Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Молекулярные основы патогенеза и подходы к биохимической оценке травматической болезни (обзор литературы) 15
1.1. Основные патологические процессы и синдромы острого периода травмы и их молекулярные механизмы 15
1.2. Лабораторные, биохимические и иммунохимические методы оценки синдромов и диагностики осложнений травматической болезни 22
1.2.1. Маркеры синдрома системного воспалительного ответа (SIRS) и септических осложнений травматической болезни 23
1.2.2. Травматический токсикоз и методы его диагностики 30
1.2.3. Маркеры синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания и других нарушений гемостаза и фибринолиза 37
1.2.4. Система эритрона при травме и методы оценки острой крово-потери, анемии и гипоксии 41
1.2.5. Лабораторные и биохимические методы диагностики ранних и поздних осложнений травматической болезни 46
1.2.6. Клинические, лабораторные и биохимические особенности течения травмы на фоне острой и хронической алкогольной интоксикации 49
1.2.7. Клиническая, лабораторная и биохимическая оценка эффективности МДМ-терапии 50
1.2.8. Лабораторные и биохимические особенности изолированной и сочетанной черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и травмы опорно-двигательного аппарата (ОДА) 51
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 56
2.1. Общая характеристика обследованных больных 56
2.2. Методы оценки тяжести повреждений и тяжести состояния больных 62
2.3. Материал и методы лабораторного исследования 71
2.4. Методы идентификации, выделения и очистки белков 74
2.5. Методы статистического анализа 78
Результаты собственных исследований 81
ГЛАВА 3. Характеристика, выделение и очистка некоторых белков, значимых для оценки синдромов травматической болезни, и разработка иммунохимических тестов на эти белки 81
3.1. Белки крови, перспективные для иммунохимического мониторинга основных процессов травматической болезни 81
3.1.1. Сывороточные и острофазовые белки 91
3.1.2. Сывороточные гормонтранспортирующие белки 65
3.1.3. Тканевые и органоспецифические белки 97
3.1.4. Онкофетальные и канцероплацентарные белки 105
3.2. Хроматографическая характеристика сывороточного альбумина, АФП, ПЩФ, СБАГ и транскортина человека 111
3.3. Разработка метода определения связывающей способности сывороточного альбумина и оценки степени эндотоксикоза 128
3.4. Разработка технологии получения препарата СБАГ и транскортина из сыворотки беременных и ПЩФ из экстракта плаценты 138
3.5. Характеристика очищенного препарата СБАГ, транскортина и ПЩФ 143
ГЛАВА 4. Иммунохимические и лабораторные показатели в оценке изолированной и сочетанной чмт и травмы ода , 147
4.1. Клинические показатели у больных при изолированной и сочетанной ЧМТ и травме ОДА при поступлении 148
4.2. Иммунохимические и лабораторные показатели в динамике изолированной и сочетанной ЧМТ и травме ОДА 164
4.3. Иммунохимические показатели в диагностике осложнений травмы и в оценке эффективности МДМ-терапии травматической болезни 204
ГЛАВА 5. Обсуждение полученных результатов 212
Заключение 251
Выводы 262
Практические рекомендации 265
Список литературы 267
- Основные патологические процессы и синдромы острого периода травмы и их молекулярные механизмы
- Маркеры синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания и других нарушений гемостаза и фибринолиза
- Общая характеристика обследованных больных
- Белки крови, перспективные для иммунохимического мониторинга основных процессов травматической болезни
Введение к работе
Актуальность работы. За последние 5 лет летальность только от дорожно-транспортных происшествий в РФ увеличилась на 65% и число погибших, по данным ГИБДД, достигает 33-35 тыс. человек в год [18, 253]. Травма, особенно черепно-мозговая (ЧМТ) и политравма, остаётся одной из ведущих причин смертности и инвалидизации населения [3, 53, 307, 436], а у лиц, не достигших 40 лет, тяжелая сочетанная травма занимает первое место среди причин смерти [28, 142, 253].
Отдельной проблемой социального и медицинского характера является высокая взаимосвязь травматизма с состоянием алкогольного интоксикации пострадавших [79, 90, 215, 253, 294, 305]. Интоксикация этанолом, обнаруживаемая у 35% пострадавших [291], существенно утяжеляет течение травматической болезни и ухудшает прогноз.
Наиболее распространенным сочетанием при политравмах остается комбинация повреждений опорно-двигательного аппарата и головного мозга [253, 291]. Даже в случае изолированной легкой ЧМТ, на долю которой в структуре нейротравмы приходится от 60 до 80%, все более ощутимой становится ее социальная и экономическая цена [149, 155, 162, 290].
Несмотря на очевидные успехи медицинской науки по спасению и реабилитации контингента ранее обреченных больных сохраняется высокий процент смертности и осложнений после тяжелых изолированных, множественных и сочетанных травм [53, 76, 198, 290].
Отсутствие заметного прогресса в лечении этой группы пострадавших привело в 90-х годах к пересмотру взглядов на патогенез травмы и возникновению концепции травматической болезни [34, 82, 114, 136, 243]. Суть ее в том, что вызываемые травмой нарушения витальных функций и параметров гомео-стаза носят закономерный пролонгированный характер и характеризуются однотипностью первичных аварийных регуляторных реакций и адаптационных синдромов, независимо от локализации повреждения [16, 93, 147, 202, 284].
С другой стороны известно [147, 160, 308], что изменения многих показателей метаболизма при ЧМТ отличаются от первичных аварийных регулятор-ных реакций, характерных для травмы опорно-двигательного аппарата (ОДА).
Для решения вопроса о клиническом значении сходства и различий аварийного метаболизма при ЧМТ и травме ОДА полезную информацию можно получить применив чувствительные методы иммунохимического анализа [89, 111, 112, 218], которые пока не находят распространения в ургентной медицине.
Исследования роли иммунохимических показателей в остром периоде травмы должны получить добавочный импульс еще и в силу того, что появление нанотехнологии уже привело к созданию новых экспресс-методов анализа [27, 55, 85, 91, 94, 175, 238, 413, 453] (иммуносенсоры, иммуночипы, количественные и качественные иммунохроматографические тесты, основанные на методах «сухой» химии), отвечающих потребностям медицины критических состояний [98, 198].
Однако, на сегодняшний день спектр иммунохимических тестов, диагностически и прогностически значимых для острого периода ЧМТ и травмы ОДА и пригодных для мониторирования состояния больных, не систематизирован [38,202,301].
Неравномерно исследованы взаимосвязи отдельных белков со степенью выраженности основных синдромов травматической болезни (гипоксия, системный воспалительный ответ, коагулопатия, токсемия и т.д.) [38, 53, 75, 150, 170, 190, 253], не проводилось комплексного изучения взаимосвязи уровня и спектра белков сыворотки с количественной оценкой (в баллах) степени тяжести состояния пострадавших.
Вместе с тем, давно существует и постоянно пополняется широкий выбор маркерных белков для иммунохимического контроля воспалительных и иммунных реакций, септических осложнений, повреждения тканей и органной недостаточности [54, 86, 161, 187, 191, 193, 196, 247, 269, 298, 302, 313, 349].
Роль других белков, таких как СБАГ, транскортин или ПЩФ, в патогенезе травмы практически не исследована, очевидно, по причине отсутствия на эти белки коммерческих тест-систем [24, 101, 258]. Для восполнения этого пробела становится актуальной проблема их выделения, очистки и конструирования моно специфических тест-систем для их количественного анализа.
Систематизация значимых имунохимических индикаторов состояния по-стравматического аварийного метаболизма актуальна как для диагностики и прогнозирования осложнений, так и для оценки результатов оперативного и консервативного лечения. В том числе такого перспективного метода немедикаментозного лечения, как транскутанная электростимуляция головного мозга (ТКЭС), эффективной при лечении сопутствующей травме алкогольной интоксикации [31, 57, 70, 81, 121, 134, 146, 256].
Цель исследования:
Улучшение диагностики и мониторинга состояния пострадавших с травмами головного мозга и опорно-двигательного аппарата путем включения в программу клинико-лабораторного обследования иммунохимических показателей.
Задачи исследования:
Изучить физико-химические свойства альфа-фетопротеина (АФП), плацентарной щелочной фофатазы (ПЩФ), связанного с беременностью альфа2-гликопротеина (СБАГ), транскортина (ТК) и сывороточного альбумина (СА).
Разработать методы выделения и очистки СБАГ, ТК, АФП и ПЩФ и сконструировать иммунохимические тест-системы различной чувствительности для определения СБАГ, ТК и ПЩФ.
Определить связь этих и других белков крови со степенью тяжести травматического эндотоксикоза, гипоксии, системного воспалительного ответа, комы и других патологических синдромов острого периода черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и травмы опорно-двигательного аппарата (ОДА).
J?
Разрабатывать иммунохимические тесты для количественной оценки эндогенной интоксикации, гипоксии, кровопотери и других синдромов.
Проанализировать в динамике травматической болезни взаимосвязь уровней иммунохимических, биохимических и гематологических показателей между собой и с количественной оценкой тяжести повреждения, общего состояния пострадавшего, выраженности алкогольной интоксикации при поступлении, характера последующих осложнений и метода лечения, в том числе транскутанной электроимпульсной стимуляции головного мозга.
Используя методы статистического анализа отобрать диагностически и прогностически значимые лабораторные и иммунохимические показатели, общие и различные для травмы головного мозга и перелома длинных костей.
Новизна исследования:
На основании изучения физико-химических характеристик сывороточных белков, связывающих гидрофобные лиганды, разработан новый общий метод выделения и очистки альфа-фетопротеина (АФП), связанного с беременностью альфа2-гликопротеина (СБАГ), транскортина (ТК) и сывороточного альбумина (СА), основанный на принципах гидрофобной, высаливающей и аффинной хроматографии.
Впервые обнаружена корреляция уровней СБАГ, ТК и СА как со степенью выраженности интоксикационного синдрома (значения МСМ и ЛИИ), так и со степенью выраженности SIRS. Показано, что белки с транспортной функцией в большей степени коррелируют со степенью интоксикационного синдро-, ма, и в меньшей — с SIRS. Для СРБ и других БОФ, не выполняющих транспортную функцию наблюдаются противоположные корреляционные отношения.
Впервые в сыворотках крови больных с выраженным травматическим эн-дотоксикозом обнаружено явление нарастания термостабильной фракции сывороточного альбумина (ТСА), пропорционально степени выраженности эндо-токсикоза. Разработан и внедрен в клиническую практику новый иммунохими-ческий способ определения связывающей емкости альбумина по отношению к
10 низкомолекулярным веществам различного происхождения, являющийся им-мунохимическим способом количественной оценки степени эндогенной интоксикации.
Проведен многомерный статистический анализ уровней биохимических, гематологических показателей и содержания острофазовых, сывороточных и онкофетальпых белков в сыворотках у больных с изолированной и сочетанной ЧМТ и травмой ОДА с количественной оценкой тяжести травмы и общего состояния пострадавших при поступлении и в динамике травматической болезни, в том числе с учетом сопутствующей алкогольной интоксикации (АИ) при поступлении.
Впервые определена диагностическая и прогностическая эффективность определения у больных с изолированной и сочетанной ЧМТ и переломами длинных костей отдельных иммунохимических показателей, а также их комбинаций и отношений (диагностических коэффициентов). С помощью многомерного факторного анализа из числа острофазовых, сывороточных и органоспе-цифических белков отобраны маркеры, эффективные для оценки степени выраженности гипоксии, интоксикации, SIRS, септических осложнений на ранних и поздних стадиях ЧМТ, травмы ОДА и политравмы.
Впервые определена взаимосвязь каждого из отобранных антигенов со степенью выраженности основных патологических синдромов, сопутствующих изолированной и сочетанной ЧМТ и травме ОДА.
Впервые с биохимических и иммунохимических позиций нашел подтверждение синдром взаимного отягощения при сочетанной травме и у пострадавших с СГМ и диафизарными переломами длинных костей на фоне алкогольной интоксикации (АИ) при поступлении. Обнаружены изменения сывороточных уровней железосодержащих белков ферритина и лактоферрина, в сочетании с некоторыми биохимическими параметрами (глюкоза и рОг) перспективные в дифференциальной диагностике этиологии комы.
Впервые для оценки степени гипоксии при тяжелой нейро- и скелетной травме использован иммунохимический тест на фетальный гемоглобин, введен новый информативный показатель: коэффициент отношения HbF/HbA.
Впервые с иммунохимических позиций подтверждена эффективность применения у больных с СГМ и диафизарными переломами длинных костей разновидность транскраниальной электростимуляции мозга — МДМ-терапии.
Положения, выносимые на защиту:
Хроматографические характеристики альбумина, АФП, ПЩФ, СБАГ и ТК на гидрофобных и аффинных сорбентах зависят от ионной силы элюэнта, концентрации и свойств лигандов, что позволяет подбирать условия для их выделения и очистки. Характеристика очищенных препаратов АФП, ПЩФ, СБАГ и ТК и иммунохимических тест-систем для их определения.
Термостабильность транспортных белков сыворотки изменяется в присутствии лигандов, в том числе эндотоксинов известного и неизвестного составов. Это явление повышения термостабильности альбумина может быть использовано как тест для диагностики степени эндогенной и экзогенной интоксикации в клинической практике.
Уровни острофазовых, сывороточных и органоспецифических белков в сыворотках пострадавших, биохимические и гематологические показатели крови в динамике острого периода изолированной травмы головного мозга и переломов длинных костей в зависимости от степени тяжести травмы и степени тяжести состояния пострадавших при поступлении. Особенности изучаемых показателей в остром периоде нейро- и скелетной травмы на фоне алкогольной интоксикации при поступлении и во взаимосвязи с проводимой МДМ-терапией.
Взаимосвязь изучаемых иммунохимических показателей пострадавших с данными биохимических и гематологических исследований в динамике острого периода изолированной и сочетанной ЧМТ и травмы ОДА. Иммунохими-ческие показатели, эффективные для оценки основных патологических синдро-
12 мов травматической болезни: маркеры степени выраженности гипоксии, интоксикации, SIRS, репаративных процессов, осложнений травмы ОДА и ЧМТ.
Научно-практическая значимость:
Предложенные схемы выделения и очистки белков с помощью хроматографии на аффинных и гидрофобных носителях позволяют получать очищенные препараты ШЦФ, СБАГ и ТК для конструирования иммунохимических тест-систем.
Установлено, что изолированная и сочетанная ЧМТ и травма ОДА сопровождаются эндогенной интоксикацией, пропорциональной степени тяжести повреждения. Отмечено повышение в крови тяжелых больных термостабильной фракции сывороточного альбумина в 1,5-2,5 раза. Это факт реализован в «способе определения связывающей емкости альбумина человека», который может быть использован как для исследования межмолекулярных взаимодействий типа «лиганд-альбумин» в эксперименте, так и для диагностики степени интоксикации в клинической практике.
По результатам исследований разработан и внедрен ряд диагностических тестов для иммунохимической оценки степени интоксикации и системного воспалительного ответа, степени тяжести политравмы, степени гипоксии при ЧМТ, степени травматического повреждения головного мозга, а также способ оценки эффективности МДМ-терапии при травматической болезни.
Предложен иммунохимический «способ оценки адаптационных реакций у травматологических больных» по результатам определения и последующего вычисления соотношения острофазовых белков (СРБ и СБАГ) и онкомаркеров (АФП и ПЩФ).
Иммунохимические экспресс-тесты на СБАГ, HbF, АФП, ПЩФ, ферри-тин, лактоферрин, а2-макроглобулин, продукты деградации фибриногена могут найти применение в качестве критериев эффективности лечения травматической болезни мозга и ОДА.
13 Внедрение результатов работы в практику:
Разработанные в диссертации методики и полученные результаты внедрены в практическую деятельность отделения анестезиологии и реанимации, нейрохирургического, травматологического отделений МУЗ «Городская клиническая больница №3» г.Астрахани, МНТК «Экологическая медицина» «Аст-раханьгазпрома», МУЗ «Станция скорой медицинской помощи» г.Астрахани, отделения реанимации МУЗ «Клинический родильный дом» г.Астрахани.
Материалы научных исследований используются в научных разработках и в педагогическом процессе на всех факультетах на кафедрах биологии, биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, патологической физиологии, нервных болезней, травматологии и ортопедии Астраханской государственной медицинской академии.
Апробация работы:
Основные положения диссертации доложены на заседаниях кафедры биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, научно-практических конференциях сотрудников медицинской академии (Астрахань, 2000-2008); на заседаниях Астраханского областного научного общества травматологов-ортопедов (Астрахань, 2000-2005) и областного научного общества врачей скорой помощи (Астрахань, 2004-2007); на заседании проблемной комиссии ГОУ ВПО АГМА «Теоретическое и практическое изучение белков маркеров патологических состояний», 2004.
Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Влияние антропогенных факторов на морфогенез и структурные преобразования органов», Астрахань, 1991; международной конференции «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза человека в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье населения. Актуальные проблемы биологии и медицины», Астрахань, 2000, 2007; на V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001»; на III съезде биохимического общества РАН, Санкт-Петербург, 2002; на VII съезде травматологов-ортопедов Белоруссии, Гомель,
14 2002; на 2-й и 3-й научно-практической конференции и школе-семинаре для молодых ученых с международным участием «Белки-маркеры патологических состояний», Астрахань-Москва, 2001, 2003; на научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», Астрахань-Москва, 2004, Астрахань-Волгоград-Москва, 2006; на VIII Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря», Астрахань, 2005; Всероссийской конференции, посвященной 85-летию Астраханского областного научного общества хирургов (Астрахань, 2006); на научно-практическом Симпозиуме "Национальные дни лабораторной медицины России" (Москва, 2007, 2008) и Объединенном Иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2008).
По теме диссертации опубликовано 55 научных работ, в том числе, 13 в рецензируемых научных изданиях, выпускаемых центральными издательствами.
Основные патологические процессы и синдромы острого периода травмы и их молекулярные механизмы
Основной причиной крайне тяжелого и критического состояний пострадавших в раннем периоде остается острая кровопотеря и травматический шок [53,148, 253, 309]. Первый период политравмы (до 2-х сут.) — период острой реакции на травму, соответствует периоду травматического шока и раннему постшоковому периоду, характеризуется выраженной гиповолемией, достигающей 30-40% от должного ОЦК, и перфузионным дефицитом [34, 129].
Причинами большой кровопотери и последующего развития постгеморрагической гипохромной анемии чаще всего являются травматические отрывы конечностей, открытые переломы, переломы таза с нарушением целостности тазового кольца, множественные сложные переломы крупных сегментов конечностей (бедро, голень, плечо) [203]. Однако, у большинства пострадавших развивается анемия не соответствует объему кровопотери [129, 242], в том числе и при ЧМТ, где кровопотеря практически отсутствует [53, 60, 301].
В ответ на механическую шокогенную травму и кровопотерю в организме возникает ряд сложных адаптационных реакций, направленных на сохранение жизнедеятельности организма. В их основе лежит мобилизация всех систем организма, в первую очередь — нервной и эндокринной, сердечно-сосудистой и иммунной [18, 82, 147, 160, 202, 284].
Ведущий патологический процесс первого периода ТБ — гипоксия, которая сохраняется на тканевом уровне до 5-7 суток и является основой формирования последующих патологических процессов и осложнений ТБ [32, 45, 53, 253, 276]. Гипоксия, в том числе в результате анемии, и повышенное разрушение эритроцитов поддерживают гиперагрегацию и нарушения микроциркуляции, что способствует развитию осложнений и замедлению репарации ран [5, 136, 188, 308]. Продукты разрушения эритроцитов (гемин) оказывают депрессивное влияние на Т-лимфоциты [131, 144], способствуя снижению и замедлению восстановления иммунитета, а тем самым — инфекционным и аутоиммунным осложнениям [157, 252, 284].
Об анемии можно говорить тогда, когда уровень гемоглобина крови снижается ниже 100 г/л при гематокрите 35% и более [131]. Если в результате кровопотери гематокрит низкий, то уровень гемоглобина тоже будет низким, и, чтобы узнать истинный уровень гемоглобина, необходимо его пересчитать для гематокрита 30%. Например, у пациента с политравмой при гематокрите 20% уровень гемоглобина равен 60 г/л [53, 253].
Определение ведущего звена патогенеза анемии в остром периоде травматической болезни имеет определенные сложности. Помимо кровопотери при травме, в ходе операции и нередко в результате паренхиматозных кровотечений, на содержание эритроцитов, концентрацию гемоглобина, гематокритное число могут оказывать влияние патологическое депонирование крови, экстра 17 васкулярная транслокация жидкости, характер и темпы инфузионно-трансфузионной терапии, объем и скорость диуреза и др. [18, 53, 75].
Сам синдром массивной кровопотери проявляется в дисбалансе между доставкой и потреблением кислорода [18, 82, 202]. Несоответствие между высоким уровнем потребления кислорода и относительно низким уровнем его доставки ведет к развитию дефицита кислорода в клетках, степень которого в итоге определяет тяжесть и исход патологического процесса. При этом накопление недоокисленных продуктов обмена в клетке способствует дисбалансу кислотно-основного равновесия (КОР) крови и, как следствие, отеку органов и тканей [160, 198]. Нарушения КОР крови и электролитного баланса становятся определяющей причиной ПОН. Полиоргаиная недостаточность, развившаяся вследствие массивной кровопотери сопровождалась выраженным метаболическим алкалозом (рН до 7,56; BE до 12 ммоль/л) с гипокалиемией (до 2,7 ммоль/л) и гипокальциемией (до 0,65 ммоль/л) [159, 293, 439, 451].
Выраженная степень циркуляторной гипоксии, развивающаяся в результате системной и местной гипоциркуляции в остром периоде ТБ, запускает развитие эндогенной интоксикации и способствует нарушению ферментативных процессов в клетках, вплоть до их апоптоза [74, 231, 262], следствием которой является возникновение ПОН.
Нарушения микроциркуляции и как следствие тканевая гипоксия и шок при тяжелой механической травме [18, 148, 300] возникают за счет дисфункции гладкой мускулатуры (ГМ), которая проявляется в патологическом сокращении (вазоспазм) или расслаблении (вазодилатация) ГМ микрососудов [248].
В первом периоде политравмы для восстановления гомеостаза включаются мощные энергетические механизмы срочной адаптации, меняющие характер основного, углеводного, белкового, жирового обмена (синдром гиперметаболизма). Пусковым фактором в развитии гиперметаболизма являются медиаторы повреждения. Среди них выделяют цитокины, медиаторные и гормональные амины, эйкозаноиды, кинины, оксид азота, энзимы, продукты перекисного окисления липидов. Наибольшим гиперкатаболическим эффектом обладает ци-токин — фактор некроза опухоли (TNF) [105, 116, 147, 160, 202, 262, 298].
Если механизмы адаптации истощаются, то наступает декомпенсация (смерть), либо, при адекватном лечении, наступает неустойчивая компенсация гомеостаза, и ТБ переходит во второй период своего течения.Выявлено, что при шоке имеет место гипокальциемия, гипопротеинемия, диспротеинемия, дисферментемия и выраженная интоксикация [15, 56, 78, 90]. Наиболее существенно повышалась активность креатининкиназы, АсТ, АлТ, ЛДГ. В меньшей степени росла активность фосфатазы, ДНК-азы, ГТТ [90].
Гипопротеинемия, вызывающая снижение онкотического давления крови, клинически выражется признаками отека внутренних органов, прежде всего легких и головного мозга [160, 202]. Повышение энергетических потребностей приводит к изменению характера энергетического обмена. Запасов углеводов в стрессовой ситуации хватает лишь на несколько часов [202, 284]. По мере их использования в метаболизм вовлекается жировое депо. В результате в тканях увеличивается содержание свободных жирных кислот, нарушается усвояемость их тканями. В связи с этим наступает интенсивное использование белка не для пластических и транспортных, а для энергетических целей [114].
Если учесть, что все эти процессы происходят на фоне нарушения кровообращения в печени и кишечнике [82], где осуществляются механизмы сборки макромолекул из липидов крови и белков, то в этой ситуации происходит синтез преимущественно хиломикронов и липопротеидов низкой плотности, содержащих наибольшее количество липидов и наименьшее количество белка, стабилизирующего липидную мицеллу, и представляющих наибольшую опасность в формировании жировой эмболии [316, 414].
Маркеры синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания и других нарушений гемостаза и фибринолиза
Травматическая болезнь часто сопровождается развитием тромботиче-ских осложнений, что обусловлено поступлением в кровоток высокоактивных тромбопластических субстанций, продуцируемых поврежденной тканью [50, 60, 114, 135, 253, 284, 304, 308]. Кроме того, на различные виды стресса и гипоксии система свертывания крови отвечает принципиально единой универсальной реакцией повышения свертываемости крови в сочетании с усилением фибринолиза [5, 20, 97, 103, 188, 214].
Катаболические сдвиги с активацией протеолитических процессов сопровождаются полиморфноядерным лейкоцитозом и выбросом в кровь лизосо-мальных ферментов, в кровоток поступают активаторы плазминогенеза, тканевые лизокиназы, протеолитические ферменты [20, 49, 198, 202, 262]. Многочисленными исследованиями показано, что при развитии патологического процесса, характеризующегося внутрисосудистым свертыванием крови, процесс трансформации фибриногена в фибрин ограничивается на промежуточном этапе, а в кровотоке начинают циркулировать продукты деградации фибрина (ПДФ) [20, 49, 87, 103, 304]. Соединяясь с мономерами фибрина, фибриногеном, они образуют растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК). Обнаружение в сосудистом русле РФМК свидетельствует о присутствии в кровотоке активных белков — тромбина и плазмина [20, 49, 152, 194]. Уровень РФМК в крови определенного фенантролиновым методом в норме со-ставил менее 4 10" г/л.
Для экспресс-исследований основных параметров гемостаза сегодня существует широкий выбор аппаратуры, начиная от рабочих станций и кончая портативными приборами самоконтроля MHO. Помимо вискозиметрической и электромагнитной системы детекции рабочая станция может комплектоваться биохимическими реагентами для автоматического определения фибриногена, факторов сверывания, протеинов S и С, гепарина, волчаночных антикоагулянтов и других клоттинговых тестов [175, 238].
Иммунохимически выраженность внутрисосудистого свертывания оценивают по уровню в крови маркеров образования фибрина и активации тромбоцитов: ПДФ, РКФМ, (З-тромбоглобулина, фактора 4 тромбоцитов, фибрино-пептида А и, особенно Д-димера [20, 152, 194]. Продукты деградации фибриногена/фибрина (ПДФ) образуются в организме при активации системы фибринолиза (взаимодействия плазмина с фибриногеном и фибрином), которая развивается в ответ на внутрисосудистое фибринообразование [20, 49, 87, 103, 194].
Активный плазмин вызывает последовательное асимметричное расщепление фибриногена/фибрина. Вначале от их а- и 3-цепей отщепляются низкомолекулярные фрагменты. После их отщепления в плазме остается крупномолекулярный фрагмент X, который еще сохраняет способность образовывать фибрин (свертываться) под влиянием тромбина. Затем под действием плазмина фрагмент X расщепляется на фрагменты Y и D, а фрагмент Y — на фрагменты D и Е. Крупномолекулярные фрагменты фибринолиза (фрагменты X и Y) получили название «ранние», а фрагменты DHE:— «поздние», или конечные. Эти фрагменты расщепления фибриногена и фибрина называются ПДФ [20, 49, 87, 103].
ПДФ обладают антитромбопластиновым, антитромбиновым и антиполи-меразным действием, вызывают хемотаксис лейкоцитов и гранулоцитов, уве 39 личивают проницаемость сосудов и обладают иммуносупрессивным действием [87]. У здорового человека концентрация ПДФ в плазме 5-Ю мг/л [194, 257, 282]. Обнаружение повышенного содержания ПДФ — ранний диагностический признак ДВС-синдрома. Определение ПДФ в плазме крови может быть диагностическим показателем закупорки сосудов, которую трудно определить клинически [193]. Увеличение ПДФ бывает при легочной тромбоэмболии, инфаркте миокарда, тромбозах глубоких вен, в послеоперационном периоде, при осложнениях беременности (отслойка плаценты, эклампсия), у больных с различными злокачественными новообразованиями, лейкозами, при острой и хронической почечной недостаточности, обширных травмах, ожогах, шоке, инфекционных заболеваниях, септицемии, коллагенозах, парапротеинемиях и др. [19, 152, 194, 257].
Постоянное обнаружение ПДФ имеет большое значение в диагностике хронической формы ДВС-синдрома [20]. D-димер. При расщеплении волокон фибрина образуются фрагменты — D-димеры. Содержание D-димера в плазме в норме меньше 0,5 мкг/мл [194]. Выявление в плазме крови D-димера свидетельствует об активации в ней фибринолиза. Определение в плазме D-димера используется для исключения тромбоза и диагностики ДВС-синдрома. Если концентрация D-димера в плазме менее 0,5 мкг/мл, наличие тромбоза (легочной артерии, глубоких вен и др.) у больного можно исключить [193]. Повышенные значения D-димера в плазме могут быть при инфаркте миокарда, злокачественных опухолях, заболеваниях печени, активном воспалительном процессе.
Общая характеристика обследованных больных
Изучение иммунохимических показателей проведено в период с 2000 по 2007 годы на контингенте больных мужского и женского пола в возрасте от 19 до 70 лет (472 чел.) с изолированными и сочетанными черепно-мозговыми травмами и переломами длинных костей нижних конечностей.
Больные с травмами опорно-двигательного аппарата (ОДА) в зависимости от степени тяжести повреждений были распределены на три группы (табл.2). В первую группу (ОДА I) вошли 143 больных (59 женщин и 84 мужчины) с закрытыми переломами диафиза берцовой кости или дистального отдела костей голени (одной лодыжки). Шокогенность травмы по Цибину [292] — 0,1 балла, тяжесть повреждений по AIS и ISS — 2 балла. Все больные находились в удовлетворительном клиническом состоянии; влияющих на исход травмы сопутствующих заболеваний у них не обнаружено.
Во вторую группу (ОДА II) были включены 82 больных (40 женщин и 42 мужчины) с закрытыми переломами диафиза и проксимального отдела бедра, осложненные непродолжительным периодом шока I степени, обеих костей го 57 лени, множественными, открытыми или оскольчатыми переломами костей голени. Шокогенность травмы по Цибину не выше 2-х баллов, тяжесть повреждений по AIS — 2-3 балла (2,5±0,06). Больные находились в клиническом состоянии средней тяжести. В третью группу (ОДА III) вошли 40 больных (12 женщин и 28 мужчин) с закрытыми и открытыми диафизарными переломами бедра и с множественными переломами длинных костей нижних конечностей, осложненными шоком II-III степени тяжести. Шокогенность травмы по Цибину до 6 баллов, тяжесть повреждений по AIS 3-4 балла (3,7±0,07).
Диагноз СГМ ставили в соответствии с принятой единой классификацией острой ЧМТ [126]. Больные с ЧМТ условно были разделены на две группы (табл.2). В группу пациентов с легкой черепно-мозговой травмой (ЧМТ I) были включены больные с сотрясением головного мозга — 30 человек (8 женщин и 22 мужчины) и ушибом головного мозга легкой степени — 22 человека (5 женщин и 17 мужчин). В этой группе больных у 5 пациентов было диагностировано субарахноидальное кровоизлияние, перелом свода черепа — у 5, и переломы костей лицевого черепа — у 8, средняя оценка по шкале комы Глазго на момент поступления в клинику составила 13,7±0,09 балла и 2,4±0,07 балла по международной шкале повреждений AIS. Клиническая симптоматика поражения нервной системы носила нестойкий характер, характеризовалась наличием рассеянной микроорганикой и симптомами вегетативной дисфункцией.
Группу с тяжелой черепно-мозговой травмой (ЧМТ II) составили 90 пациентов, из которых 41 пациент с ушибом головного мозга средней степени тяжести (5 женщин и 36 мужчин) и 49 с тяжелым ушибом и сдавлением головного мозга (8 женщин и 41 мужчина), у 45 пациентов из этой группы было диагностировано субарахноидально-паренхиматозное кровоизлияние, у 8 — эпиду-ральная гематома, у 10 — субдуральная гематома, у 1 пациента внутримозговая гематома, переломы свода черепа были выявлены у 19 пострадавших, основания черепа у 10, переломы лицевого черепа — у 5, средняя оценка по шкале комы Глазго на момент поступления в клинику составила 8,0±0,19 и колебалась от 10 до 5-4 баллов по шкале AIS. больные ОРИТ, с заболеваниями: 10 распространенный перитонит: 4 сепсис: 6 Доноры 68 ВСЕГО 550 Группа пациентов с сочетанной ЧМТ (табл.2) включала 65 больных, из них 36 пациентов — с диагнозом ушиб головного мозга средней степени тяжести (балл ЧМТ по AIS—4) и 29 больных с диагнозом тяжелый ушиб головного мозга (AIS—4) в сочетании с переломами бедра (AIS—3-4) и костей голени (AIS—2). Пострадавшие с ЧМТ, сочетанной с травмой нижних конечностей легкой степени, соответствующей 1 баллу по системе AIS (ушибы, ссадины, растяжения связок) квалифицировались как пострадавшие с изолированной ЧМТ. Пострадавшие с сочетанными травмами других областей тела в обследование не включались. Средняя балльная оценка тяжести повреждений в группе пациентов с сочетанной ЧМТ составила по шкале AIS — 6,8±0,09 баллов (из них 4 балла — вклад ЧМТ), по шкале тяжести политравм ISS — 22,6±0,76 и по шкале комы Глазго — 7,3±0,20, что соответствует тяжелой сочетанной травме [253]. У большинства больных с тяжелой сочетанной черепно-мозговой травмой выявлялись очаговые симптомы базально-стволового уровня, в ряде случаев поражение внутренней капсулы.
Структура политравмы в этой группе такова: сочетания ЧМТ II с ОДА I выявлено у 27 из 15 больных, с ОДА II — у 26 из 15, с ОДА III— у 12 пострадавших. Часть пациентов с тяжелой сочетанной ЧМТ (8 человек), за которыми велось наблюдение, на момент поступления находились в бессознательном состоянии вследствие ЧМТ, полученных в дорожно-транспортных происшествиях, в результате избиений или при падении с высоты.
Все эти больные находились на аппарате искусственной вентиляции лёгких в различных режимах. Мониторинг проводился кардиомонитором с почасовой регистрацией показателей температуры, ариального давления и частоты сердечных сокращений (ЧСС); наблюдения фиксировались в течение трёх суток. Контрольной группой сравнения для пострадавших с тяжелой сочетанной ЧМТ являлись больные с заболеваниями нетравматического генеза, находившихся в ОРИТ в критических состояниях (табл.2).
Белки крови, перспективные для иммунохимического мониторинга основных процессов травматической болезни
В настоящее время для клинической оценки течения практически любых заболеваний существует огромное количество маркерных белков различных групп, применяемых изолированно или в комбинациях между собой или с другими лабораторными показателями: уровень иммуноглобулинов в целом или аутоантител и циркулирующих иммунных комплексов в частности [96, 180], цитокины [209, 246, 298, 456], компоненты системы комплемента [122, 382], лизоцим и другие белки неспецифической резистентности организма [86, 218], стресс-белки [173, 272], острофазовые белки (БОФ) различных групп [10, 86, 154, 181, 187, 196, 205, 225, 271], сывороточные ингибиторы протеолиза [36], факторы свертывающей системы крови и фибринолиза [19, 20, 193], молекулы эндотоксинов [52], белки с транспортной функцией [164, 187, 233, 267], компоненты ПОЛ-АОС [153], органоспецифические белки и ферменты [26, 161, 286, 302], онкофетальные [1, 48, 113, 263, 369], канцероплацентарные [265, 343, 344, 363] и другие антигены. С открытием новых маркеров этот перечень непрерывно пополняется [269, 313].
Диагностическая эффективность и значимость отдельных маркеров для контроля воспалительных и иммунных реакций, септических осложнений, деструктивных процессов и органной недостаточности, степени эндотоксикоза и т.д. для различных патологических синдромов варьирует в широких пределах [43,44,72,73]. 1.3.1. Сывороточные и острофазовые белки Среди сывороточных белков, определяемых иммунохимическими методами в клинике, иммуноглобулины являются бесспорным лидером, а определение уровней IgG, IgA и IgM относится к стандартным методам оценки иммунного статуса [96, 194, 218, 297], в том числе и в ургентной травматологии [193].
Среди БОФ основное место занимают гликопротеиды, как вырабатываемые печенью, так и появляющиеся, в результате деструктивных процессов [196]. С-реактивный белок (СРБ). СРБ — а-глобулин, минорный белок плазмы. Белок получил название благодаря способности к преципитации пневмококкового полисахарида С в присутствии Са2+ [151, 225, 269, 273]. В присут-стии кальция СРБ связывает лиганды в полисахаридах микроорганизмов и вызывает их элиминацию.
Молекула СРБ из БОФ семейства пентраксинов состоит из пяти некова-лентно связанных безуглеводных субъединиц (каждая с молекулярным весом 21000), которые соединены нековалентно [196, 225]. Имеются работы, которые показывают, что СРБ является хорошим лигандом для фосфорилхолина, который входит в состав молекулы фактора агрегации тромбоцитов и благодаря этому предотвращает лизис этих клеток, а также выход арахидоновой кислоты, лейкотриенов — медиаторов воспаления и гидролиз липидов за счет ингибиро-вания фосфолипаз [225].
СРБ представляет интерес для ургентной травматологии как стандартный маркер SIRS. Тест на СРБ производится в двух вариантах: обычном и высокочувствительном (hsCRP). СБАГ (связанный с беременностью альфа-2-гликопротеин) был обнаружен в 1959 году Smithies O.U. [323, 440] при электрофоретическом разделении в крахмальном геле сыворотки крови беременных женщин. Концентрация СБАГ в сыворотке крови беременных становится максимальной к концу беременности (0,5-2,0 г/л). После родов уровень СБАГ быстро падает, возвращаясь к нормальным для небеременных женщин величинам через 6-8 недель после родов [64]. У взрослых концентрация СБАГ в сыворотке крови варьирует от 0,1 до 6 мг/л [100]. СБАГ не является строго гравидарным белком [386] и значительное повышение концентрации этого белка в крови, наблюдается также при воспалении, опухолях, заболеваниях крови [100, 101, 102, 266]. Повышение продукции СБАГ выше 5,0 мг/л является признаком патологических сдвигов в организме и указывает на наличие воспалительного или опухолевого процесса в организме [338]. При активном воспалительном процессе концентрация СБАГ в сыворотке крови достоверно повышается до 23,6 мг/л [344]. Установлено, что уровень этого белка повышается пропорционально возрасту и у небеременных женщин в 2-5 раз больше, чем у мужчин соответствующего возраста. Уровень СБАГ в сыворотке крови колеблется на протяжении менструального цикла. Предполагается, что это обусловлено стимулирующим действием эстрогенов [100, 101, 444, 450]. СБАГ выявляется на всем протяжении воспаления, что позволяет отнести его к индикаторам и латентных форм воспаления [344]. Имеются единичные сведения об уровнях СБАГ у больных с ожогами и травмами [182, 256]. Исследований, касающихся роли СБАГ в патогенезе травматической болезни мы не обнаружили. Представляет интерес изучение СБАГ как индикатора SIRS при травме в сравнении общеизвестными лабораторными тестами: СРБ, СОЭ, лейкоцитозом. СБАГ является гликопротеидом, содержащим 12,2% углеводов. Белок является димером с молекулярной массой около 350 кД, или тетрамером с массой 720 кД. Изоэлектрическая точка — 4,7 [435]. Его молекула построена, соответственно, из 2-х или 4-х идентичных субъединиц с молекулярной массой по 180 кД, соединенных между собой ди-сульфидными мостиками. Каждая субъединица состоит из двух фрагментов с молекулярной массой 120 и 60 кД [100, 435]. Несмотря на достаточно несложную процедуру получения моноспецифических антисывороток к СБАГ, выделение самого белка в чистом виде представляет определенные трудности [100, 143, 435], связанные прежде всего с тем, что СБАГ имеет сходную структуру и физико-химические свойства с некоторыми сывороточными и плацентарными белками (альфа2-макроглобулин, РАРР-А и др.) [434]. Применение для выделения СБАГ из сыворотки крови беременных женщин сочетания методов осаждения сульфатом аммония и риванолом, гель-фильтрации на сефадексе G-200, ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексах и препаративного электрофореза в ПААГ и даже электрофокусирования с использованием амфолинов не позволяет получить препарат СБАГ высокой степени чистоты [435]. Только дополнительная очистка методами аффи-ной хроматографии (иммуносорбенты, металлохелатная хроматография) позволяла получать иммунохимически чистый препарат СБАГ. Мальцева Н.В. и соавт. [168] получали препарат СБАГ высокой степени чистоты (более 95%) путем последовательного применения Zn-хелатной хроматографии и негативной иммуносорбционной хроматографии. Показана связь СБАГ со стероидными гормонами [416], что открывает новые возможности для очистки этого. После того, как была обнаружена способность СБАГ образовывать комплексы с протеиназами и менять их ферментативную активность [353, 368, 390], СБАГ стали относить к группе так называемых "ингибиторов протеиназ". Эти данные также могут быть использованы для аффинной хроматографии СБАГ.
