Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Система глутатиона 11
2.1.1. Глутатион 11
2.1.2. Глутатионпероксидаза 16
2.1.3. Глутатионредуктаза 19
2.1.4. Глутатионтрансфераза 22
2.2. Ишемия головного мозга и система глутатиона 26
2.2.1. Патохимия ишемии головного мозга 26
2.2.2. Система глутатиона при ишемии 31
2.3. Методологические подходы к исследованию значения глутатиона при ишемии 34
2.3.1. Влияние нейропротекторов рецепторного действия на систему глутатиона при ишемии головного мозга 34
2.3.1.1. Нейропротекторный эффект агонистов аденозиновых рецепторов 35
2.3.1.2. Нейропротекторный эффект агонистов ГАМК-рецепторов 37
2.3.2. Целенаправленное изменение концентрации глутатиона 39
2.4. Заключение 43
3. Материалы и методы исследования 45
3.1. Объект исследования 45
3.2. Использованные фармакологические соединения и пути их введения 45
3.3. Методы исследования температуры тела и толерантности головного мозга к ишемии 49
3.4. Биохимические методы исследования 51
3.4.1. Выделение глутатиона и ферментного препарата 51
3.4.2. Определение концентрации глутатиона 52
3.4.3. Определение активности ферментов 53
3.5. Методы статистической обработки результатов 54
4.Результаты собственных исследований 56
4.1. Влияние нейропротекторов рецепторного действия на систему глутатиона 56
4.1.1. Влияние агонистов аденозиновых рецепторов на концентрацию глутатиона и активность ферментов его метаболизма 57
4.1.2. Влияние агонистов ГАМК-рецепторов на концентрацию глутатиона и активность ферментов его метаболизма 66
4.1.3. Заключение 71
4.2. Влияние целенаправленного изменения концентрации глутатиона на толерантность к ишемии головного мозга 75
4.2.1. Исследование влияния диэтилмалеата на систему глутатиона и функциональные параметры А 75
4.2.2. Исследование влияния бутионинсульфоксимина на систему глутатиона и функциональные параметры 85
4.2.3. Влияние эфиров глутатиона на систему глутатиона и функциональные параметры 93
4.2.4. Исследование совместного влияния деплеторов и метаболических предшественников глутатиона на биохимические и функциональные параметры 107
4.2.5. Влияние оксотиазолидинкарбоксилата и экзогенного глутатиона на биохимические и функциональные параметры 111
4.2.6. Заключение 118
5. Общее обсуждение 125
Выводы 135
Литература 137
- Патохимия ишемии головного мозга
- Целенаправленное изменение концентрации глутатиона
- Использованные фармакологические соединения и пути их введения
- Влияние агонистов аденозиновых рецепторов на концентрацию глутатиона и активность ферментов его метаболизма
Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы обнаружено, что кроме ряда ранее известных фундаментальных функций (Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1990; Dringen R., 2000) глутатион (GSH) необходим для редокс-регуляции многих важных процессов (Moran L.K. et at., 2001). Он обладает нейромодуляторной и нейротрансмиттерной активностью (Janaky R. et al., 1999; Oja S.S. et al., 2000). Однако совершенно недостаточно изучены функциональные эффекты GSH, в том числе в головном мозге. Значение GSH для терморегуляции почти не исследовалось. Остается спорной гипотеза о важной и исключительно защитной роли системы глутатиона при ишемии головного мозга (ИГМ) (Болдырев А.А., 1995; Dringen R., 2000).
Антиоксидативная функция GSH позволила предположить, что он предотвращает деструктивное воздействие на мозг активных форм кислорода (АФК), которые образуются в условиях ишемии/реперфузии (Juurlink В.Н. et al., 1998; Cuzzocrea S. et al., 2001; Anderson MR, Sims N.R., 2002). Так, истощение уровня GSH усиливает ишемические повреждения (Mizui Т. et al., 1992), а повышение, напротив, снижает (Shikama Н. et al., 199S). У трансгенных мышей со сверхэкспрессией глутатионпероксидазы (ГПО) увеличение ее активности может предотвращать необратимые функциональные повреждения, вызываемые временной гипоксией (Furling D. et al., 2000; Crack P.J. et al., 2001,2003). Однако глутатион может быть дополнительным источником главного возбуждающего медиатора мозга - глутамата, его массивное освобождение при ишемии повреждает нейроны и глию (Yang С. et al., 1995; Lipton, 1999). Установлено также, что увеличение уровня глутатиона его предшественниками усиливает морфологические повреждения в почках, вызванные ишемией (Scaduto R.C. et al., 1988), а введение деплеторов (веществ, снижающих концентрацию GSH) напротив защищает (Vanella A. et al., 1993; Kiely P.D. et al., 2002).
Для комплексного исследования роли системы глутатиона при ИГМ мы применили два методологических подхода. Первый - это изучение влияния нейропротекторов рецепторного действия на систему глутатиона при полной ИГМ. В настоящее время концепция о протекторах рецепторного действия успешно и плодотворно развивается при самых различных экстремальных состояниях организма: облучении, охлаждении, перегревании и различных видах общей гипоксии и ишемии (Кулинский В.И. и др., 1993-2000). Ранее было установлено, что агонисты аденозиновых рецепторов (А-агонисты) и рецепторов Y-аминомасляной кислоты (ГАМК-агонисты) повышают устойчивость мозга к полной глобальной ишемии на 100-500% и снижают температуру тела (Кулинский В.И., 2000). Однако биохимические сдвиги, возникающие при этом, изучены недостаточно для А-агонистов и совершенно не исследованы для ГАМК-агонистов. Эти сдвиги представляют интерес для понимания механизма действия нейропротекторов. Неэффективность многих применяемых методов лечения ишемии в значительной мере связана с неполнотой существующих представлений о механизмах устойчивости
С. Петербург . I
' ' .MH'jWU*
головного мозга к ишемии, с их отставанием от достижений современной биохимии (Koroshetz W.J., Moskowitz М.А., 1996; De Keyser J. et al., 1999). Один из недостаточно разработанных аспектов - состояние и значение системы глутатиона. Изучение эффектов ГАМК- и А-агонистов имеет также самостоятельный интерес для исследования регуляции системы глутатиона.
Второй методологический подход - это изучение влияния целенаправленного изменения концентрации глутатиона на толерантность к ИГМ. Работы в этом направлении не дают четкого представления о роли системы глутатиона в условиях ишемии/реперфузии. Полученные данные противоречивы. Есть работы, как подтверждающие, так и опровергающие защитную роль глутатиона (Vanella A. et al., 1993; Dringen R., 2000; Cuzzocrea S. et al., 2001). В большинстве случаев изучали ишемию с последующей реперфузией. Нами же была использована модель полной глобальной ишемии без последующей реперфузии. Отдельный интерес также представляет влияние веществ, изменяющих уровень GSH, на ферменты его метаболизма и температуру тела.
Таким образом, гипотеза о важной роли системы глутатиона для толерантности к ИГМ имеет литературное обоснование. Однако наличие и направленность влияния GSH нуждается в специальном исследовании. Кроме того, обычно изучались отдельные показатели состояния системы глутатиона, а целостную и непротиворечивую картину может дать только комплексное исследование.
Цель работы - исследовать роль системы глутатиона в развитии толерантности к полной глобальной ишемии головного мозга и в механизме нейропротекторного эффекта А- и ГАМК-агонистов.
Задачи исследования:
изучить сдвиги в системе глутатиона при введении агонистов аденозиновых и ГАМК-рецепторов;
исследовать влияние деплеторов и метаболических предшественников GSH на систему глутатиона, температуру тела и толерантность к ИГМ;
- провести корреляционный анализ изменений, возникающих в системе
глутатиона, с толерантностью к ишемии головного мозга и температурой тела и
определить их биологическое значение.
Научная новизна:
- обнаружено влияние селективных агонистов аденозиновых и ГАМК-
рецепторов на концентрацию глутатиона и ферменты его метаболизма;
впервые проведено комплексное исследование влияния веществ, целенаправленно изменяющих уровень GSH, на ферменты его метаболизма, толерантность к полной глобальной ишемии головного мозга и температуру тела;
впервые установлена корреляция снижения концентрации GSH с увеличением толерантности к ИГМ;
выявлено участие системы глутатиона в терморегуляции;
- впервые показано, что сдвиги уровня GSH в мозге влияют на систему глутатиона печени.
Научно-практическая значимость и внедрение в практику.
Полученные результаты расширяют представления о регуляции системы глутатиона и ее роли для толерантности к ишемии головного мозга и терморегуляции. Установлено, что увеличение толерантности к полной глобальной ишемии головного мозга зависит от снижения уровня глутатиона, а не от его аккумуляции. Выявлено, что система глутатиона участвует в терморегуляции и в нейропротекторном эффекте ГАМК- и А-агонистов. Работа выполнялась при поддержке РФФИ № 97-04-49139 (1997-1999). Материалы диссертации включены в курсы лекций по биохимии для студентов Иркутского государственного медицинского университета и Иркутского государственного университета.
Апробация результатов исследования. Материалы диссертации представлены и обсуждены на конференции молодых ученых России "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" с международным участием (г. Москва, 1998, 2001), на П и Ш всероссийской конференции "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (г. Москва, 1999, 2002), Российско-Монгольской конференции (г. Иркутск, 2001), итоговых научных конференциях Иркутского государственного медицинского университета (1998, 1999), итоговой научной конференции Иркутского государственного университета (1998), международном симпозиуме по сигнал-траисдукции (Брюссель, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 12 в центральной печати, в том числе 6 работ в отечественных журналах и 2 международные публикации.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных результатов, общего обсуждения'и выводов. Работа иллюстрирована 38 таблицей и 16 рисунками. Список литературы содержит 338 источников, из них 52 отечественных и 286 зарубежных.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
ГАМК- и А-агонисты влияют на систему глутатиона, вызывая сдвиги в концентрации GSH и активности ферментов его метаболизма.
-
Система глутатиона участвует в нейропротекторном эффекте ГАМК- и А-агонистов, но не является его основным механизмом.
-
Система глутатиона участвует в терморегуляции.
-
Толерантность к полной глобальной ишемии головного мозга связана со снижением GSH, а не с его аккумуляцией.
-
Некоторые эффекты денлеторов и метаболических предшественников GSH являются центральными, т.е. реализуются головным мозгом.
Патохимия ишемии головного мозга
Профилактика и лечение острой ишемии головного мозга является актуальной проблемой современной медицины. Нарушениями мозгового кровообращения сопровождается целый ряд патологических состояний, приводящих к потере трудоспособности, а нередко и к летальному исходу. Смертность от цереброваскулярных расстройств занимает второе-третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний.
Под ишемией понимают резкое ухудшение (неполная ишемия) или полное прекращение (полная ишемия) всех функций локального кровообращения: доставку кислорода и субстратов, удаление продуктов тканевого метаболизма. Хотя мозг составляет только 2% общей массы тела, на его долю приходится 20% общего кровотока и 20% потребляемого кислорода [Kuschinsky W., 1991; Ravindranath V., 1994; Dringen R., 2000]. Основными источниками энергии для мозга являются глюкоза, кетоновые тела и глутамат, которых в мозге немного, поэтому с прекращением тока крови создаются условия энергодефицита [Kuschinsky W., 1991].
Происходит переключение аэробного метаболизма на анаэробный, при этом преобладает расход АТФ над его синтезом, что приводит к снижению активности Ыа+/К+-АТФазы. В связи с этим повышаются концентрации внеклеточного К+ и внутриклеточного Na+, и изменяется внутри- и внеклеточный рН [Kuschinsky W., 1991; Siesjo В.К., Smith M.-L., 1991; Szatkowski M., Attwell D., 1994]. Это приводит к быстрой деполяризации нейронов и клеток глии. Происходит избыточное высвобождение из пресинаптических нервных терминалей возбуждающего нейротрансмиттера глутамата, который ингибирует Na+/K+-ATOa3y, что еще более усиливает деполяризацию [Булыгина Е.Р. и др., 2002]. Повышенный уровень глутамата сохраняется, т.к. при ишемии блокируется способность глиальных клеток превращать глутамат в глутамин и нарушается система обратного захвата нейротрансмиттера. Переносчик транспортирует один анион глутамата в симпорте с двумя Na+, в то время как К+ и ОН переносятся из клетки. Поскольку при ишемии происходит нарушение в ионном градиенте и трансмембранном потенциале нейронов и клеток глии, переносчик работает в обратном направлении, повышая концентрацию внеклеточного глутамата до нейротоксичного уровня [Siesjo В.К., Smith M.-L., 1991; Szatkowski M, Attwell D., 1994; Koroshetz W.J., Moskowitz M.A., 1996; Lee J.-M. et al., 1999]. Повреждению мозга способствуют также нейротоксичные концентрации аспартата и цинка. Zn2+ присутствует во всех клетках и является необходимым компонентом для ряда ферментов и транскрипционных факторов, он выполняет функцию нейротрансмиттера и нейромодулятора в ЦНС [Lee J.-M. et al., 1999].
Глутамат воздействует на свои ионотропные (NMDA, АМРА/каинатные, квисквалатные) и метаботропные рецепторы. В ответ на стимуляцию АМРА/каинатные и квисквалатные рецепторы открывают быстрые рецептор-зависимые Ыа+-каналы, что приводит к активации Са2+-потенциалзависимых каналов и трансмембранного переносчика, обменивающего Na+ на Са2+. Увеличению Са2+ в клетке способствует также стимуляция NMDA-рецепторов, напрямую связанных с Са -каналами, и метаботропных рецепторов, активация которых инициирует образование инозитол-1,4,5-трисфосфата (ИФ3) и диацилглицерола (ДАГ). Это активирует Са +-потенциалзависимые каналы и вызывает высвобождение Са из внутриклеточных депо. Повышению Са способствует оксидативный стресс [Siesjo В.К., Smith M.-L., 1991; Szatkowski M., Attwell D., 1994; Koroshetz WJ., Moskowitz M.A., 1996; Lee J.-M. et al., 1999].
Увеличение концентрации Na+ в клетке вызывает приток С1 и воды, что приводит к отёку нейронов и может способствовать развитию некроза [Szatkowski М., Attwell D., 1994; Koroshetz W.J., Moskowitz М.А., 1996; Lee J.-M.etal., 1999].
Аномально высокая концентрация Са2+ запускает такие процессы, как активация протеаз, киназ, эндонуклеаз, фосфатаз, фосфолипазы А2, липоксигеназ, что вызывает модификацию и повреждение клеточных ферментов, нуклеиновых кислот и липидов мембран. Активирование фосфолипазы Аг приводит к избыточному освобождению арахидоновой кислоты и синтезу из нее воспалительных эйкозаноидов. Са2+ активирует NO -синтазу, которая высвобождает NO . Нарушения в гомеостазе Са2+ способствует снижению жизнеспособности клеток, что может привести к их смерти [Siesjo В.К., Smith M.-L., 1991; Szatkowski M., Attwell D., 1994; Koroshetz WJ., Moskowitz M.A., 1996].
В настоящее время установлено, что наряду с некротическими изменениями, вызванными глутаматно-кальциевым каскадом повреждения нейронов, ишемия индуцирует и нейронный апоптоз [Lee J.-M. et al., 1999].
При ишемии наблюдается агрегация лейкоцитов, которую усугубляют капиллярные расстройства, наблюдающиеся после артериальной окклюзии. Полиморфонуклеарными лейкоцитами в ишемической области индуцируются воспалительные процессы, опосредуемые цитокинами, что приводит к медленной гибели выживших нейронов. Агрегации тромбоцитов способствуют АФК [Коган А.Х., 1999], которые образуются в условиях ишемии и участвуют в ишемически-реперфузионных повреждениях [Granger D.N., Korthuis R.J., 1995].
В условиях ишемии при нарушениях кровоснабжения в нейронах мозга понижается концентрация молекулярного кислорода и увеличивается уровень восстановленности компонентов дыхательной цепи. В этих условиях стимулируется восстановление кислорода в дыхательной цепи по одноэлектронному пути с образованием супероксид-аниона (О ), поскольку С 2 легко реагирует с восстановленными компонентами дыхательной цепи на начальных и средних этапах [Болдырев А.А., 1995, 2001; Ravindranath V., 1994; Dalton Т.Р. et al., 1999]. 0\ восстанавливается супероксиддисмутазой до перекиси водорода (Н2О2), в водной среде спонтанно метаболизируется в синглетный кислород или же при взаимодействии с Н2О2 образует гидроксил-радикал (НО ) (реакция Хабер-Вейса). Н2О2, реагируя с Fe2+, преобразуется в НО (реакция Фентона) [Владимиров Ю.А., 1998; Granger D.N., Korthuis R.J., 1995; Fridovich I., 1997; Cuzzocrea S. et al., 2001]. Образованию АФК при ишемии также способствуют каскад арахидоновой кислоты, ксантин оксидазные реакции и возбуждающие аминокислоты [Ravindranath V., 1994]. Эти процессы значительно усиливаются при реперфузии - в период восстановления кровотока, так как реоксигенация увеличивает генерацию О , вынуждая нейроны пройти через стадию оксидативного стресса. АФК запускают процессы перекисного окисления липидов, вызывают нарушение функций гематоэнцефалического барьера, способствуют отеку мозга, движению лейкоцитов в ишемическую зону, нарушают микроциркуляцию [Биленко М.В., 1989; Гусев В.А., Панченко Л.Ф., 1997; Siesjo В.К., Smith M.-L., 1991; Ravindranath V., 1994; Koroshetz W.J., Moskowitz M.A., 1996; Juurlink B.H., 1997; Nita D.A. et al., 2001].
Целенаправленное изменение концентрации глутатиона
Второй методологический подход исследования — изучение влияния целенаправленного изменения концентрации глутатиона на толерантность к ишемии головного мозга.
Снижение или повышение уровня тканевого GSH является полезным инструментом изучения значения антиоксидантной системы при различных условиях. Истощение тканевого GSH на 30% от нормального значения, особенно в печени, может привести к увеличению образования АФК, изменениям в обмене ксенобиотиков и усилению токсичности электрофилов. Поэтому методы изменения концентрации GSH активно применяются при изучении окислительного стресса [Back S.A. et al., 1998; Hurst R.D. et al., 1998; Vornov J.J. et al., 1998; Kitteringham N.R. et al., 2000], для изучения синтеза GSH [Lu S.C. et al., 1999; Tanaka T. et al., 1999], мутагенности и токсичности препаратов [Mizutani Т. et al., 1999; Chang Y.C. et al., 2002; Drake J. et al., 2002], канцерогенеза [Chen X. et al., 1998; Holub Z. et al., 2002], апоптоза [Merad-Boudia M. et al., 1998; Taglialatela G. et al., 1998; Hansen J.M. et al., 2001; Sakurai T. et al., 2002] и др.
Широко используемый метод для снижения GSH - это введение соединений, которые ГТ конъюгирует с GSH (чаще используется в печени, где высока активность ГТ). Вторым общепринятым методом является ингибирование синтеза GSH (чаще используется в почках, где высокая скорость оборота GSH). Для снижения GSH также используется окисление до GSSG, особенно при изучении изолированных органов. Однако этот метод не специфичен для GSH и недолговременен, т.к. при накоплении GSSG повышается активность ГР, которая восстанавливает GSH [Meister А., 1985, 1995а, 1995в; Anderson М.Е., 1998].
Одним из наиболее приемлемых деплеторов GSH (веществ, снижающих уровень GSH) in vivo является диэтилмалеат (DEM) [Plummer J.L. et al., 1981; Masukawa Т. et al., 1989]. Он относится к ар 40 ненасыщенным карбонильным соединениям. Это слабый электрофил, который взаимодействует с GSH при работе ГТ. Внутрибрюшинное или подкожное введение DEM снижает концентрацию GSH в печени крыс, начиная с 30 мин и, особенно интенсивно в период с 2 до 4 часов. Через 24 часа уровень GSH остается сниженным, и затем возвращается к контрольным значениям [Керимов Б.Ф., 1993; Plummer J.L. et al., 1981; Weber С.A. et al., 1990]. При истощении GSH скорость его синтеза увеличивается. Аналогично, но в меньшей степени происходит снижение GSH в мозге, плазме крови, почках и др. [Masukawa Т. et al., 1989; Slott V.L. et al., 1989; Weber C.A. et al., 1990; Vanella A. et al., 1993].
Вторым широко используемым деплетором является бутионинсульфоксимин (BSO) [Griffith O.W., 1981; Meister А., 1985; Pileblad Е., Magnusson Т., 1989, 1990; Anderson М.Е., 1998]. BSO - сильный и специфичный ингибитор ключевого фермента синтеза GSH у-глутамилцистеинсинтетазы. BSO фосфорилируется АТФ при связывании с активным центром ГГЦС, образуя промежуточного соединение, подобное у-глутамилфосфату, которое блокирует фермент [Griffith O.W., 1981; Meister А., 1985]. Скорость и интенсивность ингибирования BSO зависит от концентрации глутамата. BSO вводят подкожно, внутрибрюшинно, в желудочек мозга или орально. В отличие от DEM, снижение концентрации GSH при введении BSO наблюдается только через 2 ч, но сохраняется в течение 48 часов [Griffith O.W., 1981; Pileblad Е., Magnusson Т., 1989, 1990]. BSO, как и DEM интенсивно снижает глутатион в печени, и в меньшей степени в других тканях [Broquist Н.Р., 1994; Fujiyama J. et al., 1994; Leeuwenburgh C, Ji L.L., 1995; Seaton T.A. et al., 1996; Toffa S. et al., 1997; Merad-Saidoune M. et al., 1999; Abe K. et al., 2000; Drake J. et al., 2002].
DEM и BSO обладают цитотоксическим эффектом и вызывают некроз клеток, поэтому при их использовании необходимо точно подобрать дозу [Maellaro Е. et al., 1990; Garber S.L. et al., 1995; Nakagawa I. et al., 1995; Mizutani T. et al., 1999; Cardozo-Pelaez F. et al., 2002; Chang Y.C. et al., 2002; Dierickx P.J. et al., 2002; Li M., Scheers E.M. et al., 2002; Nagai H. etal.,2002]. Лучший метод повышения GSH — это введение его производных, которые, в отличие от глутатиона, хорошо транспортируются в клетки и трансформируются в GSH [Anderson М.Е., Meister А., 1989]. Многообещающим является применение GSH, этерифицированного по карбоксильной группе глицина. Получившиеся эфиры быстро переносятся в клетки и деэстерифицируются эстеразами до GSH [Anderson М.Е. et al., 1985; Meister А., 1985; Anderson М.Е., 1998; Thompson D.C. et al., 1998; Grattagliano I. et al., 1999]. Была обнаружена относительно невысокая внеклеточная деэстерификация [Anderson М.Е. et al., 1985]. Для повышения уровня GSH применяют также предшественник глутатиона — Ь-2-оксотиазолидин-4-карбоксилат (ОТС). При введении в организм он подвергается в клетке действию 5-оксопролиназы, в результате образуется цистеин, который является субстратом, лимитирующим скорость синтеза GSH [Meister А., 1985; Chen X. et al., 1998; Kranich О. et al., 1998; Mochizuki K., 1999; Fukagawa N.K. et al., 2000]. В разных экспериментах введение ОТС повышало уровень GSH на 30-135% [Shivakumar B.R., Ravindranath V., 1992; Gerard-Monnier D. et al., 1993; Gross C.L. et al., 1997; Luthen R. et al., 1997; Lord-Fontain S., Averill D.A., 1999; Iimuro Y. et al., 2000].
Направленное изменение концентрации GSH использовалось при исследовании ишемии. В большинстве работ деплеторы усиливают повреждения, вызываемые ишемией/реперфузией, в то время как предшественники и производные GSH выступают в качестве протекторов [Mizui Т. et al., 1992; Haddock P.S. et al., 1995; Shikama H. et al., 1995; Hall N.C. et al., 1997; Grattagliano I. et al., 1999; Sasaki T. et al., 2001; Gao F. et al., 2002]. Но в литературе есть противоположные данные: введение моноэтилового эфира GSH усиливает морфологические повреждения в почках, вызванные ишемией [Scaduto R.C. et al., 1988], а прекондиционирование с DEM защищает легкие от ишемических-реперфузионных повреждений, возможно, потому что прооксйданты предотвращают воспалительные повреждения [Kiely P.D. et al., 2002]. Подобный защитный эффект DEM при ишемии/реперфузии показан и для мозга крыс [Martinez G. et al., 1998]. Введение DEM или BSO увеличивает продолжительность жизни животных, подверженных ишемии [Vanella А. et al., 1993]. Работы в данной области проводились на модели с последующей реперфузией. Хотя известно, именно в период последующей после ишемии реперфузии идет интенсивное образование АФК.
Использованные фармакологические соединения и пути их введения
Для выяснения механизма действия имеет значение путь введения изучаемого препарата. От него зависят скорость развития, выраженность и продолжительность эффекта исследуемого вещества. Сравнение путей введения показывает преобладание центрального или периферического механизма. Поэтому при изучении DEM, BSO, ОТС, GSH и эфиров глутатиона мы использовали интрацеребровентрикулярное введение — в левый желудочек головного мозга. Для этого мышь фиксировали, с верхней части головы срезали кожу. Иглу микрошприца вкалывали на глубину 3 мм в точку, располагающуюся на 1 мм правее сагиттального шва и 0,5 мм назад от места соединения лобной и обеих теменных костей [Hosford D.A. et al., 1992]. Объем инъекции - 3-12 мкл раствора (в большинстве серий 3 мкл). Оптимальная длина иглы подобрана опытным путем, адекватность методики многократно подтверждена тем, что введенная краска обнаруживается только в желудочке мозга. Опытные животные хорошо переносили операцию и по поведению не отличались от интактных мышей.
Конкретные дозы и сроки введения веществ даны при описании результатов в таблицах и подписях к рисункам.
Температуру тела измеряли электротермометром ТПЭМ-1 в кишечнике на глубине 3,5 см, что для мышей соответствует ободочной кишке. Измеряемые значения соответствовали температуре "ядра" тела у мышей. Измерение температуры производили в группе опытных животных, которым вводили исследуемые вещества и в контрольной группе (животные, которым вводили растворители исследуемых веществ). В каждой группе измерение температуры проводилось до введения растворителя или исследуемого вещества и затем повторялось через определенные временные интервалы, а также непосредственно перед декапитацией.
Определение толерантности головного мозга к острой ишемии и оценку нейропротекторого эффекта веществ производили на декапитационной модели полной глобальной ишемии головного мозга, введенной Лоури [Lowry О.Н. et al., 1964]. Адекватность этой модели для оценки и изучения нейропротекторных свойств фармакологических соединений подтверждена обнаружением высокого НПЭ селективных агонистов аденозиновых и ГАМК-рецепторов [Кулинский В.И., 1994, 2000; Кулинский В.И., Михельсон Г.В., 1997; Кулинский В.И., Минакина Л.Н., 2000, 2001]. Результаты полностью совпадают с данными, полученными на других моделях ишемии головного мозга для НПЭ агонистов аденозиновых рецепторов [Sweeney МЛ., 1997; Fredholm В.В., 1997]. В качестве количественного показателя толерантности к ишемии головного мозга использовалась продолжительность гаспинга (gasping -атональное дыхание), которая определялась по секундомеру от момента декапитации до последнего открывания рта [Nikolova М. et al., 1984; Araki Н. et al., 1988]. Продолжительность атонального дыхания зависит от жизнеспособности нейронов дыхательного центра продолговатого мозга, а не от мозгового кровотока или состояния сердечно-сосудистой системы [Araki Н. et al, 1988]. Используемая нами модель воспроизводит полную глобальную ишемию головного мозга, поэтому она является жесткой: в первых работах лишь немногие вещества и в небольшой степени увеличивали продолжительность гаспинга [Nikolova М. et al., 1984; Araki Н. et al., 1988]. Очевидно, что данная модель необходима для комплексного изучения потенциальных нейропротекторов.
Декапитация как модель полной глобальной ишемии головного мозга широко используется для биохимических и фармакологических исследований [Булычев А.Г., Броун А.Д., 1981; Иванова И.А. и соавт., 1985; Бобков Ю.Г., Иванова А.И., 1987; Николова и соавт., 1991; Lowry О.Н. et al. 1964; Nikolova М. et al., 1984; Araki H. et al., 1988; Нага H. et al., 1990; Satoshi O. et al., 1993; Vannucci R.C., Brueklacher R.M., 1994; Matsumura T. et al., 1995; Nonaka M. et al., 1998; Racay P. et al., 2000; Adachi N. et al., 2001; Gerasimov V.D. et a ., 2001; Liu X.D. et al., 2002].
Декапитацию производили резким одномоментным отсечением головы животного на уровне между II и III шейными позвонками, что позволяет предотвратить механические повреждения стволовых отделов головного мозга.
Все операции до конечного этапа — спектрофотометрического определения ферментативной активности — проводили на холоду. Исследуемые органы (печень, головной мозг) быстро извлекали, промокали фильтровальной бумагой, взвешивали, измельчали и переносили в пробирку, предварительно погруженную в ёмкость со льдом. Затем для исследования ферментативной активности добавляли среду выделения (0,25 М сахароза, 0,01 М трис, 1 мМ ЭДТА; рН=7,5) из расчета 1 : 5 (вес : объем). Для определения концентрации глутатиона добавляли 5% сульфосалициловую кислоту из расчета 1 : 4 (вес : объем). Гомогенизацию проводили с помощью гомогенизатора при постоянном движении тефлонового пестика вверх-вниз в течение 1 минуты при 2890 об/мин. Фракцию надосадочной жидкости (супернатант для ферментативного препарата и безбелковый фильтрат для глутатиона) получали центрифугированием на рефрижераторной центрифуге при 13000 об/мин (14000 g) в течение 30 минут (для ферментов) или в течение 10 мин (для глутатиона).
Влияние агонистов аденозиновых рецепторов на концентрацию глутатиона и активность ферментов его метаболизма
Введение меньшей дозы мусцимола (0,035 мкмоль/кг) понижает ГПО, так же как и последовательное введение баклофена (140 мкмоль/кг) и через 2 ч мусцимола. Большая доза мусцимола (0,114 мкмоль/кг) и баклофен (140 мкмоль/кг), отдельно не влияют на ГПО в головном мозге, но совместное их введение снижает активность фермента (на 53%). Такая же картина характерна для ГТ в головном мозге - при совместном введении 140 мкмоль/кг баклофена и 0,035 мкмоль/кг мусцимола происходит уменьшение ГТ (на 57%), которого нет при индивидуальном введении ГАМК-агонистов. Комбинация баклофен + мусцимол не вызывает сдвигов активности ГР в мозге и ГПО в печени. Мусцимол в дозе 0,114 мкмоль/кг умеренно понижает ГР в печени, эффект сохраняется при одновременном введении 140 мкмоль/кг баклофена. В головном мозге происходит инвертирование эффекта — мусцимол в дозе 0,114 мкмоль/кг повышает ГТ (на 52%), баклофен не влияет, а их совместное действие снижает активность фермента (на 57%). Эффекты баклофена и мусцимола в печени не суммируются. Так как сам баклофен уменьшает ГТ на 34%, мусцимол - на 30%, а при их общем введении активность фермента в печени снижается на 36%.
Корреляционный анализ эффектов агонистов ГАМК-рецепторов показал наличие отрицательной взаимосвязи между активностью ГПО в головном мозге и толерантностью к ишемии головного мозга (rs=-0,738). Между другими показателями корреляционные показатели статистически не значимы (табл. 10).
Таким образом, концентрация GSH снижается только при введении баклофена в наименьшей исследованной дозе в печени, мусцимол же не влияет. В головном мозге ГПО снижается под влиянием 94 мкмоль/кг баклофена (на 38%) и меньших доз мусцимола (на 34-41%), а также при совместном их введении (на 53%). В печени ГПО умеренно уменьшается при воздействии большей дозы мусцимола (0,114 мкмоль/кг). Активность ГР в головном мозге резко снижают мусцимол в дозе 0,007 мкмоль/кг и умеренно баклофен в дозе 94 мкмоль/кг. Отрицательные сдвиги ГР в печени вызывает мусцимол (на 54% в дозе 0,007 мкмоль/кг и на 32% — 0,П4 мкмоль/кг) и совместное введение ГАМК-агон истов (-31%). Мусцимол в дозе 0,114 мкмоль/кг увеличивает в 1,5 раза активность ГТ в головном мозге. При совместном его введении с баклофеном (94 мкмоль/кг) происходит снижение активности ГТ (на 57%). В печени активность ГТ умеренно понижают баклофен в обеих исследованных дозах и мусцимол в дозах 0,007 и 0,114 мкмоль/кг. Совместное введение баклофена (94 мкмоль/кг) и мусцимола (0,035 мкмоль/кг) вызывают снижение ГТ в печени (на 36%).
Ряд факторов, таких как отсутствие чёткой дозовой зависимости, наличие корреляционной взаимосвязи лишь между активностью ГПО в мозге и толерантностью к ишемии, отсутствие корреляции между концентрацией GSH и функциональными параметрами - всё это говорит в
пользу того, что система глутатиона вряд ли существенно участвует в реализации нейропротекторного эффекта ГАМК-агонистов. По-видимому, он осуществляется другими механизмами. Тем не менее, установленные изменения в активности ФМГ при введении ГАМК-агонистов представляют интерес для изучения регуляции системы глутатиона ГАМК-агонистами и свидетельствуют о ее наличии, хотя, возможно, что эти сдвиги являются следствием изменений в других биологических системах, вызванных действием агонистов ГАМК-рецепторов. Заметим, что из 14 сдвигов, только один положительный, в большинстве случаев ГАМК-агонисты вызывают снижение показателей системы глутатиона, т.е. уменьшают активность антиоксидантной системы. Это может быть одним из компонентов толерантной стратегии защиты, характерной для этих нейропротекторов.
Синтетические аналоги ингибиторных нейротрансмиттеров участвуют в регуляции системы глутатиона. Агонисты аденозиновых рецепторов вызывают, как отрицательные, так и положительные сдвиги. Агонисты Аррецепторов повышают, а Аг-рецепторов, напротив, снижают уровень GSH, активности ГПО и ГТ (кроме DPMA) в печени. По-видимому, это связано с тем, что стимуляция Ар и Аг-рецепторов включает противоположные механизмы: воздействие на Аррецепторы приводит к ингибированию аденилилциклазы и снижению концентрации цАМФ; стимуляция Аг-рецепторов активирует эту систему. Поэтому введение агонистов Ар и Аг-рецепторов иногда приводит к противоположным результатам. В ряде случаев эффекты Ар и А2-агонистов совпадают: снижение GSH в мозге вызывают все исследованные препараты, ГР в печени понижают все Арагонисты и CGS 21680. Неселективный агонист NECA вызывает сдвиги характерные для Ар агонистов: он снижает GSH в мозге и ГР в обоих исследованных органах, повышает ГПО в мозге и ГТ в печени. Неселективный аденозин не влияет на систему глутатиона, что связано, очевидно, с его быстрым метаболизмом в организме.
ГАМК-агонисты вызывают в основном отрицательные сдвиги, повышение установлено только для ГТ в головном мозге при введении большей дозы мусцимола. Оба ГАМК-агониста уменьшают ГПО и ГР мозга, ГТ печени. Баклофен умеренно понижает GSH печени, мусцимол — ГР печени. Таким образом, агонисты ГАМК-рецепторов снижают активность системы глутатиона.
