Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о репаративном остеогенезе костной ткани у собак 9
1.1. Некоторые особенности строения и биохимии костной ткани 9
1.2. Биохимические аспекты регенерации костной ткани 27
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Материал, экспериментальные модели и условия экспериментов 41
2.2. Методы исследования 50
2.2.1. Методы исследования крови 51
2.2.2. Методы исследования костной ткани 61
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 66
3.1. Исследованве характера энергообеспечения регенера тивного процесса 66
3.2.Система крови и регенерация костной ткани 80
3.2.1. Особенности реакции белой крови 81
3.2.2. Показатель состояния, рассчитываемый по.лейкограмме 87
3.2.3. Особенности реакций красной крови 92
3.3. Показатели белкового обмена 99
3.3.1. Общий белок и белковые фракции сыворотки крови 100
3.3.2. Обмен гидроксипролина 112
3.3.3. Активность ферментов переаминирования 117
3.3.4. Гликопротеины сыворотки крови 121
3.3.5. Гликопротеины, растворимые в хлорной кислоте 127
3.3.6. Показатели естественной резистентности и иммунной реактивности организма собак в ходе остеогенеза 138
3.4. Показатели минерального обмена 146
3.4.1. Обмен кальция и фосфора 147
3.3.6. Оценка гормональной регуляции «скелетного гомеостаза» 153
3.3.7. Характеристика активности фосфомоноэстераз 165
3.3.8. Оценка активности остеогенеза по индексу фосфатаз 175
3.3.9. Способ контроля над репаративным остеогенезом при лечении методом ЧОС собак с травмами костей скелета 182
3.4. Некоторые особенности биохимии костной ткани 193
3.5.1. Химический состав костной ткани 194
3.4.1. Химический состав костных регенератов 197
3.4.2. Взаимосвязь процесса минерализации регенератов с уровнем электролитов в крови 206
3.4.3. Некоторые аспекты механизма декальцинации скелета 209
3.5. Течение репаративного остеогенеза при ЧОС в зависимости от тяжести регионально-ишемических расстройств кости 216
3.6.1. Изменения со стороны минеральной фазы и органического ч матрикса кости 222
3.5.1. Исследования электролитного обмена и КЩР 227
3.6. Биохимические аспекты переломов позвоночника в условиях лечения методом ЧОС... 242
Заключение 258
Выводы 267
Список литературы 270
- Некоторые особенности строения и биохимии костной ткани
- Методы исследования крови
- Исследованве характера энергообеспечения регенера тивного процесса
- Показатели естественной резистентности и иммунной реактивности организма собак в ходе остеогенеза
Введение к работе
Актуальность темы. Лечение повреждений и заболеваний опорно-двигательного аппарата у домашних животных представляет собой едва ли не большую проблему, чем у человека. В ветеринарной практике, в качестве методов остеосинтеза используют гипсовые повязки, внутрикостый и накостный остеосинтез (169;183; 225; 227; 229; 239; 246; 249; 288). Однако вопросы лечения травм скелета у собак до настоящего времени являются одними из наиболее актуальных. Это связано с трудностью репозиции костных отломков и обеспечении их стабильной фиксации на протяжении всего периода лечения.
В последние годы в ветеринарии стали широко использовать метод чрескостного остеосинтеза (ЧОС) (3; 25; 29; 104; 271; 312; 319; 320; 380; 381). Представляется очевидным, что для применения в практике метода ЧОС, ветеринарный врач должен быть вооружен информацией об общем состоянии организма; его реакции на травму кости или оперативное вмешательство на ней, позволяющей контролировать и прогнозировать процесс лечения.
Вопросам изучения патогенеза костной травмы уделялось и уделяется много внимания со стороны ученых всего мира. К настоящему времени в отечественной и зарубежной литературе имеется значительное количество работ, посвященных выяснению особенностей костного метаболизма при лечении переломов различными методами остеосинтеза (42; 118; 131; 160; 178; 184; 191; 203; 277).
Исследований, посвященных проблеме изучения биохимической модели остеогенеза, её зависимости от тяжести травмы, вида поврежденных костей скелета, степени повреждения местного кровообращения и параос-сальных тканей в условия ЧОС у собак нами не выявлено. В связи с этим
является актуальным и целесообразным изучение данной проблемы для укрепления теоретической базы остеогенеза и внедрения метода ЧОС в ветеринарную практику.
Цель н задачи исследований. Целью наших исследований явилось изучение химического состава крови, костной ткани, костных регенератов в ходе остеогенеза различных костей скелета у собак в зависимости от стадии, тяжести травмы; степени повреждения местного кровообращения и па-раоссальных тканей в условиях ЧОС; исследование возможности лабораторного контроля над остеогенезом. Для решения поставленной цели были определены следующие задачи:
изучить состояние углеводного, белкового, минерального обмена в ходе остеогенеза после экспериментальной остеотомии трубчатых костей и тела L5 поясничного позвонка у собак;
изучить динамику гематологических показателей крови собак в ходе остеогенеза в зависимости от степени повреждения параоссальных тканей;
изучить химический состав костной ткани различных видов костей, костного регенерата;
изучить состояние электролитного баланса в крови собак и его динамику в ходе остеогенеза в зависимости от степени нарушения местного кровообращения трубчатых костей;
оценить возможности лабораторного контроля над остеогенезом у собак в условиях лечения травм костей скелета методом ЧОС. Научная новизна. В результате проведенных исследований получены новые данные, характеризующие качественные и количественные изменения в минеральной фазе и органическом матриксе зрелой и новообразованной кости, которые могут быть использованы в экспериментальной остеологии при апробации новых методик оперативного и фармакологического лечения повреждений опорно-двигательного аппарата.
Впервые изучена динамика биохимических показателей в ходе остеогенеза в зависимости от тяжести травм костей скелета, степени повреждения местного кровообращения кости и параоссальных тканей в условия: ЧОС. Установлена их зависимость от фазы регенерации. Разработан способ лабораторного контроля над остеогенезом у собак по уровню электролитов крови.
Теоретическая и практическая значимость исследований Полученные результаты позволяют построить биохимическую модель протекания химических реакций в крови, костной ткани и костном регенерате у собак в ходе остеогенеза после травмы различных костей скелета, установить их особенности в зависимости от тяжести травмы, степени нарушения местного кровообращения и повреждения параоссальных тканей.
Разработан лабораторный способ контроля над остеогенезом у собак по уровню электролитов крови.
Получены нормативные данные содержания в крови показателей кислотно-щелочного равновесия (КЩР) и электролитного баланса, энергетического гомеостаза, гликопротеинов (ГП), гидроксипролина (ОН-про), изо-ферментного спектра щелочной фосфатазы (ЩФ), которые могут быть использованы в практике ветеринарных лабораторий. Изучен химический состав костной ткани трубчатых костей и тела L5 поясничного позвонка.
Основные положения, выносимые на защиту:
динамика биохимических показателей крови собак в ходе остеогенеза в зависимости от стадии, тяжести травмы, вида поврежденных костей скелета, степени повреждения местного кровообращения и параоссальных тканей;
химический состав костной ткани и костного регенерата;
- лабораторный способ контроля над остеогенезом у животных по
уровню электролитов крови.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:
- международной научно-практической конференции «Актуальные про
блемы ветеринарной медицины» Троицк, 2000; 2001; 2002; 2003; 2004.
- V Всероссийской конференции «Актуальные вопросы ветеринарной ме
дицины мелких домашних животных». Екатеринбург, 2003.
-на XI Международном ветеринарном конгрессе по ветеринарной медицине мелких домашних животных. Москва, 2003.
-на XII Международном ветеринарном конгрессе по ветеринарной медицине мелких домашних животных. Москва, 2004.
Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 35 научных статей, в которых изложено основное содержание работы. Среди публикаций 2 учебных и 1 методическое пособие.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 316 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов. Работа иллюстрирована 56 таблицами и 48 рисунками. Список литературы включает 503 источника, в том числе 176 - зарубежных авторов.
Диссертационная работа выполнена по плану НИР ФГОУ ВПО «УГАВМ»(№ государственной регистрации 01.200.120201).
Некоторые особенности строения и биохимии костной ткани
Рассмотрим последовательно все вышеперечисленные компоненты. Своеобразное строение костной ткани определяется её клеточным строением (47; 124; 291; 292; 293; 311; 359; 387; 423; 453).
Выделяются два вида клеток, имеющих отношение к костеобразо-ванию: морфологически недифференцируемые и дифференцируемые. К первому виду относятся остеогенные клетки-предшественники. Основными клетками второго вида являются остеобласты, остеокласты и остеоциты.
В настоящее время считается, что недифференцируемые остеоген-ные клетки-предшественники входят в популяцию стромальных меха-ноцитов. Они возникают из мезенхимы, в дальнейшем развитии становятся независимыми от кроветворной линии и обычно не способны к миграции в организме. Их функция заключается в формировании срук-турных компонентов стромы и костной ткани (47; 148; 291; 292; 293; 304; 306; 334).
К виду морфологически дифференцируемых клеток относятся клетки, непосредственно принимающие активное участие, как в физиологической, так и в репаративной регенерации кости (остеобласты, остеоци-ты, остеокласты) (195; 196; 327; 338).
Остеобласты - это относительно крупные секреторные клетки, имеющие кубическую форому, базофильную цитоплазму с хорошо развитой гранулярной эндоплазматической сетью и эксцентрично расположенное ядро. На мембране имеются рецепторы для коллагена, остео-кальцина, остеопонтина, ИФР, фактора роста фибробластов, тромбоци-тарного ростового фактора, в цитоплазме высока активность щелочной фосфатазы (ЩФ). Поэтому, возрастание активности ЩФ цитоплазмати-ческой мембраны служит лучшим морфологическим индикатором их дифференцировки в остеогенном направлении (57; 336; 478; 479). Вакуоли остеобластов формируют секреторные пузырьки, содержащие про-коллаген, коллаген, липиды, фосфолипазы и ПГ. Вакуоли образуются внутри цитоплазмы и движутся к апикальной части, где могут выбрасывать свое содержимое наружу посредством экзоцитоза в межклеточное вещество. Другие включения, получившие название «матриксные пузырьки», играют ключевую роль в процессе минерализации костного матрикса и обнаруживаются в месте кальцификации кости. Они имеют диаметр от 30-1000 нм, содержат липиды, пирофосфатазу и кальций. Предполагается, что в них происходит накопление кальция, который взаимодействует с ортофосфатами, образующимися в результате гидролиза эфира фосфорной кислоты при участии фосфатазы. Это обеспечивает локальное увеличение значения Са/Р и вызывает преципитацию с возрастанием концентрации свободных ионов фосфатов. Именно, они, по-видимому, взаимодействуют с несвязанным белками кальцием в тканевой жидкости. Первоначально образуется аморфный ортофосфат кальция, а затем ГОА. Считается, что вышедшие в экстрацеллюлярное пространство матриксные пузырьки вступают во взаимодействие с ПГ, остеонектином и коллагеном, встраиваясь в их структуру, и после удаления оболочки могут выступать в качестве маргинального фактора запуска локального эндогенного механизма обызвествления кости (303; 330; 331).
Остеоциты - зрелые костные клетки с длинными анастомозирую-щими между собой отростками. Их ультраструктура близка к строению остеобластов, из которых они возникают. Остеоциты находятся в замкнутых лакунах и не пролиферируют, но частично сохраняют способность продуцировать коллаген и ПГ. Несмотря на большое количество данных, посвященных морфофункциональным свойствам остеоци-тов, тем не менее, информации об их роли в метаболизме кости всё ещё крайне не достаточно (36). Сегодня считается твердо установленными продукция остеоцитами остеокальцина и их участие в кальциевом обмене организма (467). Они отвечают за обмен минеральных и органических веществ между костью с одной стороны, тканевой жидкостью и кровью - с другой (447; 448). Следует заметить, что при функциональной перестройке кости остеоциты вместе с остеокластами могут резорбировать расположенную вокруг них кость (399; 492). Для этого они имеют набор ферментов, включающих кислую фосфатазу (КФ), пептидазы, которые и обуславливают способность к лизированию тканей (493).
Согласно гипотезе, предложенной Л.Лэньон (1987) остеоциты воспринимают от костного матрикса информацию об изменениях состояния костного гомеостаза и передают эту информацию остеобластам. Последние расположены в неповрежденных костях на наружней поверхности кортекса и соединены с остеоцитами синтициальными связями («костная метаболическая единица») (379; 408).
В то время как остеобласты и остеоциты образуют костный метрике, в кости существуют клетки, разрушающие его. Они получили название остеокластов. Эти клетки не являются остеогенными, а развиваются из кроветворных прекурсоров, дифференцирующихся в сторону моноцитопоэза. При попадании в костную ткань, они проходят специализацию и превращаются в остеокласты (390; 394; 407; 425; 426; 427; 481; 482; 491). Существует и другая точка зрения, согласно которой остеокласты имеют и другие пути генеза. PeurinkJ. et. al.(1977) нашли, что остеокласты могут возникать из клеток сосудистой системы. На не кроветворное происхождение остеокластов указано в работах Owen М.( 1980), Loutit J. F. et. al. (1982), MinkinC. et. al.(1986).
Методы исследования крови
Для выполнения биохимических исследований использовали кровь и сыворотку крови собаки. Кровь для анализа брали из вен интактной конечности утром, до кормления - до операции и в ходе остеогенеза. Сыворотку крови получали общепринятым методом (233). Биохимические исследования выполнены в биохимическом отделе экспериментального отдела РНЦ «ВТО» им. Г.А.Илизарова, на кафедре биохимии ФГОУ ВПО «МГАВМиБ им. К.И. Скрябина», ФГОУ ВПО «УГАВМ». Лабораторные исследования костной ткани выполнены совместно с докт. мед. наук Де-сятниченко К.С. При выполнении работы были использованы следующие методы: 1 .Определение гидроксипролина (ОН -про): свободного, пептиднос-вязанного и общего. Содержание свободного ОН-про определяли методом Bergman и Loxlee (343) в модификации ТЛ.Кузнецова (165). Метод основан на окислении ОН-про в слабокислой среде и выявлении окисленного продукта в цветной реакции с пара-диметиламинобензальдегидом (реактивом Эрли-ха). При определении концентрации общего ОН-про в качестве окислителя использовали перекись водорода (ПО). Пептидносвязанный ОН-про находили по разности содержания общего и свободного гидроксипролина. 2,Определение сиаловых кислот методом Svennerholma (4) по цветной реакции с резорцином после мягкого кислотного гидролиза. Концентрацию сиаловых кислот определяли в течение первых суток после взятия крови. З.Определение гексозаминов методом Elson , Morgan (1933) в модификации Brownlee , Wheat (1966) (257). Метод основан на деацетилиро-вании ГМ уксусным ангидридом в присутствии тетрабората калия. Деаце-тилированный продукт выявляли по цветной реакции с реактивом Эрлиха. 4.0пределение гексоз, связанных с белком методом Веймера и Мошина (4). Метод основан на цветной реакции с орцином после мягкого кислотного гидролиза белков, осажденных этанолом. 5.Определение хлорнорастворимых гликопротеинов (ХРГП) сыворотки крови по содержанию в них белка и гексоз. Осадок ХРГП получали методом Winzler (499; 500). При взаимодействии хлорной кислоты с сывороткой крови все белки выпадают в осадок, ХРГП остаются в растворе, из которого выделяются путем осаждения их фосфорно-вольфрамовой кислотой. В полученном осадке определяли гексозы методом Веймера и Мошина и белок методом Гриншпана в модификации Р.Х.Кармолиева (133). б.Разделение хлорнорастворимых гликопротеинов сыворотки крови на фракции проводили методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Тихонова В.П. (274). Электрофорез проводили в вертикальной камере. 7.Разделение общего белка сыворотки крови методом диск-электрофореза в ПААГ (43; 135; 193). При диск-электрофорезе исполь-зуюся прерывистые системы буферов и гелей. Первый - крупнопористый (3,5%) концентрирующий гель с рН=6,7, в котором молекулы разделяемого вещества собираются в узкую стартовую зону. Второй -мелкопористый (7,5% или 10%-ный) разделяющий гель с рН=8,9, где происходит разделение макромолекул под действием электрического поля и эффекта молеклярного сита по величине, форме и заряду молекул. Количественный анализ белковых фракций проводили на денситометре ER1-65M (фирма Карл Цейс Йена, ГДР) в проходящем свете при красном светофильтре (600 нм). Чувствительность прибора меняли в зависимости от интенсивности окраски белковых зон. Относительное количественное содержание каждой фракции (Х%) определяли по денситограмме весовым методом по формуле: Дх-вес пика определяемой белковой фракции; Д-сумма всех пиков белковых фракций. Абсолютное содержание белковых фракций (г/л) рассчитывали по формуле: В - общее количество белков в сыворотке крови, в г/л по результатам биуретового метода. в.Определение общего белка сыворотки крови биуретовым методом (300). Метод основан на образовании окрашенного комплексного соединения белка с медью в щелочной среде. Расчет белка вели по калибровочному графику и выражали концентрацию в г%. Дня перевода г% в рекомендуемые единицы СИ (г/л) использовали коэффициент пересчёта - 10. 9,Определение активности аминотрансфераз (ACT и АЛТ) в сыворотке крови проводили колориметрическим методом по Райтману и Френкелю. Переаминирование под действием аланин- и аспартатаминотрансферазы приводит к образованию пировиноградной и щавелевой кислот. Последняя, в процессе ферментативной реакции превращается в ПВК. При добавлении 2,4-динитрофенилгидразина образуется окраска, интенсивность которой, определяемая колориметрически, пропорциональна количеству пировиноградной кислоты. Расчет активности ферментов проводили по стандартной кривой, калиброванной по пирувату. Результат выражали в ИЕ/л. Для пересчета ИЕ/л в нкат/л использовали коэффициент 16,67. (324). 10. Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (метод Севела, Товарек). Meтод основан на окисление L-лактата в щелочной среде в присутствии ЛДГ сыворотки крови и NAD в пируват. При взаимодействии пировиноградной кислоты с 2,4-динитрофенилгидразином образуется окрашенный продукт реакции - гидразон пировиноградной кислоты, интенсивность окраски которого пропорциональна активности фермента. Расчет активности фермента проводили по стандартной кривой, калиброванной по пирувату. Результат выражали в ИЕ/л. Для пересчета ИЕ/л в мккат/л использовали коэффициент 0,0167(300). 11. Определение изоферментного спектра ЛДГ в сыворотке крови гистохимическим методом в гелях после электрофореза (324). При электрофорезе сложной смеси белков в твердом носителе, положение фермента в гелевом блоке длительное время остается неизменным ввиду малой диффузии. При этом функциональные свойства фермента сохраняются. Гелевой блок помещают в инкубационную среду, состоящую из молочно-кислого натрия, нитросиннго тетразолия, NAD, хлорида магния, фена-зинметасульфата. В ней проводят гистохимическое выявление фермента при температуре 37С в течении часа. Среду готовят на фосфатном буфере (рН=7,4). Специфическим компонентом среды является субстрат, на который действует фермент.
Исследованве характера энергообеспечения регенера тивного процесса
Биологический смысл данного индекса сводится к тому, что в период гипоксии его величина выше средней физиологической величины в результате накопления в крови кислых продуктов из-за недостаточно развитой микроциркуляции очага повреждения. В период же активации реакций тканевого дыхания, наоборот, его уровень ниже средней физиологической величины за счёт активации окислительно-восстановительных процессов. Коэффициент отношения Н- и М-субьединиц в ферменте лактатде-гидрогеназе (Н / М).
Изоферменты ЛДГ образованы субъединицами двух основных типов Н- и М- в различных комбинациях. Синтез Н-субъединиц фермента происходит в клетках органов и тканей (сердце, почки, мозг), которые функционируют только в условиях достаточного поступления кислорода. Наоборот, М-субъединицы фермента преобладают в изоформах, синтезируемых клетками тканей, работающих и в условиях гипоксии. Это в особенности справедливо в отношении скелетных мышц, интенсивность работы которых в определенных пределах не зависит от поступления кислорода (35; 37; 166). Поэтому по соотношению Н- и М-субъединиц в ферменте ЛДГ тоже можно судить об условиях, в которых протекают окислительные процессы глюкозы в организме.
Полученный цифровой материал углеводного метаболизма в ходе репаративного процесса систематизирован в табл. 3.1.1., 3.1.2.
Характер изменения концентрации метаболитов углеводного обмена (табл.3.1.1) имел две тенденции. Уровень исследуемых показателей достоверно возрастал до 3-4-х сут после остеотомии, после 10-12-х сут нормализовалось содержание глюкозы, МК, активность альдолазы, но оставался высоким уровень ПВК и активность ЛДГ.
Ключевой величиной среди всех показателей углеводного обмена является глюкоза. У собак до остеотомии уровень сахара равен 3,15+0,02, контролирует его содержание центральная и периферическая нервные системы, эндокринная система, а простейшие формы регуляции осуществляют органы (печень, мышцы) (1; 18; 68; 69; 192). После остеотомии диафиза больше-берцовой кости возникает гипергликемия, которая сохраняется до 3-4-х сут после операции. Высокий уровень глюкозы в крови поддерживается за счет воздействия на центральную нервную и гипоталамо-гипофиз-адреналовую системы химическими и токсическими раздражителями (66; 326), образующимися в ходе резорбтивных процессов в травмированной костной ткани. Это повышает гормональную деятельность надпочечников и поджелудочной железы (18; 192).
Гормоны надпочечниковоинсулярной гормональной системы активизируют процесс глюконеогенеза и фосфоролиза гликогена печени (21; 66; 172). Это обеспечивает высокое содержание глюкозы в крови, а также способствует сдвигу влево равновесия в реакции: лактат г пиру-ват. Доказано, что гормоны надпочечников играют в этих процессах двоякую роль. С одной стороны, они обеспечивают интенсивный глюконе-огенез. С другой стороны, ограничивают сгорание глюкозы в организме. Эта их вторая функция смыкается с эффектом торможения гормональной активности островков поджелудочной железы (52; 192).
Надо также иметь в виду и тот факт, что часть глюкозы окисляется по пентозофосфатному пути. Апотомический путь поставляет в реакции синтеза нуклеиновых кислот рибозу-5-фосфат и NADP (157; 189; 207; 323), которые резко активируются в данный период регенерации.
Гипергликемия характеризуется повышением каталитической активности фермента альдолазы (КФ 2.2.1.2.). Данный фермент катализирует реакцию промежуточной стадии гликолиза, сопровождающуюся расщеплением фруктозо-1,6-дифосфата на две триозы: дигидрооксиацетонфосфат и 3-фосфоглицериновый альдегид (189; 197; 281; 324). Возрастание активности альдолазы свидетельствует об активации реакций гликолиза, в которых утилизируется избыток глюкозы крови. Этот вывод подтверждается высоким содержанием в крови молочной кислоты (11; 21; 68; 69).
Молочная кислота - конечный продукт гликолиза. По её содержанию можно судить об условиях протекания окислительно-восстановительных реакции в организме. Повышение в крови уровня МК (гиперлактацидемия) сопровождает дисгармонию в соотношении анаэробной и аэробной фаз обмена углеводов в виде преобладания анаэробной (11; 221).
Дальнейший обмен МК в организме возможен только через стадию превращения её" в пировиноградную кислоту. Поэтому увеличение уровня лактата приводит к возрастанию концентрации ПВК в крови, но менее значительному (на 3-4-е сут остеогенеза МК повышается на 101,09%, в то время как ПВК только на 76,23%). Определенная часть образующейся пирови-ноградной кислоты утилизируется в цикле Кребса, окисляясь до СОг и Н20 (189; 207; 209). Только в присутствии NAD пировиноградная кислота может вступать в цикл Кребса (13). В результате образование пирувата значительно превосходит потребление, и её избыток посредством NAD восстанавливается в молочную кислоту. Это в свою очередь приводит к образованию избытка лактата и к локальному повышению кислотности в поврежденной костной ткани.
Взаимопревращение ПВК в МК и обратно совершается в организме непрерывно. Интенсивность данной реакции зависит от каталитической активности ферментативных систем, обеспечивающих разнообразные превращения пирувата. Одним из таких ферментов является лактатдегідрогеназа (ЛДГ) (1.1.1.27.) - гликолитический фермент, обратимо катализирующий окисление лактата в пируват (16; 17; 21; 197; 205).
Показатели естественной резистентности и иммунной реактивности организма собак в ходе остеогенеза
Четвертая фракция соответствовала по электрофоретической подвижности агглобулинам и образована аі-антитрипсином (128), пятая -в области о -глобулинов, представлена аг-гаптоглобином (22; 41; 236; 262); шестая фракция - в области 3-глобулинов. ХРГП по электрофоретической подвижности соответствующих у-глобулинам нами не выявлено. Анализируя зрительно электрофореграммы и денситограммы (рис.3.3.5.1.) выявить количественные изменения в фракциях хлорнора-створимых белков практически не удается. Однако, проведя определенные математические расчеты по определению содержания фракций в процентах, нами выявлены количественные изменения в соотношении отдельных хлорнорастворимых белков. Результаты статистической обработки приведены в табл.3.3.5.2.
На диск-электрофореграмме здоровых собак преобладают фракции, расположенные в анодных и средних областях, т.е. белки с быстрой и средней электрофоретической подвижностью. На долю первых трех анодных фракций (преальбумин, орозомукоид, хлорнорастворимый альбумин) приходится больше половины всех серомукоидных белков (52%). Наибольшим в количественном отношении является вторая фракция. Наши выводы согласуются с данными других исследователей (33; 41; 274; 470). Характерно, что процентное содержание анодных фракций за весь период исследований не изменялось и колебалось в пределах 51-53%. Хотя между ними происходило перераспределение: увеличивался уровень оро-зомукоида и уменьшался преальбуминовой фракции. Максимальные значения белков анодной области нами отмечены на 3-4-е сут после операции.
Важной физиологической функцией орозомукоида является его им-муносупрессорная активность. Так в определенных дозах эти гликопро-теины из крови неиммунизированных животных при введении мышам, иммунизированным эритроцитами баранов, могут снижать титры гемолизинов (137; 138; 139; 154). Орозомукоид тормозит пролиферативный ответ лимфоцитов переферической крови млекопитающих на фитогемагтлю-тинин, угнетает бластогенез, индуцированный кон кана нал ином А.
На основании вышесказанного можно сделать вывод о том, что гипе-ророзомукодемия ни в какой мере не отражает степень и глубину деструктивных процессов в костной ткани, а является показателем общей реактивности и высоты функций механизмов неспецифического иммунитета. Значит, реактивность организма в первую фазу остеогенеза повышается. Период времени с 1-х по 60-е сут после операции, характеризуется высоким содержанием а2-гаптоглобина. Роль гаптоглобина в организме млекопитающих до конца не установлена. В настоящее время считается, что он принимает участие в защитных реакциях организма. Защитная функция проявляется в его свойстве связывать гемоглобин в прочный комплекс. Это обуславливает сохранение в организме гемино-вого железа (22; 262). Данные наших исследований согласуются с этим положением. Мы уже отмечали, что в «катаболическую фазу» регенеративного процесса резко снижается количество эритроцитов и гемоглобина в результате увеличения скорости их распада и уменьшения синтеза. Это сопровождается повышением потребности в белке-переносчике гемоглобина (т.е. в гаптоглобине) в печень, где происходит его катаболизм. С другой стороны, процесс биосинтеза гаптоглобина стимулируется различными гуморальными веществами (активными полипептидами), которые появляются в крови при освобождении из клеток поврежденной костной ткани. Гаптоглобин принимает участие и в процессах, связанных с биосинтезом коллагена. Он проявляет стимулирующий эффект (495). Это определяет высокий уровень данного белка в анаболическую фазу остеогенеза.
Процесс регенерации костной ткани характеризуется высоким процентным содержанием фракции, представленной с -антитрипсином. Известно, что раневой процесс у собак протекает по гнойнопротеолитиче-скому типу. Он сопровождается образованием и поступлением в кровь повышенного количества тканевых протеаз. Это приводит к возрастанию потребностей организма в ингибиторе данных ферментов для снижения протеолитической активности крови. Следовательно, высокий уровень антитрипсина спасает организм от интенсивного распада тканей. Концентрация а і-антитрипсина нормализуется после снятия аппарата и заживления раневых поверхностей кожи.
Белки сії. и а.2-глобулиновых фракций являются мерой реактивности костной ткани (128). Отражают её функциональное состояние. Следовательно, возрастание уровня этих фракций в ходе остеогенеза указывает на активность защитных реакций организма.
К сожалению, мы не можем сравнить наши данные с результатами других авторов, т.к. мы впервые провели разделение данных белков сыворотки крови собак методом ДЭФ в ПААГ в ходе остеогенеза.
Таким образом, нами установлено, что травма трубчатых костей у собак сопровождается деполимеризацией гликопротеиновых цепей основного вещества костной ткани. Это приводит к активации синтеза хлорнорастворимых белков, нарушению нормального соотношения в их составе углеводного и белкового компонентов, изменению их качественного и количественного состава. Уровень концентрации ХРГП в крови определяется фазой регенераторного процесса и может быть дополнительным тестом, отражающим ход течения остеогенеза.
