Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Участие активных форм кислорода и азота в развитии ожоговой болезни (обзор литературы) 14
1.1. Краткая характеристика патогенеза ожоговой травмы 14
1.2. Образование и роль активных форм кислорода и азота в организме 17
1.2.1. Строение и химия активных форм кислорода и азота 17
1.2.2. Основные пути образования активных форм кислорода и азота в организме.. 19
1.2.3. Токсичность активных форм кислорода и азота 20
1.2.4. Система антиоксидантной защиты 22
1.3. Образование активных форм кислорода при ожоговой травме 29
1.3.1. Влияние ожоговой травмы на микроциркуляцию в зоне повреждения и инициация роста продукции активных форм кислорода 29
1.3.2. Активация радикал-продуцирующей активности нейтрофилов при ожоговой травме 33
1.3.3. Продукты распада и термической модификации обожженной ткани как стимуляторы активности нейтрофилов 39
1.3.4. Регуляторная роль цитокинов при ожоговой травме 41
1.3.5. Роль циклооксигеназы и метаболизма арахидоновой кислоты в образовании активных форм кислорода при ожогах 43
1.3.6. Влияние эндотоксемии на образование активных форм кислорода и азота при ожогах 44
1.3.7. Провоспалителыюе действие активных форм кислорода и азота 48
1.3.8. Связь между активными формами кислорода и протеазной активностью в крови и тканях при ожогах 51
1.4. Участие активных форм кислорода и азота в процессах ранозаживления...52
1.5. Значение активных форм кислорода и азота в развитии полиорганной недостаточности при ожоговой болезни 62
1.5.1 Активация перекисного окисления липидов и состояние системы антиоксидантной защиты при тяжелых ожогах 62
1.5.2 Синдром полиоргашюй недостаточности при ожогах 64
1.5.3 Ожоги и повреждение легких 65
1.5.4 Ожоги и болезни желудочно-кишечного тракта 66
1.6. Влияние хирургии и терапии на продукцию активных форм кислорода и азота 68
1.6.1. Влияние хирургического лечения на продукцию активных форм кислорода и азота нейтрофилами 68
1.6.2. Влияние плазмофереза на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами 72
1.6.3. Эффекты антиоксидантной терапии при ожогах 73
1.6.4. Влияние антиоксидантов на процессы ранозаживления 80
1.7. Резюме 82
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 84
2.1. Реактивы 84
2.2. Клинические методы исследования 84
2.2.1. Характеристика групп больных 84
2.2.2. Характеристика групп пациентов, перенесших пластические операции 85
2.2.3. Схемы забора материала для биохимических исследований 85
2.3. Экспериментальные методы исследования 86
2.31. Моделирование ожоговой травмы у крыс 86
2.3.2. Моделирование ожоговой травмы, осложненной эндотоксемией, у крыс 87
2.3.3. Моделирование эндотоксемии у крыс 87
2.3.4. Забор экспериментального материала у животных в модели ожоговой травмы 87
2.3.5. Моделирование полнослойной эксцизионной раны у крыс 87
2.3.6. Изучение местного ранозаживляющего действия фитопрепарата на основе ферментированной папайи 88
2.3.7. Изучение эффектов комплекса витамипов-антиоксидантов и аминокислот при ожоговой травме у крыс 88
2.3.8. Изучение эффектов комплекса витаминов-антиоксидантов и аминокислот при эндотоксемии у крыс 88
2.3.9. Изучение эффектов комплекса витаминов-антиоксидантов и аминокислот при экспериментальных ожогах, осложненных эндотоксемией, у крыс 89
2.4. Лабораторные методы исследования 89
2.4.1 Забор образцов крови у пациентов и доноров 89
2.4.2. Забор образцов крови у экспериментальных животных 89
2.4.3. Выделение и подготовка к анализам исследуемых компонентов крови 89
2.4.4. Забор и подготовка к анализам образцов кожи, струпов, ткани раны и легких экспериментальных животных 91
2.5. Методы оценки продукции активных форм кислорода клетками крови 91
2.6. Биохимические методы анализа 92
2.6.1. Методы определения активности антиоксидантних ферментов 92
2.6.1.1.Оценка активности каталазы 92
2.6.1.2.Оценка активности супероксиддисмутазы 92
2.6.1.3. Оценка активности глутатионпероксидазы 93
2.6.1.4. Оценка активности глутатион-8-трансферазы 95
2.6.2. Оценка активности миелопероксидазы 95
2.6.3. Определение общей антиокислительной активности плазмы 96
2.6.4. Оценка содержания ТБК-активных продуктов в плазме и гомогенатах тканей.. 97
2.6.5. Определение общего содержания белка 97
2.6.6. Оценка содержания гемоглобина 97
2.6.7. Оценка железо-связывающей способности плазмы 98
2.6.8. Оценка количества восстановленного глутатиона 98
2.7. Модельные системы для изучения антиоксидантних свойств препаратов in vitro 98
2.7.1. Система генерации супероксидного радикала (ксантин-ксантин оксидаза) 98
2.7.2. Оценка влияния исследуемых препаратов на активность ксантин оксидазы 98
2.7.3. Система генерации гидроксильного радикала (FeS04-H202) 99
2.7.4. Оценка эффектов препаратов в модельной системе липидной пероксидации...99
2.7.5. Система оценки эффектов препаратов на хемилюминесценцию клеток крови 99
2.8. Статистическая обработка результатов 100
ГЛАВА 3. Результаты исследования 101
3.1. Клинико-лабораторное исследование хемилюминеснентной и антиоксидантной активности крови пациентов с ожогами 101
3.1.1. Результаты измерения хемилюминесценции изолированных нейтрофилов периферической крови пациентов с ожогами 102
3.1.2. Сравнительная оценка хемилюминесценции цельной крови и изолированных нейтрофилов здоровых доноров 104
3.1.3. Результаты анализа хемилюминесценции цельной крови пациентов с ожогами 108
3.1.4. Результаты оценки активности антиоксидантных ферментов эритроцитов у пациентов с ожогами 115
3.1.5. Анализ изменения антиокислителыюй и железосвязывающей активности плазмы у пациентов с ожогами 117
3.1.6. Исследование влияния хирургической некрэктомии на хемилюминесценцию нейтрофилов 119
3.1.7. Исследование эффектов хирургической травмы кожи и мягких тканей лица на хемилюминесценцию лейкоцитов 121
3.2. Экспериментально-лабораторное исследование влияния ожоговой травмы нахемилюминесцентную и антиоксидантную активность крови крыс и показатели тканевого воспаления 123
3.2.1. Оценка хемилюминесценции цельной крови в модели термической травмы у крыс 124
3.2.2. Оценка показателей антиоксидантной активности крови экспериментальных животных после ожоговой травмы 125
3.2.3. Оценка влияния липополисахарида на хемилюминесцентную и антиоксдантную активность крови экспериментальных животных с ожоговой травмой 127
3.2.4. Оценка влияния эндотоксемии на показатели про- и антиоксидантных систем крови у крыс 129
3.2.5. Изменение активности миелопероксидазы в ткани легких и тонкой кишки при экспериментальных ожогах 132
3.3. Экспериментально-лабораторное исследование про- и антиоксидантных свойств кожи при ожогах, эндотоксемии и хирургических ранах
3.3.1. Изучение влияния ожога на активность про- и антиоксидантных ферментов в зоне повреждения 134
3.3.2. Изучение реакции кожи вблизи зоны повреждения при ожоговой травме 138
3.3.3. Изучение влияния интраперитонеалыюго введения липополисахарида на активность про-и антиоксидантных ферментов в коже животных 140
3.3.4. Исследование динамики изменения про- и антиоксидантных ферментов кожи и ткани раны при экспериментальных ожогах 141
3.3.5. Изучение влияния полнослойной эксцизионной раны на активность про- и антиоксидантных ферментов в коже животных 147
3.3.6. Анализ изменения активности миелопероксидазы, СОД и каталазы в коже пациентов при операциях по подтяжке тканей лица 151
3.4. Исследование антиоксидантної! активности комплексных препаратов in vitro 153
3.4.1. Эффекты комплекса витаминов-антиоксидантов и аминокислот в модельных системах 153
3.4.2. Эффекты фитопрепарата на основе ферментированной папайи в модельных системах 155
3.5. Изучение эффектов комплексных антиоксидантных препаратов в эксперименте 157
3.5.1. Изучение действия комплекса витаминов-антиоксидантов и аминокислот на параметры про- и антиокидантных систем крови животных при экспериментальных ожогах 158
3.5.2. Влияние комплекса витаминов-антиоксидантов и аминокислот на свойства кожи
при экспериментальных ожогах 163
3.5.4 Эффекты местного применения фитопрепарата на основе ферментированной папайи при ожогах у крыс 168
3.6. Исследование влияния комплекса витаминов-антиоксидантов и аминокислотна показатели про- и антиоксидантных систем крови у детей с ожогами 170
ГЛАВА 4. Заключение 174
Выводы 185
Список литературы 187
- Краткая характеристика патогенеза ожоговой травмы
- Влияние эндотоксемии на образование активных форм кислорода и азота при ожогах
- Выделение и подготовка к анализам исследуемых компонентов крови
- Исследование динамики изменения про- и антиоксидантных ферментов кожи и ткани раны при экспериментальных ожогах
Введение к работе
Актуальность проблемы. Высокий риск осложнений при тяжелых ожоговых травмах в настоящее время все чаще связывают с развитием у пострадавших синдрома системного воспалительного ответа [Sheridan R.L., 1998; Самойленко Г.Е., 2000; Шанин Ю.Н., 2003]. Термическая травма вызывает выброс цитокииов и простагландинов, в результате чего усиливается взаимодействие между лейкоцитами, тромбоцитами и клетками эндотелия. Активация лейкоцитов, в первую очередь полиморфно-ядерных (ПМЯЛ) ведет к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) и азота, что в сочетании с повышенной адгезией ПМЯЛ к эндотелию создает угрозу окислительного повреждения собственных органов и тканей [Horton J.W., 2003; Roth Е., 2004]. С другой стороны, резкое снижение радикал-продуцирующей активности ПМЯЛ может способствовать развитию сепсиса [Саркисов Д.С., 1987]. В норме повышенная продукция АФК компенсируется активацией защитных антиоксидантных ферментов (супероксид дисмутазы, каталазы, глутатион пероксидазы и др.). Дисбаланс между активностью радикал-продуцирующей и антиоксидантной систем приводит к избытку свободных радикалов, которые играют роль циркулирующих «патологических сигналов», и лежит в основе поражения легких и других внутренних органов [Величковский Б.Т., 2000; Chen L.W., 2003].
Внедрение в клиническую практику ранней некрэктомии (удаление ожогового струпа на 2-6 сутки после травмы) позволило улучшить результаты лечения обожженных и снизить риск гнойно-септических осложнений [Алексеев А.А., 2003]. Однако любая операция может повлечь за собой усиление продукции радикалов лейкоцитами как следствие хирургического стресса [Isozaku П., 1999]. В настоящее время клиническими и экспериментальными исследованиями подтверждается теория «второго удара», которая заключается в том, что предактивированные вследствие травмы ПМЯЛ отвечают на последующее агрессивное воздействие (операция, инфекция) намного сильнее, чем в норме. Поэтому необходима количественная оценка эффектов операций и бактериальной эндотоксемии, способных играть роль «второго удара» при ожогах. На наш взгляд, перспективным методом для таких исследований является клеточная хемилюминесценция крови.
Не менее важную проблему представляет развитие окислительного стресса в ожоговой ране и близлежащих участках кожи. Первичным источником цитокинов и провоспалительных медиаторов при ожогах является зона повреждения, характери-
зующаяся усиленной миграцией нейтрофилов [Baskaran Н., 2000]. Они очищают область повреждения кожи от продуктов термического распада биомолекул и бактерий при участии АФК. Их азурофильные гранулы содержат фермент миелопероксидазу, который катализирует окисление хлорида до гипохлорита пероксидом водорода, и рассматривается как маркер миграции нейтрофилов в ткань [Trush М.А.,1994; Xia Y.,1997; Basksran Н., 2000]. Избыток АФК способствует развитию некроза в зоне ожога [Porto da Rocha R., 2002] и повышает уровень липидной пероксидации в кожном лоскуте при пересадках [Goldstein R.K, 1992]. Пероксид водорода снижает жизнеспособность фибробластов и кератиноцитов [Thang Р.Т., 2001], а индукция антиоксидант-ных ферментов позволяет им адаптироваться к повышенному уровню образования АФК в ране и на ее краях для того, чтобы активно пролиферировать и дифференцироваться [Steiling Н., 1999]. Однако в зоне ожога антиоксидантные ферменты быстро инактивируются [Корас В., 2003; Naziroglu М., 2003].
Заживление раны зависит не только от ситуации в очаге повреждения, но и от состояния кожи на краю раны [Troshev К., 1990]. Сегодня очень мало известно о характере изменений в близлежащих неповрежденных участках кожи, хотя выявленное в эксперименте угнетение лактатдегидрогеназы свидетельствует о глубоких метаболических сдвигах в коже при ожогах [Заец Т.Л., 1977]. Это направление исследований представляет научный и практический интерес, поскольку ведет к пониманию механизмов ранозаживления и приживления аутотрансплантатов при тяжелых ожогах.
Таким образом, оценка и коррекция генерализованных и местных сдвигов в равновесии про- и антиоксидантных реакций может рассматриваться как важная составляющая в лечении ожогов, в том числе и хирургическом. Медицина не располагает средствами, способными предотвратить развитие системного воспалительного ответа и полиорганной недостаточности у пациентов с критическими ожогами, и многочисленные экспериментальные исследования направлены на поиск путей защиты органов (антицитокиновые препараты, антиадгезивные препараты). Перспективным представляется использование в этих целях комплексных антиоксидантных препаратов. Одновременно необходимо развивать методы оценки эффективности применения антиоксидантов, пригодные для клинических лабораторий [Шанин Ю.Н., 2003].
В настоящее время одной из наиболее актуальных и социально значимых проблем остается детский ожоговый травматизм, который не имеет тенденции к снижению. В детских ожоговых центрах крайне редко используются методы оценки про- и антиоксидантных систем крови, что связано главным образом с методическими слож-
ностями и недостаточной проработанностью теоретической базы, отражающей роль АФК в патогенезе ожоговой болезни. Поэтому необходим анализ возможности использования таких методов для мониторинга про- и антиоксидантных сдвигов в крови детей с ожогами.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучить комплекс нарушений системы антиоксидантнои защиты крови и кожи при ожоговой травме, а также обосновать и апробировать метод клеточной хемилюминесценции цельной крови для мониторинга состояния детей с ожоговой болезнью.
ЗАДАЧИ:
Провести комплексное изучение развития окислительного стресса у пациентов с ожогами разной степени тяжести в динамике с целью выбора наиболее информативного показателя.
Обосновать применение и апробировать метод хемилюминесценции цельной крови для оценки тяжести состояния пациентов с ожогами и ожоговой болезнью, в том числе, и на фоне хирургического лечения.
В экспериментальной модели ожога у крыс оценить баланс про- и антиоксидантных систем крови и кожи и влияние на него хирургической некрэктомии и эндо-токсемии.
В экспериментальной модели ожога у крыс оценить миграцию нейтрофилов в ткань легких (по активности тканевой миелопероксидазы) и влияние эндотоксемии на этот процесс.
Показать системное защитное действие комплекса экзогенных антиоксидантов при ожогах и послеожоговой эндотоксемии.
Оценить местное ранозаживляющее действие фитопрепарата на основе ферментированной папайи, обладающего антиоксидантнои активностью.
Научная новизна. Впервые проведена оценка хемилюминесцентной активности изолированных нейтрофилов и цельной крови у детей с ожоговой травмой. Показано изменение активности нейтрофилов в зависимости от стадии заболевания и его тяжести, в том числе, и от развития органных поражений.
Впервые выявлено активирующее воздействие хирургической некрэктомии на хемилюмииесценцию крови, регистрируемое уже в конце операции и возрастающее на 3-й сутки после операции.
Обнаружено стойкое снижение антиокислителыюй активности и железо-связывающей способности плазмы у пациентов с критическими ожогами, свидетельствующее о дефиците как белковых, так и низкомолекулярных антиоксидантов.
В экспериментальной модели термического ожога у крыс подтверждено повышение хемилюминесценции крови в ответ на ожог и хирургическую травму кожи, выявлен подъем хемилюминесценции через 24 часа после введения животным бактериального липополисахарида, показано усиление активности тканевой миелопероксидазы в легких животных под действием ожога и сопутствующей эндотоксемии.
Впервые изучено влияние ожога и эндотоксемии на баланс активности антиок-сидантных ферментов и миелопероксидазы в коже вне зоны ожога. Показано, что кожа обладает способностью адаптироваться к местной воспалительной реакции за счет увеличения активности ферментов, в первую очередь, глутатионпероксидазы и глута-тион-8-трансферазы. При этом в зоне ожога на 1-е сутки выявлена резкая инактивация антиоксидантных ферментов с последующим некрозом кожи к 4-м суткам.
Показано защитное действие антиоксидантного комплексного препарата на основе витаминов и аминокислот: в коже - нормализация активности защитных ферментов; в крови - снижение хемилюминесценции на пике воспаления и предотвращение снижения антиокислителыюй активности плазмы; в ткани легких - предотвращение роста активности миелопероксидазы как показателя местной воспалительной реакции.
Впервые показано местное ранозаживляющее действие препарата на основе ферментированной папайи.
Практическая ценность. Результаты изучения динамики показателей активности про- и антиоксидантных систем крови детей с ожогами имеют как общее медико-биологическое, так и клиническое значение для понимания патогенеза ожоговой болезни и направленного поиска адекватных антиоксидантных препаратов.
В результате скрининга методов оценки про- и антиоксидантных систем крови детей с ожоговой травмой установлена объективность и информативность метода клеточной хемилюминесценции цельной крови. Метод не требует длительной процедуры выделения нейтрофилов и может использоваться как экспресс-метод, в том числе и для определения изменения активности крови в ходе хирургических операций.
Проведенные клиническое и экспериментальное исследования изменения антиоксидантного статуса тканей при ожогах свидетельствуют о необходимости системного и местного применения антиоксидантных препаратов в острый период ожоговой болезни и при проведении хирургического лечения детей с ожогами. Показано защитное действие комплекса экзогенных антиоксидантов при системном применении и фитопрепарата с антиоксидантной активностью при местном применении.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
Глубокие ожоги кожи вызывают системный воспалительный ответ, сопровождающийся ростом активности циркулирующих нейтрофилов. Хемилюминесценция крови адекватно отражает степень активации нейтрофилов. Она зависит от площади глубокого ожога, сроков с момента травмы, тяжести органных поражений и проведения хирургических операций.
Ожоговая травма вызывает миграцию нейтрофилов не только в зону ожога, но и в кожу вблизи зоны повреждения, а также в легкие. Миграция нейтрофилов сопровождается изменением антиоксидантных ферментов кожи: в зоне повреждения происходит стойкое снижение активности защитных ферментов, а вне зоны повреждения - постепенное повышение активности глутатионпероксидазы и глута-тион-Б-трансферазы.
Эндотоксемия усиливает вызываемый ожоговой травмой окислительный стресс, миграцию нейтрофилов в кожные покровы и в легкие.
Комплекс экзогенных антиоксидантов снижает интенсивность хемилюминесцен-ции крови на пике послеожогового воспаления, уменьшает степень угнетения антиоксидантной активности плазмы, предотвращает рост активности миелоперок-сидазы в легких, в том числе при ожогах, осложненных эндотоксемией.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные положения работы доложены и обсуждены на Национальной научно-практической конференции с международным участием «Свободные радикалы, анти-оксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2001), международном симпозиуме «Активные формы кислорода и оксид азота: диагностическое, профилактическое и терапевтическое значение» (Спб - Кижи, 2002); 1-м Конгрессе национального общества детских дерматологов Италии (Рим, 2003); 2-ом Российском конгрессе "Современные
технологии в педиатрии и детской хирургии" (Москва, 2003); Всероссийской конференции "Актуальные вопросы хирургии детского возраста" (Москва, 2004); научной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы экологии человека" (Москва, 2004); 1-ой международной конференции "Кожа и окружающая среда" (Москва-СПб, 2005); 6-м международном конгрессе Европейской Ассоциации детских хирургов (EUPSA, Гданьск, 2005). По теме диссертации опубликовано 32 научных работы.
Краткая характеристика патогенеза ожоговой травмы
Наиболее часто в клинической практике встречаются термические ожоги. Перегревание тканей выше 52С приводит к необратимому коагуляционному свертыванию белков. Тяжесть повреждения зависит от высоты температуры, длительности воздействия, обширности поражения и локализации ожога. При сравнительно ограниченных ожогах отмечается повышение температуры. Нередко возникает шок: при ожогах I степени, поражающих более 30% поверхности тела; II-IV степени - более 10% [Алексеев А. А., 1999].
Ожоговый шок развивается через 1-2 часа после ожога и вызывает комплекс патологических изменений, охватывающий практически все жизненно-важные системы.
Патологический процесс, в котором ожоговая рана и обусловленные ею висцеральные изменения находятся во взаимосвязи и взаимодействии, представляют собой нозологическую форму, которую принято называть ожоговой болезнью [Каем Р.И., 1995]. Ежегодно от ожоговой болезни в России погибает более 25000 человек, среди которых около 5500 дети [Алексеев А.А., 2000]. По мнению М.И. Кузина и Т.Л.Заец, понятие «ожоговая болезнь» складывается из проявлений болевого стресса, специфического токсинообразования и неспецифической воспалительной реакции [Кузин М.И., 1990].
С патофизиологической точки зрения ожоговая болезнь является наиболее яркой и наиболее точной моделью синдрома системного воспалительного ответа. В соответствии с таким подходом предложено разделять ожоговую болезнь на следующие стадии [Насонова Н.П., 2002]: 1. Стадия ожогового шока. 2. Стадия реперфузионного повреждения тканей. 3. Стадия локального или генерализованного системного воспалительного ответа. 4. Стадия полиорганной дисфункции. 5. Восстановительный период. Ожоговый шок наиболее часто рассматривают как гиповолемический. Гиповоле-мия и связанная с ней гемоконцентрация в значительной мере изменяют динамиче скую вязкость крови и условия ее прохождения через микроциркуляторное русло. Не корригируемая гиповолемия за счет снижения венозного возврата крови приводит к гипотонии. Нарушается адекватная перфузия тканей, возникает органная гипоксия [Альес В.Ф., 1998]. Как результат, развивается микротромбоз, накопление органических кислот, продуктов перекисного окисления липидов и прямое повреждение тканей. При продолжительности шока до 20 часов не выявлено симптомов дисфункции желудочно-кишечного тракта ни у одного пациента, в то время как при шоке длительностью более 60 часов патологические симптомы выявлены у 49,3% детей [Насонова Н.П., 2002]. Стадия реперфузионного повреждения тканей развивается вследствие ишемиче-ских изменений органов и тканей во время шока. На этой стадии в кровоток поступают образовавшиеся в тканях цитокины: TNFa, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, эйкозаноиды, PAF, АФК и др. Высвобождающиеся медиаторы запускают синдром системного воспалительного ответа. Клиническими критериями развития ССВО являются: ? Температура тела больше 38С или менее 36С; ? Частота сердечных сокращений более 90 в минуту; ? Частота дыханий более 20 в минуту или артериальная гипокапния менее 32 мм рт.ст.; ? Лейкоцитоз более 12000 кл/мл или лейкопения менее 4000 кл/мл, или наличие более 10% незрелых форм нейтрофилов. Генерализованная воспалительная реакция развивается в том случае, если выброс медиаторов превышает возможности регуляторных систем к поддержанию гомеостаза. В результате нарушается проницаемость и функции эндотелия капилляров, формируются отдаленные очаги системного воспаления, развитие моно- и полиорганной дисфункции [Sarkisov D.S., 1987]. В настоящее время под ПОН понимают тяжелую неспецифическую стресс-реакцию организма. Повреждение кожных покровов при термической травме оценивается по виду зоны ожога. В нашей стране используется 4-х степенная классификация глубины ожогов [Серов В.В., 1995; Алексеев, А.А., 1999; Парамонов Б.А., 2000]. Гиперемия и небольшая отечность кожных покровов в области ожога являются клиническими признаками ожога I степени. При ожогах II степени кроме того образуются «пузыри», наполненные серозным содержимым. При ожогах I степени поражается только эпидер мис, при ожогах II степени - эпидермис и сосочковый слой дермы. При ожогах III А степени в зону термического поражения включается сетчатый слой дермы, но сохраняются неповрежденными многие фолликулы, сальниковые сумки, потовые железы -придатки кожи, за счет которых происходит эпителизация ожоговых ран. При глубоких ожогах поражается кожа на всю ее толщину (III Б степень) или подлежащие ткани - подкожно-жировая клетчатка, фасции, кости (IV степень). По тактике хирургического лечения разделяют поверхностные (1,2, ЗА степени) ожоги, при которых наступает спонтанная эпителизация при адекватном консервативном лечении за счет сохранившихся придатков кожи. Глубокие ожоги (ЗБ и 4 степени) всегда требуют оперативного восстановления кожного покрова. Особенности воспалительного процесса при ожогах III-IV степени выражаются в следующей последовательности раневого процесса: некроз тканей в момент ожога и вторичное углубление раны — реактивный травматический отек в тканях под зоной некроза —» гнойное демаркационное воспаление —» инфекционный процесс в ожоговой ране - раневая репарация [Каем Р.И., 1995]. Ожоги ША степени часто называют пограничными, поскольку их эпителизация происходит не всегда: за счет микроциркуляторных нарушений и инфицирования ожоговые раны могут «углубляться» и в результате требуется хирургическое лечение [Алексеев А.А., 1999]. Некрэктомию (удаление ожогового струпа) производят после выхода из шока (2-4 сутки от момента травмы) с целью предотвращения инфекционно-септических осложнений. В зависимости от глубины поражения выполняют тангенциальное или фасциалыюе иссечение струпа. Ранняя некрэктомия (4-7 сутки) позволяет избежать развития или прогрессирования полиорганных дисфункций, снижает летальность, сроки пребывания больного в стационаре [Алексеев А.А., 1999; Саркисов Д.С., 1995; Самойленко Г.Е., 2002; Vogt W., 2006; Muangman P., 2006].
В заключение следует подчеркнуть, что основными особенностями воспалительных процессов при ожогах кожи являются вторичная иммунологическая недостаточность, токсикоз продуктами распада ожоговой раны и выраженные нарушения обмена (преобладание катаболических процессов, гипоксии, микроциркуляторных расстройств). В очаге отличительными особенностями являются массивный некроз и распространенный инфекционный процесс, сопровождающиеся торможением пролифе-ративного компонента воспаления, в частности, развития капилляров и грануляционной ткани [Пекарский Д.Е., 1980,1982; Саркисов Д.С., 1980; Каем Р.И., 1995 (Н2О2).
Влияние эндотоксемии на образование активных форм кислорода и азота при ожогах
Некротическую ткань колонизируют бактерии, которые тоже активируют комплемент [Border J.R., 1988]. Поэтому при обширных ожогах наблюдается истощение комплемента, особенно факторов альтернативного пути.
Активация каскада комплемента ведет к диффузии хемотактных факторов в кровоток и активации нейтрофилов [Hasslsen S.R., 1992].
Провоспалительные пептиды, образующиеся в цепи реакций активации комплемента, особенно анафилатоксин С5а, вызывают активацию хемотаксиса, продукции АФК [Davis C.F., 1987] и адгезии нейтрофилов. У пациентов с ожогами пик активации комплемента приходится на 9-13 день [Davis C.F., 1987].
Одновременно лимфокины из тканевых депо, либо образуемые мигирирующи-ми в ткань клетками, выделяются в рану. Все это стимулирует миграцию моноцитов и усиливает их созревание в тканевые макрофаги. При маленьких ожогах эти выделяемые лейкоцитами медиаторы воспаления локализованы в зоне повреждения и быстро удаляются ферментами окружающих тканей и макрофагами. При обширных ожогах эти медиаторы поступают в циркуляцию [Atiyeh B.S., 2001].
В норме фибронектин плазмы способен опосредовать вывод из кровотока чужеродных комплексов мононуклеарными фагоцитами опосредуется фибронектином плазмы. Однако после тяжелых ожогов в плазму выделяется желатиноподобный ли-ганд (коллагеновый дебрис), который может реагировать с растворимым фибронектином и снижать его концентрацию в плазме [Melezynska-Matej М.,1996]. Уже через 6 часов содержание гидроксипролина в плазме при экспериментальных ожогах увеличивалось в 3 раза, при этом наблюдалась прямая корреляция между тяжестью ожога и концентрацией гидроксипролина. Содержание общего гидроксипролина в обожженной коже как индекс растворимого коллагенового материала возрастал в 8 раз через 5 минут после ожога, а через 24 часа превышал норму в 2,5 раза [La Celle P., 1990].
В ожоговой ране присутствуют необычные белки, некоторые из них не встречаются больше ни при каких типах воспалительных реакций в коже и обладают хемат-трактантной активностью [Cioffi W.C., 1992]. В ожоговых струпах обнаружены липид-белковые комплексы, запускающие активацию нейтрофилов in vivo [Sparkes B.G., 1996] и секрецию провоспалительных цитокинов. Липид-белковый комплекс может поступать в кровоток и вызывать активацию нейтрофилов в самый ранний послеожо-говый период, когда роль цитокинов и эндотоксинов еще не проявляется [Мовшев Б.Е., 1980; Федоров Н.А., 1980; Eski М, 2001].
Активаторами нейтрофилов in vitro и in vivo могут служить и частицы разрушенных при ожогах тканей и клеток [Chen F.C., 1999]. Электрофорез в полиакриламидном геле показал, что обожженная кожа мышей выделяет высокотоксичный липид-белковый комплекс и липидные пероксиды. Токсичность липид-белкового комплекса обусловлена термической полимеризацией отдельных нетоксичных белковых предшественников в дерме [Федоров Н.А., 1980; Sparkes BG., 1990], что и определяет его способность вызывать признаки нарастающей интоксикации даже при однократном парентеральном введении в малых дозах. Действие токсина опосредуется блокадой клеток ретикулоэндотелиальной системы [МовшевБ.Е., 1980]. В экспериментах in vitro липид-белковый комплекс действовал как антиген, индуцируя секрецию ИЛ-2 и активацию Т-лимфоцитов, а также индуцируя секрецию ИЛ-1 моноцитами [Федоров Н.А., 1980]. Термическая травма вызывает огромные сдвиги в иммунном статусе: нарушение механических барьеров и активацию комплемента, коагуляцию, каскад фибрино-литической системы в поврежденной ткани с развитием местного и системного воспалительного ответа и нарушением гемодинамики [Парамонов Б.А., 2000]. Под действием цитокинов значительно изменяется фенотип нейтрофилов при воспалении, а сами они способны продуцировать цитокины в количествах, порой превышающих их продукцию другими лейкоцитами [Cassatella М.А., 2006]. У пациентов с острой термической травмой через 48 часов в циркулирующей крови, а также в легких и коже (как поврежденной, так и нормальной) обнаруживали TNF-a, IL-6, IL-8 [Rodriguez J.L., 1993; Andrzejewska Е., 2000]. Полагают, что именно TNF-a инициирует каскад вторичных цитокинов и гуморальных факторов [Piguet P.F.,1991], в том числе, и при ожоговом шоке и сепсисе [Магапо М.А., 1988]. TNF-a обнаруживался в плазме, сердце, легких, печени, почках, тонкой кишке и в ожоговом струпе у крыс через 24 часа после ожога (35%). Содержание TNF-a в струпе может в 27-86 превышать его содержание в плазме и органах [Jia Х.,1996]. У детей при ожогах кипятком содержание TNF-a в плазме в первые трое суток было на 45,9% больше, чем у пострадавших от ожогов пламенем и в 8,2 раза превышал норму [Самойленко Г.Е., 2000]. По данным других авторов, ожоговая травма в отсутствие сепсиса вызывает незначительное увеличение уровня циркулирующего TNF-a [Drost А.С., 1993; Yamada Y., 1996]. Низкий уровень или локализованную продукцию TNF-a объясняют тем, что действие его направлено на мобилизацию других клеточных иммунных механизмов защиты организма и снижения риска инфекции [Schwacha M.G., 2003]. Важную роль в развитии реакции в ответ на инфекционные осложнения при ожогах - играет IL-1. IL-1 осуществляет регуляцию воспалительного ответа в качестве пирогена, хематтрактанта и индуктора активации гранулоцитов, а также Т- и В-лимфоцитов [Fukushima R., 1994]. Несмотря на то, что не зафиксировано увеличение уровня циркулирующего IL-1 при ожогах [de Brandt J.P., 1994; Vindenes Н.,1998], он играет важную медиаторную роль в последующем ответе организма на инфекцию. Уровень содержания IL-2 в плазме пациентов увеличивается в течение 36 часов после травмы [Kowal-Vern А., 2005] и зависит от площади ожога: в группе пациентов с площадью ожога 20-40% показатель превышал значения для группы с площадью ожога более 40% [Kowal-Vern А., 1994]. Уровень IL-6 в циркуляции также повышается после ожогов [O Riordain М., 1992] и зависит от площади ожога; достоверные отличия от нормы наблюдаются при площади ожога более 40%» [Kowal-Vern А., 1994]. В эксперименте на крысах выявлена связь между ростом уровня 1L-6 в плазме и глубиной ожога [Sakallioglu А.Е., 2006]. Интерлейкин-6 регулирует созревание В-лимфоцитов, индукцию белков острой фазы и активацию Т-лимфоцитов [Faunce D.E., 1998]. Уровень циркулирующего IL-6 при ожогах и сепсисе коррелирует с подавлением клеточного иммунитета и ростом смертности [Drost А.С., 1993; Bifil W.L., 1996]. У детей с ожогами кипятком содержание IL-6 в плазме в 27,8 раз превышало норму, а при ожогах пламенем - в 19,7 раз [Самойленко Г.Е.,2000]. ИЛ-8 продуцируется фагоцитами и стимулированными клетками тканей [Bag-giolini М, 1992] и обладает выраженными нейтрофил-активирующими свойствами. У пациентов с ожогами средняя концентрация ИЛ-8 в плазме превышала норму в 60 раз и зависела от площади ожога. В отсутствие серьезных инфекционных осложнений концентрация ИЛ-8 постепенно снижалась, а при осложнениях наблюдали второй пик ИЛ-8 [Vindenes Н.,1995].
Выделение и подготовка к анализам исследуемых компонентов крови
В качестве материала для анализов использовали венозную кровь, взятую утром натощак путем пункции локтевой вены больных и доноров в строго асептических условиях. В том случае, если у больных стоял катетер, кровь бралась из катетера (подключичного). Кровь объемом 4 мл собирали в стерильные силиконизированные пробирки, содержащие 0,05 мл антикоагулянта - раствора гераприна («Richter», Венгрия) (25 ед/мл крови). Пробы крови мягко перемешивали и хранили при температуре тающего льда в течение 4-6 часов. 2.4.2. Забор образцов крови у экспериментальных животных. Кровь отбирали из хвоста до проведения других экспериментальных манипуляций, используя пробирки с гепарином. Для того, чтобы избежать введения наркоза для взятия проб крови, использовали клетку Больцмана. Пробы крови мягко перемешивали и хранили при температуре тающего льда в течение 4-6 часов. 2.4.3. Выделение и подготовка к анализам исследуемых компонентов крови. Подготовка образцов цельной крови. Аликвоту объемом 100 мкл отделяли для прове дения хемилюминесцентного анализа цельной крови (в течение 4-х часов с момента взятия пробы) и для прямого подсчета общего числа лейкоцитов. Получение плазмы. Для отделения плазмы пробу крови объемом 3,5-3,9 мл центрифугировали 10 минут при 400 g и собирали супернатант. Объем оставшегося осадка клеток восстанавливали до 4 мл раствором Хенкса и использовали для выделения ней-трофилов и эритроцитов. Выделение нейтрофилов. Нейтрофилы выделяли по стандартной методике на двойном градиенте плотности [Lindena J., 1987]. Для этого в пробирки поэтапно наслаивали равные объемы растворов Histopaque (удельная плотность 1,119 г/см3 и 1,077 г/см3) и периферическую кровь. Затем пробирки центрифугировали в течение 40 мин при 800g в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования нейтрофилы концентрировались в интерфазном кольце. Взвесь нейтрофилов переносили в силикони-зированные пробирки и дважды отмывали порциями раствора Хенкса по 10 мл. Осаждение клеток после каждой промывки проводили центрифугированием в течение 10 мин при 400g. Количество клеток оценивали методом прямого подсчета в камере Го-ряева, после чего их концентрацию в суспензии доводили до 10 млн/мл. Полученную суспензию использовали для проведения ХЛ анализа в течение 4-6 часов, сохраняя их при температуре тающего льда.
Выделение эритроцитов. Эритроциты выделяли из осадка, собравшегося в нижней фазе при центрифугировании в градиенте плотности. Для этого осадок эритроцитов, остающийся после отделения кольца нейтрофилов, доводили 0,9%-ным раствором NaCl до объема 15 мл и центрифугировали при 400 g в течение 10 минут. Затем надо-садочную жидкость удаляли и проводили процедуру отмывки еще два раза, каждый раз тщательно перемешивая осадок эритроцитов с физ. раствором, не допуская образования пузырей.
Получение лизатов и экстрактов эритроцитов. Лизис эритроцитов проводили добавлением к отмытой эритроцитарной массе 10-ти кратного объема воды (4С). Лизат эритроцитов использовали для оценки активности антиоксидантных ферментов- глу-татион-пероксидазы и глутатион-8-трансферазы. Поскольку в ряде биохимических определений гемоглобин искажает результаты анализов, для оценки активности СОД и каталазы готовили экстракты на основе лизированных эритроцитов. Для приготовления экстракта эритроцитов к 4,0 мл лизированных эритроцитов добавляли 1 мл холодной смеси этанол/хлороформ (5:3 v/v), встряхивали в течение 1 мин и центрифугировали в течение 10 мин при 900g [Grossmann А., 1985]. Активность ферментов определяли в прозрачной водно-этаноловой фазе. 2.4.4. Забор и подготовка к анализам образцов кожи, струпов, ткани раны и легких экспериментальных животных.
Иссечение образцов кожи проводили на расстоянии 10-20 мм от зоны ожога или от края раны под общей анестезией. Образцы замораживали и хранили при -20С в течение недели.
Иссечение ткани раны проводили под общей анестезией в день выведения животных из эксперимента. В этих же условиях проводили забор ткани легких. Образцы тканей тщательно промывали в фосфатном буфере, подсушивали и замораживали.
Материал ожоговых струпов собирали в процессе проведения хирургической некрэктомии и замораживали.
Ткани измельчали и затем гомогенизировали в 0,Ш К-фосфатном буфере (рН7,4), взятом в 10-кратном избытке к весу образца. Для гомогенизации использовали стеклянный гомогенизатор Поттера. Гомогенаты центрифугировали на холоду в течение 30 минут при 900g, а затем собирали супернатанты для биохимических анализов. В супернатантах определяли содержание общего белка методом Лоури и использовали полученные результаты для оценки удельной активности ферментов. Сопоставление данных о весе исходных образцов, весе сухого вещества в супернатантах гомогенатов и о содержании белка выявил линейную зависимость между всеми показателями. Супернатанты хранили в течение 2-х недель при -20С, избегая повторного размораживания и замораживания. Клеточная хемилюминесценция цельной крови. Измерение хемилюминесценции проводили на хемилюминометре ПХЛ-1 (ВНИИ БП, Москва), а также на люминометре LKB-1251 (Wallah Оу, Финляндия) в термостатированных при 37С кюветах при постоянном перемешивании [Lindena J., 1987]. Проба содержала 1 мл раствора Хепкса без фенолового красного (рН 7,4), 2х10"5 люминола (или люцигенина) и 10 мкл цельной крови. В течение 3 минут регистрировали уровень спонтанной хемилюминесценции (ХЛ сп), а затем стимулировали клетки крови раствором форболмиристат ацетата (ФМА) (конечная концентрация 0,1мкг/мл (0,156 мкМ)). В качестве показателя величины стимулированного ответа клеток принимали изменение амплитуды ХЛ ответа (ХЛ стим., мВ). Клеточная хемилюминесценция изолированных нейторофилов. Измерение показателей радикал-продуцирующей активности изолированных нейтрофилов проводили в тех же условиях, что и для проб цельной крови, но вместо крови в пробы добавляли 5x10 клеток (в виде суспензии в растворе Хенкса). Оценивали величину спонтанной (ХЛ сп., мВ) и стимулированной ФМА (ХЛ стим., мВ) хемилюминесценции. Измерение продукции супероксидного радикала нейтрофилами. Для измерения количества супероксидного радикала, продуцируемого нейтрофилами, использовали метод, основанный на реакции восстановления супероксидом цитохрома с [Babior В., 1973]. Для проведения анализа в инкубационную смесь объемом 1 мл вносили 10 клеток (нейтрофилов), цитохром с (0,62 мг/мл), раствор ФМА (0,156 мкМ). В параллельных пробах реакцию проводили в присутствии Си,2п-супероксид дисмутазы (10 мкг/мл). Пробы инкубировали в течение 1 часа при 37С. Затем осаждали клетки центрифугированием проб в течение 10 мин при 400g, после чего измеряли оптическое поглощение супернатанта при 550 нм и выражали в нМ/мин, проводя пересчет с учетом показателя экстинкции восстановленного цитохрома є =21мМ см ).
Исследование динамики изменения про- и антиоксидантных ферментов кожи и ткани раны при экспериментальных ожогах
Совершенствование тактики лечения при ожогах происходит на основе данных, полученных при изучении патогенеза ожоговой болезни. Ожоговая болезнь развивается при площади глубоких ожогов более 10-15% поверхности тела или суммарной площади ожога более 30% поверхности тела. В основе развития ожоговой болезни лежит микроциркуляторная тканевая гипоксия, приводящая к тяжелым функционально-морфологическим изменениям со стороны внутренних органов и систем. К провоспа-лительным медиаторам при ожогах относятся гистамин, серотонин, простагландины, тромбоксан, цитокины и активные формы кислорода (АФК) и азота.
Значительное улучшение результатов лечения обожженных стало возможно благодаря разработке и внедрению в клиническую практику активной хирургической тактики, основанной на ранней некрэктомии с последующей аутодермопластикой.
Если при ожогах I-II степени происходит самостоятельная эпителизация, то при ожогах ША степени микроциркуляторные нарушения и раневая инфекция ведут к «углублению» ран за счет паранекроза, что в свою очередь, требует хирургического лечения. Длительное существование ожоговых ран ведет к истощению и ухудшению регенерации в целом.
В настоящее время полагают, что в основу комлексного лечения обожженных должен быть положен принцип единства общего и местного лечения, направленного на коррекцию генерализованных нарушений гомеостаза и на улучшение заживления ожоговой раны [Алексеев А.А., 1999].
Данные экспериментальных и клинических исследований указывают на значительную роль нейтрофилов и образуемых ими АФК в патогенезе ожоговой болезни [Sir О., 2000; Horton J.W., 2003; Шанин Ю.Н., 2003]. При нарушении равновесия между прооксидантами и антиоксидантами в пользу первых возрастает риск повреждения тканей, т.е развивается окислительный стресс [Sies Н., 1991].
Окислительный стресс ведет к гибели клеток путем некроза или апоптоза, либо к адаптации клеток и тканей и восстановлению их функций. Окислительный стресс -характерная черта многих патологий, включая диабет, атеросклероз, обструктивные бронхиты, пневмокониозы, инфаркт миокарда и др. [Коркина Л.Г., 1987; Величков-ский Б.Т., 2000; Ланкин В.З., 2004;].
Разрешение воспаления определяется, в первую очередь, судьбой нейторфилов: апоптоз и поглощение их макрофагами защищает ткани от агрессивных ферментов, содержащихся в первичных и вторичных гранулах нейтрофилов. Окислительный стресс запускает некоторые из путей, ведущих к апоптозу [Fadeel В., 2003]. Для оценки окислительного стресса нужны показатели, которые отвечают следующим требованиям [Halliwell В., 2004]: они должны иметь прогностическую ценность, быть связанными с показателями тяжести состояния; быть доступными и воспроизводимыми; позволять хранение образцов в течение некоторого времени; мало зависеть от диеты. Учитывая существенные сдвиги в уровне образования АФК начиная с первых часов после ожога, на стадии ожогового шока и при развития ожоговой болезни, мы считаем перспективным использование методов, позволяющих оценивать образование АФК циркулирующими нейтрофилами. В качестве метода оценки продукции АФК клетками крови мы выбрали метод клеточной хемилюминесценции, активированной люминолом, а в качестве стимулятора - форболовый эфир. По данным литературы, при площади ожогов более 21% ОПТ стимулированная латексом ХЛ изолированных нейтрофилов взрослых пациентов превышает нормальный уровень в 2 раза в течение как минимум 30 дней с момента ожога [Никушкина К.В., 1997]. При площади ожога 11-20% превышение нормы составляло не более 30%. При этом отмечалось снижение фагоцитарной активности нейтрофилов при всех площадях ожога и во все сроки наблюдения и усиление их адгезивности. По нашим данным (табл.6), стимулированная форболовым эфиром хемилюми-несценция изолированных нейтрофилов максимально превышает норму в 2-2,5 раза при площади ожога 15-30% ОПТ и в 7-9 раз - при площади ожога 35-70% ОПТ. При анализе результатов нельзя не учитывать того обстоятельства, что процедура выделения нейтрофилов может менять их свойства. В крови нейтрофилы находятся во взаимодействии с другими клетками [Воейков В.Л., 2003], в том числе, и под контролем цитокинов. В цельной крови примирующие эффекты цитокинов сохраняются в течение двух часов, тогда как прайминг изолированных нейтрофилов отличается нестабильностью [Brown G.E., 1997]. С этой точки зрения, представляет интерес применение метода клеточной хемилюминесценции цельной крови. С помощью этого метода были получены убедительные результаты, отражающие изменения в продукции АФК в крови пациентов с ожоговым шоком [Шанин Ю.Н., 2003]. Объективность оценки изменений в крови с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции подтверждается выявленными нами связями между ХЛ и тяжестью травмы (площадью глубоких ожогов), осложнениями со стороны внутренних органов, сроками с момента получения травмы. Рост хемилюминесценции цельной крови в ответ на ожоговую травму наблюдался как в клинике, так и при ожогах у крыс. Рост ХЛ не является специфическим следствием ожогов; мы наблюдали подъем показателя и при эксцизионных ранах у крыс, и в ходе пластических косметических операций. Мы полагаем, что рост ХЛ цельной крови под действием травмы - это проявление неспецифической воспалительной реакции. Особенностью ожогов является одновременное или последовательное воздействие на нейтрофилы нескольких факторов: инфекции, эндотоксемии, хирургической травмы. В экспериментальном исследовании мы обнаружили, что ХЛ цельной крови изменяется при воздействии этих факторов как на здоровых (контрольных) животных, так и на животных с ожогами. Следует подчеркнуть, что и эндотоксемия, и хирургическая травма кожи усиливали хемилюминесценцию крови, что подтверждает их про-воспалителыюе действие. Хирургическая некрэктомия - неотъемлемая часть лечения пациентов с глубокими ожогами, значительно улучшающая его результаты. Однако проведение операций может вызывать временное ухудшение состояния пациентов, особенно при критических ожогах. Мы показали, что кратные некрэктомии после ожогов у крыс приводят к более длительному и выраженному подъему ХЛ цельной крови. На наш взгляд, оптимизация сроков проведения операций и промежутков времени между последовательными операциями с использованием данных о ХЛ цельной крови могло бы позволить избежать гиперактивации нейтрофилов в результате соче-танного действия ожоговой и хирургической травмы.
