на определённый период концентрациями липидов, белков и других биологически активных соединений (БАС) в крови, в тканях и органах. Эти вещества, обладают поверхностно-активными свойствами, т.е. способны адсорбироваться на жидких границах раздела фаз и изменять динамическое поверхностное натяжение (ДПН) плазмы крови. Многие физиолого-биохимические процессы происходят на границе раздела фаз с участием поверхностно-активных соединений (ПАВ): связывание кислорода и выделение диоксида углерода, стадии адсорбции и десорбции липидов и белков на межфазной поверхности, функционирование ферментных систем дыхательной цепи митохондрий и др. [Измайлова В.Н. и др. 1988; Казаков В.Н., Файнерман В.Б, Миллер Р., 1995; Лысов В.Ф., 1996; Зайцев С.Ю., 2006; Максимов В.И., Григорьев B.C., 2007].
Вот почему исследование ДПН, то есть поверхностного натяжения при разных временах существования поверхности, биологических жидкостей организма является важным и актуальным.
Изучение ДПН биологических жидкостей, в частности плазмы крови, зависимость ДПН от качественного и количественного состава крови осуществляется главным образом у человека [Казаков В.Н. и др., 1997; 2003]. Однако до начала наших работ, не было сведений об особенностях ДПН плазмы крови, зависимости его от количественного и качественного состава крови у животных. В области животноводства, практической ветеринарии и зоотехнии изучение изменения ДПН в зависимости от физиологического состояния животного и химического состава биологических жидкостей, может дать ценную уникальную информацию для ранней оценки физиолого-биохимического статуса организма и диагностики его нарушения, т.е. болезней. В связи с этим вполне очевидна актуальность и целесообразность исследований ДПН плазмы крови у животных, зависимости его от количественного и качественного состава биологически активных соединений в крови.
Цель работы - разработка методологических основ определения динамического поверхностного натяжения крови животных, модельных систем, выявление физиолого-биохимических особенностей динамического поверхностного натяжения крови, зависимости его от биохимических показателей крови у лошадей в разные сроки постнатального онтогенеза.
Исходя из этой цели, были поставлены задачи:
1. Усовершенствовать методику определения динамического поверхностного натяжения сыворотки крови применительно к животным.
2. Изучить становление показателей динамического поверхностного натяжения сыворотки крови у лошадей в разные сроки постнатального онтогенеза.
3. Исследовать содержание: альбуминов, общего белка, триглицеридов, холестерина, мочевины, глюкозы, кальция, калия, натрия, хлоридов в крови у лошадей в разные сроки постнатального онтогенеза.
4. Определить корреляцию динамического поверхностного натяжения с биохимическими показателями в крови у лошадей в разные сроки постнатального онтогенеза.
5. Провести сравнительную оценку динамического поверхностного натяжения, зависимости его от количественного и качественного состава крови у лошадей и крупного рогатого скота в постнатальном онтогенезе.
6. Определить динамическое поверхностное натяжение систем, моделирующих сыворотку крови животных. Научная новизна работы состоит в том, что впервые разработаны методологические основы определения ДПН сыворотки крови здоровых животных: определены средние значения ДПН и углы наклона тензиограмм; показано, что для сыворотки крови лошадей значения ДПН изменяются в зависимости от возраста, а углы наклона тензиограмм в зависимости от пола; что значения ДПН коррелируют с уровнем общего белка, альбуминов, калия, триглицеридов в крови; выявлено, что индивидуальные растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрациях, близких к сыворотке крови вызывают значительное понижение ДПН, добавление лецитина усиливает это понижение, а добавление натрия хлорида уменьшает; что в трехкомпонентных смесях БСА, лецитина и натрия хлорида в концентрациях близких к сыворотке крови на ДПН в области коротких времен (0,01-1 с) основное влияние оказывает концентрация соли, а в области больших времен (10-100 с) - концентрация белка и липида.
Теоретическая и практическая значимость. Выполненное исследование содержит решение важной теоретической и практической проблемы - оценки физиолого-биохимического статуса животных по параметрам ДПН плазмы крови, зависимости ДПН как от качественного и количественного состава крови животных в разные сроки постнатального онтогенеза, так и от физиологического состояния животного. Установленные средние значения ДПН и углы наклона тензиограмм для здоровых животных разного вида, пола и возраста, влияние отдельных компонентов крови и их корреляция со значениями ДПН отражают физиолого-биохимический статус организма. Полученные результаты ДПН крови животных перспективны для использования в ранней экспресс-оценке физиолого-биохимического статуса животных и экспресс-диагностике нарушений физиологического состояния (болезней) животных, в том числе в полевых условиях, контроля за лечением. Значительные фундаментальные результаты получены для модельных белок-липид-солевых систем. Основные положения диссертации используются в учебном процессе, в преподавании физиологии и биохимии студентам по специальностям "Ветеринария", "Зоотехния" и "Биохимия" в ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины». Получено положительное решение формальной экспертизы по заявке на патент РФ№028499 от 24.08.07 (приоритет от 11.07.07 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Значения динамического поверхностного натяжения сыворотки крови животных коррелируют с количественными и качественными изменениями состава биологически активных соединений в крови.
2. Для каждого срока постнатального онтогенеза для сыворотки крови лошадей свойственны определённые значения ДПН и углы наклона тензиограмм, что перспективно использовать как стандартные показатели физиолого-биохимических норм для кобыл и жеребцов определённых возрастных групп.
3. Значения динамического поверхностного натяжения липид-белок-солевых систем являются адекватной моделью ДПН плазмы крови животных.
Поверхностное натяжение жидкостей. Теория вопроса и методы изучения
Поверхностно-активные вещества (ПАВ) - органические вещества различного химического строения, адсорбирующиеся на поверхности твёрдых и жидких тел, объединяемые по ряду специфических свойств. ПАВ понижают поверхностное натяжение на поверхности раздела фаз, способствуют растворению в воде веществ, в обычных условиях в ней нерастворимых, «солюбилизируют» белки мембран и т.д. [1-4].
ПАВ находят широкое применение в разных сферах жизни человека (моющие средства, смачиватели, пенообразователи, диспергаторы, эмульгаторы, гидрофобизаторы и др.) применяются в промышленности (обработка и крашение волокон и тканей, флотация руд, добыча нефти, металлообработка, производство полимеров, лаков, красок, химических волокон, кожи, кинофотоматериалов, органических красителей, парфюмерии и косметики), сельском хозяйстве (приготовление эмульсий и суспензий для защиты растений от вредителей), в санитарии (стерилизующие средства), в пожарной технике (образование пен), в домашнем быту (синтетические моющие средства), на транспорте, в коммунальном хозяйстве и т.д.[1-4,6,11].
Молекулы большинства ПАВ состоят из двух основных частей: длинноцепочечного (гидрофобного) углеводородного радикала и гидрофильной группы [2,3].
ПАВ находят поверхность раздела между жидкостью и газом или двумя жидкостями благодаря двойственной природе молекул: содержанию гидрофильных групп, которые образуют водородные связи с молекулами воды, и гидрофобных радикалов, образующих «липидную фазу». Эта двойственность и объясняет особенности поведения молекул поверхностно-активных веществ. Гидрофобный радикал обусловливает поверхностную активность ПАВ, препятствует его растворению в воде, а гидрофильная группа способствует распределению частиц ПАВ в водной фазе [2,4,26].
При наличии двух фаз силы полярного взаимодействия молекул воды выталкивают гидрофобную часть из водной фазы и в результате молекулы ПАВ занимают энергетически наиболее выгодное положение на границе раздела фаз. Вследствие «выталкивания» гидрофобной и «притягивания» гидрофильной частей молекул ПАВ образуются межфазные адсорбционные слои, что снижает поверхностное натяжение биологической жидкости. Это считается одним из основных механизмов действия ПАВ, обеспечивающим жизнеспособность биологических систем [2,4].
На уровне биологической организации мембранных систем поверхностно-активные свойства липидов, липопротеидов, мембранных белков обеспечиваются мембранными межмолекулярными взаимосвязями, обусловленными гидрофобными силами [11,46].
По физико-химическим свойствам биоорганические ПАВ как правило относятся к соединениям неионогенного действия. Их эффекты определяются структурой и концентрацией в биологических жидкостях. Поверхностная активность молекул биоорганических ПАВ обусловлена наличием полярных гидрофильных групп: гидроксильные (-ОН), карбоксильные (-СООН), остатки фосфорной кислоты (у фосфолипидов) и неполярной гидрофобной части: стероидная структура и углеводородные радикалы жирных кислот (у фосфолипидов) [2,12].
Некоторые из физиологических эффектов биологически-активных соединений (липидов, белков, полипептидов) обусловлены их высокой способностью к межмолекулярному взаимодействию.
Количественной мерой способности ПАВ понижать поверхностное натяжение на границе раздела фаз служит величина производной —da/dc, которую называют поверхностной активностью. Поверхностная активность зависит главным образом от химической структуры веществ: природы полярной и строения неполярной частей молекул ПАВ. В честь Гиббса её обозначают G и выражают в единицах СИ (Дж м/моль или Н-м /моль). G=- da/dc.
Физический смысл производной - da/dc можно представить как понижение поверхностного натяжения раствора при изменении концентрации ПАВ на единицу [3]. Чрезвычайно важное значение величины —do/dc состоит в том, что она пропорциональна адсорбционной способности вещества.
Известны десятки методов изучения поверхностного натяжения, которые основаны на прямом измерении капиллярных сил, действующих на искривлённые или плоские поверхности (метод Дю-Нуи, Вильгельми, Легмюра, капиллярного поднятия, статической и динамической капли и др.), анализе формы жидкой поверхности (методы осцилирующей и суживающейся струи, формы капли или пузырька и др.) или разности давлений над искривлённой поверхностью (метод максимального давления в пузырьке, растущей капли и т.д.) [2-4,19,66].
Метод максимального давления в пузырьке
Принцип работы тензиометра ВРА-1Р (Maximum Bubble Pressure Tensiometer) (ФРГ, Sinterface Technologies) основан на методе максимального давления в пузырьке, который был разработан одним из первых, но является до сих пор наиболее удобным для исследования биологических систем.
Воздух от компрессора поступает в капилляр, который опущен в исследуемую жидкость. С помощью электрического преобразователя определяется избыточное давление в системе, которое используется для расчёта поверхностного натяжения (Рис. 2). Давление, необходимое для отрыва пузырька воздуха от капиллярного кончика, опущенного на границу жидкость-воздух, прямо пропорционально поверхностному натяжению (а) на этой границе. Электрические сигналы от всех измерительных систем поступают в электронный блок, который посредством аналого-цифрового преобразователя соединён с персональным компьютером.
Чтобы преодолеть капиллярное поднятие смачивающейся жидкости в опущенный в нес капилляр, следует приложить избыточное давление газа, зависящее от поверхностного натяжения жидкости и радиуса кривизны её мениска. Максимальное давление, возникающее при образовании пузырька газа, в процессе выдувания зависит от радиуса капиллярной трубки. По мере роста объёма пузырька газа радиус кривизны уменьшается и приближается к радиусу капилляра. В момент, когда пузырёк примет форму полусферы радиус капилляр:, будет равен радиусу кривизны и давление достигнет максимальной величины. При дальнейшем росте пузырька радиус кривизны вновь увеличивается, что уменьшает давление внутри пузырька, в результате воздух из капщи. ра устремляется в пузырёк и пузырёк отрывается [57]. Разделение интервала между пузырьками на так называемый мертвый период и «время жизни» поверхности основано на существовании критической точки зависимости давления от расхода воздуха. В этой точке происходит переход от пузырькового режима истечения газа из капилляра - к струйному. ПН исследуемой жидкости (сг) рассчитывается по величине измеренного избыточного давления Р по формуле Лапласа: где г - радиус капилляра, Рн - гидростатическое давление в измерительной ячейке, Pd - динамическое давление, обусловленное вязко-инерционными эффектами. Для капилляров, используемых при исследовании биологических жидкостей, Pd Q. «Время жизни» поверхности рассчитывается по формуле: где h- измеренный интервал между пузырьками, L- объемный расход воздуха. Значения L и Р с индексом "с" относятся к критической точке на зависимости Р от L.
При значениях L LC имеет место так называемый струйный режим течения газа в капилляре, тогда как при L Lc на кончике капилляра формируются отдельные пузырьки со временем жизни tf 0. Следует отметить, что строгая гидродинамическая теория метода максимального давления в пузырьке (учет инерции, вязкости, нестационарности и т. д.) начала развиваться лишь сравнительно недавно [57], однако уже было продемонстрировано, что простые соотношения (1) и (2) хорошо выполняются в случае капилляров, используемых при исследовании биологических жидкостей. Сравнение данных ВРА-1Р с другими известными методами (осциллирующей струи, объема капли, динамического капиллярного и пр.) [49, 57] показало хорошее совпадение результатов.
В методе максимального давления поверхность пузырька А в процессе его роста расширяется. Для учета этого явления используют вместо измеряемого (физического) времени tf так называемое эффективное «время жизни» teff, которое соответствует недеформируемой поверхности жидкости. Такой прием позволяет сравнивать различные методы, поскольку результаты измерений в данном случае не зависят от способов измерений.
Модификация методики определения динамического поверхностного натяжения сыворотки крови животных
Необходимое количество ДПФХ и трилаурина растворяли в хлороформе, затем с помощью роторной помпы (Rotavapor R-215, фирмы «Biichi Laboratortechnik AG», Швеция) при температуре 40С испаряли хлороформ, скорость вращения 60 об/мин, давление 425 мбар. Образовавшуюся на стенках пробирки пленку с помощью УЗ ванны при температуре 60С в течение 40 минут смешивали с водой до образования однородного раствора. Затем полученную смесь экструдировали с помощью пневматического экструдера (Der LiposaFast-Pneumatic, фирмы «Avestin Europe GmbH», Германия) через гидрокарбонатные мембраны с размером пор 50 нм при температуре 60С. До получения везикул размером 30-50 нм. Размер определяли методом светорассеяния прибором Malvern autositzer 3000 формы «Malvern Instruments Ltd.», UK. Значения z-потенциала были измерены на приборе Malvern nanositzer 2400 формы «Malvern Instruments Ltd.», UK. Измерения ПН проводились на тензиометре ВРА-1Р (Maximum Babble Pressure Tensiometr BPA-1P, Sinterface Technologies, Германия), методом максимального давления в пузырьке и приборе РАТ-1 (Topfen-Blasen-Profiltensiometer) (ФРГ, Sinterface Technologies) методом висящей капли. Для приготовления растворов и смесей веществ использовалась бидистиллированая вода со значением рН 6,8. Компоненты смешивали 1 к 1 по объему, указанные в таблицах концентрации соответствуют концентрации компонентов в смеси.
Биохимические исследования проводили на фотоэлектроколориметре КФК-2-УХЛ (РФ) и спектрометре «Helios р» с использованием биохимических наборов фирм «ДИАКОМ-ВНЦМДЛ» с использованием стандартных методик. Определение уровня общего белка - осуществляли методом биуретовой реакции, уровень альбуминов - колориметрическим методом с бромокрезолом (Ashwood E.R., 1965), уровень триглицеридов, холестерина, мочевины - ферментативно-колориметрическим методом (Stein Т.A., Myers G.L., 1974), уровень глюкозы - глюкозооксидазным методом (Ashwood E.R., 1965), содержание общего кальция - колориметрическим методом с о-крезолфталеином (Н. Gitelman, 1976), натрия колориметрическим методом (Henri R.J., 1974), калия - нефелометрическим методом (Henri R.J., 1974), хлоридов - колориметрическим методом с триоцианатом ртути (Burtis С. А., 1980).
Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ "Статистика" для Windows. Определены критические значения критерия достоверности на основе распределения Стьюдента с учётом принятой для научных экспериментов величины уровня значимости 0,05; 0,01; 0,001 [22].
Изучаемые два признака (данные биохимического анализа и межфазной тензиометрии) могут быть связаны между собой статистической (корреляционной) зависимостью. Поэтому для установления тесноты и характера связи между двумя признаками (величинами) при статистической обработке их рассчитывают коэффициент корреляции г. Он позволяет определить величину и направление связи при прямолинейном ее типе или близком к прямолинейному.
Вычисляют коэффициент корреляции следующим образом: Коэффициент корреляции г находят как частное от деления суммы произведений отклонений п0 на максимальную сумму 1м
Сумма произведений отклонений п0 рассчитывается по формуле: ХП0=(х-М,)х(у_М2)
Максимальная сумма Хм равна значению корня квадратного из произведений сумм квадратов отклонений: EM=VZ( -A ,)2XZ( -M2)2 Произведение суммы квадратов отклонений рассчитывается по формуле: Е(х — М,)2х1(у — М2)2
Для расчета суммы квадратов отклонений рассчитывают отклонение каждого измерения первого х или второго у признака от среднего арифметического для этого признака (Mj или М2), а затем полученные значения возводят в квадрат. Среднее арифметическое рассчитывают по формуле: где I - сумма значений всех измерений, п - число измерений, і- компонента.
Коэффициент корреляции выражается десятичной дробью и может принимать значения от 0 до ±1. Чем ближе значение г к 1, тем более сильная корреляционная связь между данными признаками. Если г = 0 или имеет небольшое дробное значение, то это указывает на отсутствие связи или на незначительную связь. Отрицательное значение г характеризует обратную корреляционную связь (уменьшение одной величины сопровождается увеличением другой), положительное значение — прямую связь (увеличение значений одной переменной величины приводит к возрастанию значений другой).
Корреляционные взаимодействия между отдельными биохимическими показателями и данными межфазной тензиометрии у лошадей в разные сроки постнатального онтогенеза и пола
Для выяснения зависимости ДПН крови от количественного и качественного состава её у лошадей в разные сроки постнатального онтогенеза и пола животных был проведён корреляционный анализ между показателями межфазной тензиометрии и данными биохимического анализа крови для разных групп животных.
Полученные данные сгруппированы по полу и возрасту в таблицах, где отмечены только сильные и средние корреляционные связи, которые являются достоверными.
Для кобылок отмечается большое количество сильных корреляционных связей. У жеребят в возрасте 1 месяц катионов, а повышаются при увеличении уровня мочевины и натрия в крови. Значения aj и аг имеют прямые корреляционные связи со всеми биохимическими показателями, кроме уровня значения оо понижаются при увеличении уровня белков, липидов, глюкозы и триглицеридов (обратная связь) и хлоридов. На значения аз оказывает влияние уровень общего белка, триглицеридов, кальция, калия (ДПН понижается), а также уровень мочевины, хлоридов (ДПН повышается). Значения Хо имеют прямую корреляционную связь со всеми показателями, кроме триглицеридов и калия. Значения Х\ имеют прямую корреляционную связь с уровнем белков, триглицеридов, глюкозы и кальция, обратную - с уровнем мочевины, калия, хлоридов.
Для кобыл 2 лет значения оо повышаются при увеличении уровня мочевины, кальция и натрия, а понижаются - при увеличении уровня общего белка и глюкозы. Значения o"i имеют прямую корреляционную связь с уровнем альбуминов, липидов, катионов и анионов, обратную - с уровнем глюкозы. На значения аг оказывают влияние уровень мочевины, который вызывает повышение ДПН, а также уровень белков и глюкозы, которые ДПН понижают. Значения аз имеют прямую корреляционную связь со всеми исследованными биохимическими показателями, кроме глюкозы и мочевины, а значения 1\ - обратную. Значения %о имеют прямую корреляционную связь с уровнем мочевины, кальция и натрия, а обратную -с уровнем общего белка и глюкозы.
Для кобыл 3-4 лет значения Go понижаются при увеличении уровня альбуминов, холестерина, глюкозы, кальция и калия. Значения 3\ имеют прямую корреляционную связь с уровнем хлоридов, обратную - с уровнем холестерина, глюкозы, кальция и калия. На значения о"2 оказывают влияние уровень холестерина, мочевины, глюкозы, натрия и хлоридов, которые вызывают повышение ДПН, а также уровень общего белка, который ДПН понижают. Значения аз имеют прямую корреляционную связь с уровнем общего белка, триглицеридов, натрия, обратную - с уровнем холестерина, мочевины, глюкозы, кальция, калия. Значения XQ имеют только обратную корреляционную связь с уровнем альбуминов, холестерина, мочевины, глюкозы, кальция и калия. Значения Х\ имеют прямую корреляционную связь с уровнем холестерина, мочевины, глюкозы, кальция и калия, а обратную - с уровнем общего белка, натрия, триглицеридов. Таким образом, на ДПН наибольшее влияние оказывает уровень холестерина, мочевины, глюкозы, кальция и калия, которые имеют корреляционные связи разной силы и типа со всеми показателями ДПН и углами наклона.
Для кобыл старше 5 лет значения оо понижаются при увеличении уровня триглицеридов и калия, а повышаются при увеличении уровня общего белка, холестерина и кальция. Значения Oj имеют только прямую корреляционную связь с уровнем альбуминов и натрия. На значения о 2 оказывают влияние уровень холестерина, глюкозы, натрия и хлоридов, которые вызывают повышение ДПН, а также уровень белков, триглицеридов, калия, которые ДПН понижают. Значения оз имеют прямую корреляционную связь с уровнем мочевины, глюкозы, натрия и хлоридов, обратную - с уровнем белков и кальция. Значения Хо имеют прямую корреляционную связь с уровнем белков, кальция, а обратную - с уровнем мочевины, глюкозы, калия, натрия и хлоридов. Значения Х\ имеют прямую корреляционную связь с уровнем холестерина, а обратную - с уровнем натрия, триглицеридов.
