Введение к работе
Актуальность исследования. Черепно-мозговая травма (ЧМТ) остаётся одной из ведущих причин смертности и инвалидизации населения. Число инвалидов вследствие ЧМТ в России составляет 2 млн, в США – более 3 млн (Л.Б. Лихтерман и соавт., 2008; И.В. Куршакова, 2006). Даже в случае изолированной ЧМТ легкой степени, на долю которой в структуре нейротравмы приходится от 60 до 80%, все более ощутимой становится ее социальная и экономическая цена (С.В. Царенко, 2006).
Экспериментальные и клинические исследования дают основания считать, что одним из основных механизмов развития последствий и осложнений ЧМТ является дисбаланс аварийных гуморальных и клеточных реакций, вызывающих как дегенеративно-деструктивные, так и регенеративно-репаративные изменения в структурах головного мозга (С.В. Царенко, 2006).
Для своевременной оценки характера изменений в структурах головного мозга показало свою перспективность исследование в биологических жидкостях нейроспецифических белков (П.П. Кулагин, М.А. Чишиева, 1978; Е.Б. Пухов, 1995; В.В. Белопасов с соавт., 1997; В.П. Чехонин с соавт., 1999; E.G. McKeating et al., 1998), а также белков-маркеров репаративной регенерации (В.М. Мирошников, 1999). Определение сывороточных концентраций таких белков немыслимо без совершенствования методов иммунохимического анализа (В.П. Чехонин с соавт., 1999). Современный этап иммунохимии характеризуется разработкой широкого спектра высокочувствительных экспресс-методов анализа, основанных на реакции антиген-антитело (Б.Б. Дзантиев с соавт., 2011), которые могут быть актуальны и в оценке течения острого периода травматической болезни мозга (ТБМ).
Кроме того, иммунохимический анализ может представлять интерес для контроля различных патологических состояний и осложнений, сопровождающих ТБМ (Г.А. Трубников и соавт., 1975, 1993; Д.М. Никулина, 1981, 2009; В.В. Белопасов с соавт., 2011; А.В. Коханов с соавт., 2011). Следовательно, поиск и отбор иммунохимических индикаторов, эффективных для прогнозирования осложнений и для оценки результатов оперативного и консервативного лечения ЧМТ остается актуальной проблемой.
Существенным является факт отсутствия доступных коммерческих тест-систем на некоторые антигены, перспективные для оценки патологических синдромов, сопровождающих ЧМТ. К таким белкам относятся, в первую очередь, некоторые нейроспецифические белки и термостабильная щелочная фосфатаза плацентарного типа, как маркер энергетических процессов репаративной регенерации мозга. Разработка методов их выделения, очистки и конструирования тест-систем на эти белки представляет собой самостоятельную важную биохимическую проблему.
Цель исследования: провести сравнительный биохимический анализ органоспецифических и межорганных белков мозга человека и оценить эффективность иммунохимических тестов на эти белки в мониторинге и прогнозировании осложнений черепно-мозговой травмы.
Задачи исследования.
-
Выделить из экстрактов мозга человека органоспецифические белки, изучить их физико-химические свойства и получить на очищенные антигены мозга моноспецифические антисыворотки.
-
Разработать иммунохимические методы определения концентрации в сыворотке крови идентифицированных органоспецифических белков мозга и термостабильной щелочной фосфатазы плацентарного типа – белка-маркера процессов репаративной регенерации.
-
Изучить динамику уровня органоспецифических антигенов мозга, некоторых острофазовых белков, маркеров пролиферативных и репаративных процессов и иммуноглобулинов в сыворотке крови пострадавших с ЧМТ в различные периоды травматической болезни головного мозга при ее благоприятном и осложненном течении.
-
Определить корреляционные взаимоотношения органоспецифических антигенов мозга, острофазовых железосодержащих белков, маркеров репаративных процессов и иммуноглобулинов со степенью тяжести черепно-мозговой травмы и характером осложнений травматической болезни головного мозга.
Научная новизна исследования. В экстрактах дефинитивного мозга идентифицированы два органоспецифических белка мозга: термостабильный альфа1-глобулин и растворимый в органических кислотах альфа2-глобулин.
Впервые методами ионообменной, гидрофобной и аффинной хроматографии дана физико-химическая характеристика термостабильному и кислотоустойчивому белкам мозга человека в сравнении с другими белками мозга человека, растворимыми в органических кислотах, насыщенном растворе сульфата аммония и этакридина. Разработаны новые методы выделения и очистки органоспецифических белков мозга.
Получены оригинальные данные комплексного анализа содержания органоспецифических антигенов мозга (S-100, альфа1- и альфа2-глобулины мозга) и белков, ассоциированных с разными сторонами патологического процесса: железосодержащих белков острой фазы лактоферрина (ЛФ) и ферритина, (Фр), белков-маркеров процессов репаративной регенерации: альфа-фетопротеина (АФП), раковоэмбрионального антигена (РЭА) и плацентарной щелочной фосфатазы (ПЩФ) в сыворотке крови больных с ЧМТ различной степени тяжести в динамике травматической болезни мозга при различных исходах заболевания.
Научно-практическая значимость работы. Предложены схемы выделения и очистки органоспецифических белков мозга с помощью ионообменной, аффинной и гидрофобной хроматографии, позволяющие получать очищенные препараты этих белков для последующего моделирования иммунохимических тест-систем с использованием самостоятельно полученных моноспецифических антисывороток.
Очищенная разработанным способом ПЩФ может найти применение не только в производстве специфической тест-системы на этот белок, но и как биологически активного препарата с высокой коммерческой перспективой. Комплекс иммунохимических тестов на ПЩФ, ферритин, лактоферрин и органоспецифические антигены мозга может выступать в роли одного из критериев оценки эффективности лечения травматической болезни мозга и прогнозирования последствий и различных осложнений ЧМТ.
Предложен алгоритм прогнозирования гнойных внутричерепных и внечерепных осложнений ЧМТ по соотношению уровней лактоферрина и иммуноглобулинов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Иммунизацией кроликов экстрактами мозга и продуктами их жесткого фракционирования (кипячением, обработкой органической кислотой и насыщенным раствором сульфата аммония) получены антисыворотки на пять белков мозга. Два белка, названные альфа1-ТС- и альфа2-КС-глобулинами являются строго органоспецифическими антигенами мозга, а три других белка-«экстремала», обнаруживаемых также в экстрактах других органов, идентифицированы как ранее описанные белки ферритин, S-100 и РЭА.
-
Дана физико-химическая и хроматографическая характеристика белков мозга и на основе полученных данных разработаны методы выделения и очистки двух органоспецифических белков мозга и белка-маркера репаративных процессов – термостабильного фермента ПЩФ.
-
На очищенные белки получены моноспецифические антисыворотки и сконструированы тест-системы для иммунодиффузионного и иммуноферментного анализа. Дана характеристика очищенных препаратов органоспецифических белков мозга и ПЩФ и иммунохимических тест-систем для их количественного определения.
-
Установлены уровни органоспецифических белков мозга, лактоферрина, ферритина и маркеров репаративных процессов в сыворотках крови пострадавших, охарактеризованы изменения некоторых биохимических показателей крови в динамике острого периода ЧМТ различной степени тяжести и в зависимости от характера осложнений ТБМ.
-
Установлены статистически значимые корреляционные связи уровней отдельных изученных белков со степенью тяжести ЧМТ и вероятностью развития ранних осложнений травматической болезни мозга.
Апробация результатов исследования. Материалы диссертации были представлены на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых» (Астрахань, 2010); VII Международной научно-практической конференции «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», Астрахань-Москва, 2010; VII научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2011»; VIII Международной научно-практической конференции «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2011); Международной научной школе для молодежи «Школа научно-технического творчества и концептуального проектирования» и Региональной научно-практической конференции «Исследования молодых ученых – вклад в инновационное развитие России» (Астрахань, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе, 4 – статьи в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 25 таблицами, 8 рисунками. Список литературы включает 251 источник, из которых 164 работы отечественных и 87 зарубежных авторов.
