Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1 Современные представления об экологической опасности применения инсектицидов . 13
1.2 Перекисное окисление липидов в митохондриях как универсальный механизм токсического повреждения и перспективы его использования в экотоксикологии 27
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 35
2.1 Химические реагенты, применявшиеся в исследованиях 35
2.2 Биологический материал 35
2.3 Расчет экспозиционной дозы каратэ 36
2.4 Получение митохондриальной фракции 37
2.5 Определение концентрации белка 37
2.6 Определение концентрации продуктов ПОЛ 38
2.7 Определение активности антиоксидантних ферментов 40
2.8 Полярографическое определение интенсивности дыхания митохондрий 41
2.9 Статистическая обработка полученных результатов исследования 42
2.10 Материалы анализа применения инсектицида каратэ на территории волгоградской области. 42
ГЛАВА 3. Анализ применения инсектицида каратэ на территории Волгоградской области и его эколого-токсикологическая характеристика . 44
3.1 Анализ применения инсектицида «каратэ» на территории Волгоградской области 45
3.2 Эколого-токсикологическая характеристика препарата каратэ. 49
3.3 Некоторые аспекты мониторинга каратэ в Волгоградской области. 59
ГЛАВА 4. Возрастная динамика уровня перекисного окисления липидов и активности антиоксидантних ферментов в митоходриях из печени и мозга крыс . 64
4.1 Уровень ПОЛ и антиоксидантний статус в митохондриях клеток мозга и печени взрослых крыс . 65
4.2 Возрастная динамика уровня ПОЛ и антиоксидантного статуса в митохдриях из мозга крыс, 72
4.3 Возрастная динамика уровня ПОЛ и антиоксидантного статуса в митохдриях из печени крыс. 84
4.4 Обсуждение результатов. 96
ГЛАВА 5. Изменение уровня перекисного окисления липидов и антиоксидантного статуса митохондрий под влиянием инсектицида каратэ на ранних этапах постнаталъного развития и у взрослых крыс. 103
5.1 Влияние каратэ в дозе 1/200 LDjo на изменение уровня перекисного окисления липидов и антиоксидалтный статус в митохондриях из мозга самок крыс 104
5.2 Влияние каратэ в дозе 1/200 LD50 на изменение уровня перекисного окисления липидов и антиоксидантный статус в митохондриях из мозга самцов крыс 107
5.3 Влияние каратэ в дозе 1/200 LD5o на изменение уровня перекисного окисления липидов и антиоксидантный статус в митохондриях из печени самок крыс 110
5.4 Влияние каратэ в дозе 1/200 LD5o на изменение уровня перекисного окисления липидов и антиоксидантный статус в митохондриях из печени самцов крыс. 112
5.5. Обсуждение результатов 114
ГЛАВА 6. Сравнение влияния инсектицидов каратэ и хлорофос в низких дозах на изменение уровня перекисного окисления липидов и антиоксидантныи статус в митоходриях крыс . 123
6.1 Изменение уровня ПОЛ и антиоксидантного статуса в митохондриях клеток мозга и печени крыс под действием каратэ в низких дозах. 123
6.2 Изменение уровня ПОЛ и антиоксидантного статуса в митохондриях клеток мозга и печени крыс под действием хлорофоса в низкой дозе. 126
Заключение 137
Выводы 148
Список литературы 150
Приложения
- Современные представления об экологической опасности применения инсектицидов
- Определение концентрации продуктов ПОЛ
- Анализ применения инсектицида «каратэ» на территории Волгоградской области
- Уровень ПОЛ и антиоксидантний статус в митохондриях клеток мозга и печени взрослых крыс
Введение к работе
В последние десятилетия, когда угроза глобального экологического кризиса коснулась самого человека, происходит быстрое проникновение идей и проблем экологии в другие области знания [Агаджанян Н.А.,1997, Акимова Т.А., Хаскин В.В. 1998]. Этот процесс получил название экологизации и отвечает потребности общества в объединении науки и практики для предотвращения экологической катастрофы.
Одним из постоянно действующих экологических факторов, представляющих реальную угрозу для окружающей среды, несомненно, являются химические средства защиты растений [Медведь Л.И., 1974, Майстренко В.Н. с соавт., 1996, Нефедов П.В. с соавт., 1999].
Применение инсектицидов в сельском хозяйстве с каждым годом увеличивается, наиболее перспективным классом инсектицидов являются пиретроиды [Каспаров В.А., 1990, Путинцева Л.С., Дремова В.П., 1999]. Считается, что при правильном применении пиретроиды не оказывают прямого токсического действия на людей и животных [Мельников Н.Н. с соавт., 1995], более того в последнее время ужесточаются требования к безопасности этих препаратов, и вводится комплексная оценка их токсичности [Сидоренко Г. И., Новиков С. М., 1999].
Тем не менее, пиретроиды разными путями в низких концентрациях могут попадать в организм млекопитающих и человека [Эйхлер В., 1993, Aldridge W.N., 1990, Forshow P.J., Ray D.E., 1990, Ripley B.D. et al., 2001]. В связи с этим, они могут рассматриваться как факторы малой интенсивности, потенциальную опасность которых оценить очень сложно. На современном этапе наиболее перспективным подходом к ршению подобных проблем гигиены окружающей среды является методика оценки потенциального экологического риска. Стратегия риска включает четыре этапа: идентификацию риска, оценку воздействия и оценку зависимости доза-ответ, характеристику риска. На этапе идентификации риска возможно использование не только гигиенических, но также физиологических, токсикологических, биохимических методов.
В последнее время появились работы, по изучению неспецифического влияния инсектицидов пиретроидного ряда на организм млекопитающих биохимическими методами [Москвичев Д.В. с соавт., 2000, Giray B.et al., 2001]. Токсичность в них оценивается преимущественно по изменению уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ) и активности антиоксидантных ферментов в крови и гомогенатах тканей. Однако большую значимость для организма, следовательно, большую критериальную ценность с точки зрения токсикологии, имеет изменение уровня ПОЛ в митохондриях, т.к. данные изменения могут приводить клетку к гибели [Скулачев В.П., 2001]. Исследования влияния некоторых пиретроидов на млекопитающих с использованием показателей состояния митохондрий [Акиншина Н.Г. с соавт., 2000] начали проводиться, но количество их пока невелико.
Пиретроидные препараты широко используются в мировой сельскохозяйственной практике с 80-х годов [Каспаров В.А., Промоненков В.К., 1990] изучение их действия "на людей и теплокровных имеет большое значение. Однако, влияние применяемого более 10 лет на территории Волгоградской области пиретроида каратэ на не целевые организмы практически не изучено.
Поэтому представляется чрезвычайно важным применение показателей уровня ПОЛ и антиоксидантного статуса митохондрий для оценки экологической опасности пиретроида каратэ в дозах, в которых это вещество может попадать в организм млекопитающих с пищей.
Работа выполнена на кафедре биохимии Волгоградской медицинской академии совместно с кафедрой общей гигиены и экологии.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Целью исследования являлось научное обоснование возможности применения показателей уровня перекисного окисления липидов и антиоксидантного статуса митохондрий в качестве критериальных при оценке воздействия на млекопитающих инсектицида каратэ в низких дозах на этапе идентификации экологического риска.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Проанализировать спектр, перспективность и частоту использования инсектицидов в сельскохозяйственной практике на территории Волгоградской области.
2. Изучить возрастные особенности и половой диморфизм антиоксидантного статуса митохондрий для дальнейшего использования при проведении токсикологических исследований.
3. Определить фактическую экспозиционную дозу каратэ, поступающую в организм грызунов в природных условиях и определить ее влияние на изменение уровня свободнорадикального окисления в митохондриях крыс.
4. Исследовать влияние инсектицида каратэ на процессы свободнорадикального окисления в митохондриях мозга и печени крыс на ранних стадиях онтогенеза и в зрелом возрасте с учетом полового диморфизма.
5. Идентифицировать для млекопитающих риск развития неблагоприятных эффектов при поступлении каратэ в низких дозах.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Проведен анализ и дана экологическая и токсикологическая характеристика пиретроиду каратэ как фактору малой интенсивности, действующему на млекопитающих на территории Волгоградской области.
Установлено влияние инсектицида каратэ в низких концентрациях на развитие процессов перекисного окисления липидов в митохондриях мозга и печени крыс.
Определено влияние инсектицида каратэ как фактора малой интенсивности на митохондрии крыс на разных этапах онтогенеза.
Описана динамика антиоксидантного статуса митохондрий крыс в зависимости от возраста и пола, что позволяет использовать их в дифференцированном мониторинге загрязнителей окружающей среды.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ
Определение возрастной динамики количества продуктов ПОЛ и активности основных антиоксидантных ферментов представляет практический интерес для экологов, педиаторов, гигиенистов и биохимиков в плане понимания становления детоксикационной системы организма.
Получены данные о влиянии низких, считающихся неопасными, доз каратэ на состояние митохондрий, а также выявлена зависимость этого влияния на митохондрии от возраста и пола.
Оценка дисбаланса между уровнем накопления продуктов перекисного окисления липидов и активностью антиоксидантных ферментов митохондрий может быть использована экологами для идентификации риска действия факторов окружающей среды малой интенсивности на разные возрастные группы.
Данные о возможном риске действия инсектицида каратэ на млекопитающих могут быть использованы для экологического мониторинга.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. Каратэ в дозах 1/200 LD50 и 1/50 LD50 оказывает влияние на окислительные процессы в митохондриях во всех возрастных группах. У взрослых крыс, преимущественно самок, развивается дисбаланс между изменением уровня накопления продуктов ПОЛ и активностью антиоксидантных ферментов, что может являться проявлением оксидативного повреждения митохондрий. У крыс на ранних стадиях онтогенеза изменения в изученных показателях более выражены, но однонаправленны.
2. Оксидативное повреждение митохондрий - чувствительный критерий идентификации экологического риска; изменения процессов ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов наблюдаются при таких дозах каратэ (1/200 LDso), которые ранее считались совершенно безвредными.
3. Интенсивность дыхания митохондрий изменяется только при действии каратэ в дозе 1/50 LD50, тогда как достоверные отличия в системе продукты ПОЛ/антиоксидантные ферменты отмечаются уже при действии каратэ в дозе 1/200 LD50.
4. Показатели уровня ПОЛ и антиоксидантного статуса митохондрий могут быть использованы в качестве критериальных при идентификации экологического риска при применении пиретроидов.
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ
По результатам выполненной работы разработаны рационализаторские предложения «Способ одновременного получения интактных митохондрий и препаратов мембраносвязанных митохондриальных ферментов» и «Способ количественного определения белка в мембранных препаратах с использованием биуретового реактива Пелли» и методические рекомендации «Идентификация экологического риска действия пиретроидов на млекопитающих с помощью тестирования уровня митохондриального ПОЛ».
Результаты исследования внедрены в практику работы профильных кафедр Волгоградского госуниверситета и Волгоградской
Сельскохозяйственной Академии, Волжского гуманитарного института.
Метод одновременного выделения тяжелых и легких митохондрий и определения концентрации белка в мембранных препаратах внедрен в практику исследовательской работы кафедры биохимии Волгоградской медицинской академии.
Отдельные фрагменты работы используются при проведении занятий со студентами на кафедре биохимии Волгоградской медицинской
• академии.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Основные положения работы доложены на межвузовских городских научно-практических конференциях «Медицина и охрана здоровья» (Волгоград, 1995 и 2002), на научных сессиях сотрудников ВМА (Волгоград, октябрь 1999г, октябрь 2001 г), на Чтениях Волгоградского отделения Международной академии авторов научных открытий и изобретений (Волгоград, май 2000), на межрегиональной научно- практической конференции, посвященной 50-летию РМГУ (Рязань, 2000), на заседаниях Волгоградского отделения Биохимического общества РАМН (Волгоград, ноябрь 1998, апрель 1999).
Материалы диссертации опубликованы в 5 печатных работах.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследования, четырех глав, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы.
Современные представления об экологической опасности применения инсектицидов
Первым широко используемым синтетическим пестицидом был ДДТ, который начали применять в 1945 году. Прибавка урожая была впечатляющей, уничтожались комары - переносчики малярии и желтой лихорадки, сохранялся урожай в зернохранилищах. Постепенно, однако, стали накапливаться данные, что синтетические пестициды приносят не только пользу. Вредители привыкли к новому пестициду, вновь стали уничтожать посевы и такая отрасль как производство хлопчатника в некоторых областях потерпела полный крах. Произошел рост числа заболеваний малярией, к тому же ее стало труднее лечить. Некоторые хищные птицы оказались на грани исчезновения, т.к. концентрация ДДТ в их организме в миллион раз превышала содержание в окружающей среде и скорлупа откладываемых яиц стала слишком хрупкой (Ревелль П., Ревелль Ч., 1994.). Постепенно были выделены несколько основных проблем применения пестицидов. 1. Эффект биологического усиления. Пестицид, попадая в организм животного, может накапливаться. Когда очередное животное из пищевой цепи поедает жертву, накопившую в своем организме яд, то оно получает более концентрированную дозу, чем содержится в окружающей среде, В результате организмы, стоящие на вершине пищевых цепей (например, человек), подвергаются наибольшей опасности. 2. Устойчивость пестицидов. Устойчивые пестициды могут накапливаться в почве и сохраняться в выращенных продуктах. Почвенные частицы могут с пыльными бурями или водой разноситься по всему свету и вызывать вторичное загрязнение продуктов, не подвергавшихся обработке пестицидами. 3. Устойчивость вредителей к пестицидам. При длительном применении пестицида в результате мутаций будут выживать только устойчивые к нему особи и постепенно вся популяция вредителей окажется невосприимчивой к данному препарату. К тому же могут гибнуть естественные хищники вредителей, ограничивающие их рост. В результате после применения пестицидов количество вредителей на полях может даже возрасти. 4. Влияние почвенных микроорганизмов. Почвенные микроорганизмы могут использовать постоянно применяющиеся пестициды в своем метаболизме, разрушать их и таким образом снижать эффективность их действия. Вычленение этих проблем привело к пересмотру подходов к требованиям, а также к оценке свойств и последствий применения пестицидов. Так, для характеристики степени токсического воздействия пестицидных препаратов на человека и теплокровных Минздрав утвердил следующие критерии токсичности (Сборник..., 1991): 1. Острая оральная токсичность (однократное введение препарата в желудок крысам) с определением ЛДз0: 2. Кожно-резорбтивная токсичность с однократным нанесением препарата на кожу (с оценкой токсического действия но критерию ЛД5п): 3. Коэффициент кумуляции (отношение суммарной дозы вещества, вызывающей гибель 50% подопытных объектов при многократном введении, к дозе, вызывающей гибель 50% объектов при однократном воздействии). 4. Стойкость в почве и другие. Большинство из этих показателей основаны на одном критерии токсичности - смертности. Достоверно они позволяют оценить только минимальное количество препарата, представляющее смертельную опасность. А что происходит с организмом, если на него воздействует меньшая доза? Для ответа на этот вопрос нужны комплексные исследования всех процессов гомеостаза в организме. Одной из актуальных задач экологии и гигиены окружающей среды на современном этапе является изучение на основе исследований физиологических, генетических, биохимических и других механизмов жизнедеятельности, общих закономерностей взаимодействия организма с химическими веществами и разработка наиболее объективных критериев гигиенической оценки и прогнозирования ранних, не являющихся патологическими, проявлений действия пестицидов. Среди 10-15 тысяч химических веществ, циркулирующих в настоящее время в среде обитания человека, пестициды относятся к веществам, с которыми контактируют миллионы людей. Сейчас уже невозможно найти такой участок на земной поверхности, который был бы совершенно свободен от остатков пестицидов. Однако так называемое «фоновое содержание» пестицидов обычно составляет (от массы почвы) несколько долей на миллиард. В таких концентрациях прямого токсического действия пестициды не оказывают. Реальная угроза для окружающей среды заключается в том, что они превратились в постоянно действующий экологический фактор, имеющий и положительные, и отрицательные последствия. К последним можно отнести миграцию многих соединений по трофическим цепям и их рассеяние в биосфере, вследствие чего токсиканты воздействуют на нецелевые организмы. Этот аспект действия пестицидов все больше привлекает внимание экологов (Измалков В.И., 1994, Черп О.М., 2001). Так как концентрации пестицидов в окружающей среде в обычных условиях относительно невелики, проявления интоксикаций малоспецифичны, носят скрытый характер. Однако под влиянием этих факторов может происходить снижение резистентности организма или развитие аллергических реакций. Кроме того, пестициды могут вызывать ряд отдаленных последствий. К числу отдаленных эффектов действия химических веществ на организм относятся мутагенное, канцерогенное, гонадотоксическое, тератогенное, ал л ер го генное, эмбриотоксическое, атерогенное и иммунотрпное действие. Как известно, отдаленными эти эффекты называются в связи с тем, что время их проявления может быть связано не только с самим объектом, подвергающимся воздействию химического фактора, но и с его потомством в разных поколениях (Сидоренко Е.Н., 1978, Калоянова-Симернова Ф.А., 1980, Экологический риск для здоровья населения, 2000, Черп О.М., 2001). Исходя из накопленных фактов о влиянии синтетических химических веществ на окружающую среду Международная Ассоциация производителей пестицидов совместно с ФАО, ВОЗ и другими организациями создала «Международный кодекс по распределению и использованию пестицидов» (Кодекс Алиментариус) (Вредное воздействие..., 1978). Для регистрации нового пестицида фирма обязана представить результаты испытаний действующего вещества и его препаративной формы (Соколов М.С. с соав., 1994): - физико-химические свойства (летучесть, растворимость, устойчивость к инсоляции и т.д.); - токсикологические характеристики (острая и хроническая токсичность для млекопитающих, токсичность основных метаболитов и составляющих ингредиентов препаративных форм); - данные биохимических и биокинетических исследований (механизм действия, метаболизм, поглощение и распределение в тканях биоты); - результаты токсикологических исследований (канцерогенность, мутагенность, тератогенность, нейротоксичность и т.д.); - данные о взаимодействии пестицида и его трансформации в растениях, воздухе, воде, почве, а также сведения о токсичности для птиц, рыб, пчел и т.д. Соблюдение данных требований позволяет избежать на современном этапе угрозы экологических катастроф, подобных вызванной применением пестицида ДДТ. Однако развитие химической промышленности привело к разработке огромного количества новых синтетических препаратов (например, пиретроидов 3-го поколения) с совершенно уникальными свойствами. Не исключено, что в будущем они могут вызвать последствия, опасность которых нам трудно сейчас представить, так же как не представляли ее разработчики ДДТ 60 лет назад. Поэтому интерес исследователей к проблемам воздействия синтетических пиретроидов на организм млекопитающих не снижается.
Определение концентрации продуктов ПОЛ
В качестве индикаторов интенсивности ПОЛ нами были выбраны конъюгированные диены и ТБК-реактивные продукты, поскольку они образуются на разных стадиях ПОЛ. 2.6.1. Определение концентрации конъюгированных диенов.
Впервые спектрофотометрический метод для определения интенсивности окисления полиненасыщенных жирнокислотных компонентов липидов был использован еще в 1943 г. Э. Фармером (Farmer E.N. et all., 1943). В настоящее время существует множество вариантов определения концентрации продуктов ПОЛ в области поглощения УФ спектра от 215 до 268 нм.
В своей работе мы использовали методику, описанную Ушкаловой В.Н, с соавторами (1985), созданную на основе метода Плацера (1970). 200 мкл исследуемой суспензии экстрагировали 2 мл смеси гсптан-изопропанол, взятых в соотношении 1:1, в течение 1 мин. Далее проводили центрифугирование в течение 10 мин. при 3000 g. Для разделения фракций добавляли 200 мкл воды, отстаивали в течение 5 мин. Верхняя фаза -гептановая, нижняя - изопропанольная. Отбирали 200 мкл гептановой фазы, добавляли к ней 2 мл этанола и сразу спектрофотометрировали в кварцевых кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм при длине волны поглощения 232 нм на спектрофотометре СФ-26. Оптическая плотность пропорциональна количеству продуктов ПОЛ, содержащих сопряженные двойные связи. Количество КД приводили в Е232/ мг белка. Одним из основных продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), является малоновый диальдегид. Поэтому данная реакция является общепринятой при определении интенсивности образования продуктов ПОЛ. Мы использовали спектрофотометрический метод, предложенный Андреевой Л.И. с соавторами (1988). К 150 мкл биологического материала добавляли 1,5 мл 10% ортофосфорной кислоты, 0,5 мл 1% тиобарбитуровой кислоты и 100 мкл сульфата железа (II). Затем выдерживали на водяной бане при 100С в течение 1 ч, после чего добавляли 2 мл бутанола, перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин на центрифуге ОПН-3. После центрифугирования осторожно отбирали верхнюю фазу и спектрофотометрировали против бутанола при длине волны поглощения 535 им в кварцевых кюветах на спектрофотометре СФ-46. Расчет содержания ТБК-реактивных продуктов с учетом коэффициента молярной экстинкции и разбавления производили по формуле Е535 85,47 мкмоль/мл/мг белка. Активность СОД определяли спектрофотометрически по степени ингпбирования окисления кверцетина методом Костюка В.А, с соавторами (1990). Определение проводили следующим образом. В две пробирки вносили по 3,4 мл буфера, содержащего ТМЭД — инициатор окисления кверцетина и 100 мкл кверцетина. Затем в одну добавляли 50 мкл среды выделения митохондрий, а в другую 50 мкл биологического материала контрольная и опытная пробы. Спектрофотометрировали при длине волны 406 нм в 10 мм пластиковых кюветах сразу же и через 20 минут. Нулевая проба не содержала кверцетина, но содержала для контроля среду выделения митохондрий, а для опыта - биологический материал. По разнице оптической плотности кверцетина в начале и конце реакции вычисляли степень ингпбирования его окисления супероксиддисмутазои. За 1 условную единицу (у.е.) принимали 50% ингибирование. Активность фермента выражали в у.е. на мг белка. Глутатион-пероксидазную активность определяли спектрофотометрически по убыли восстановленного глутатиона в реакции с гидроперекисью трет-бутила (ГПТБ) методом Моина В.И. (1986). Для дифференцировки пероксидазной активности глутатионпероксидазы (GP) и глутатион-8-трансферазы (GST) нами был применен ингибиторный анализ (Мохова Н.А., 1999). В качестве конкурентных ингибиторов GP и GST были использованы меркаптосукцинат и 2-оксоглутаровая кислота соответственно. Определение проводили следующим образом. В две микропробирки объемом 1,5 мл вносили по 50 мкл биологического материала -контрольная и опытная пробы, В контрольной пробе белок осаждали 100 мкл 20% ТХУ. Затем в обе пробирки вносили по 50 мкл раствора ингибитора: 1мМ меркаптосукцината или 10 мМ оксоглутарата, или 50 мкл буфера для определения общей глутатионпероксидазной активности. После этого добавляли 400 мкл 0.1 М tris-HCl буфер рН 8.5, содержащий 6 мМ ЭДТА, 12 мМ азид натрия и 4.8 мМ GSH, и 50 мкл 20 мМ ГПТБ. После 5 мин инкубации при комнатной температуре реакцию в опытной пробе останавливали осаждением белка с помощью 20% ТХУ. Затем пробы центрифугировали 10 мин при 6000 об/мин на центрифуге ОПН-8. К 50 мкл надосадочной жидкости добавляли 2 мл раствора ДНБК (реактива Эллмана), После инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин спектрофотометрировали против реактива Эллмана при длине волны поглощения 412 нм на спектрофотометре СФ-46 в акриловых кюветах с длиной хода луча 10 мм. Ферментативную активность определяли по разности концентрации GSH в опытной и контрольной пробах и выражали в ммоль GSH/мин/мг белка.
Анализ применения инсектицида «каратэ» на территории Волгоградской области
Каратэ (5% Э.К.) используют для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур (зерновых, масличных, овощных, для опрыскивания хлопка и плодовых деревьев) и для борьбы с вредителями запасов (обработка незагруженных помещений и территорий зернохранилищ), применяют для опрыскивания заготовленной древесины (Мельников Н.Н. с соавт., 1995, Список пестицидов, разрешенных к применению в Российской Федерации, 1997).
Лямбдацигалотрин за рубежом используют для обработки скота в целях уничтожения клещей Boophilus и мух-жигалок ( Davey R.B. et al.,1992, Stubbs V К et al, 1982).
В Средней Азии лямбдацигалотрин нанесенный на разные типы поверхностей (дерево, глина, шифер и др.), обеспечивал 100% гибель комаров в течение 80 суток (Лабзин В,В. с соавт., 1991). В Малайзии при обработке деревянных построек лямбдацигалотрин обеспечивал гибель комаров в течение 20-56 сут (Sallehudin S. et.al., 1993). Комитетом Экспертов ВОЗ установлены диагностические концентрации, с помощью которых определяют уровень чувствительности комаров к препарату (Резистентность..., 1995). Эффективность Каратэ - высокоэффективный пиретроид для борьбы со всеми основными вредителями на самых разнообразных культурах. Особенно эффективен против колорадского жука, гусениц (Список пестицидов..., 1997). Эффективность 5% э.к. Каратэ была изучена в практических условиях на базах дезстанций в Москве и Твери. В соответствии с разработанными методическими указаниями для борьбы с тараканами использовали 0,001% водные эмульсии, для борьбы с мухами, клопами и блохами — 0,0005%. Общая площадь обработок составила более 29 тыс. кв. м. Численность насекомых до обработок была значительной. Обработке подлежали прачечные, подсобные помещения столовых, административные помещения завода и больницы. Установлено, что паралич у насекомых наступал через 15—40 мин после проведения обработки, через сутки на объектах регистрировали только единичных насекомых. Через 48 час объекты были полностью освобождены от насекомых. Насекомые отсутствовали на объектах в течение 30 сут (срок наблюдений) (Путинцева Л. С, Дремова В. П., 1999). Однако пиретроиды не обладают системным и овицидным действием и неэффективны против растительноядных клещей. Поэтому они не могут полностью заменить системные инсектициды и акарициды, а также инсектициды для борьбы с почвообитающими вредителями, так как быстро разрушаются в почве. Кроме того, к пиретроидам при систематическом их применении у насекомых может выработаться устойчивость (Мельников Н.Н.с соавт., 1995). Токсикодииамика: механизм действия Лямбдацигалотрин обладает нейротоксическим действием. Как все пиретроиды действует на нервную систему насекомых, резко парализуя ее, что очень быстро нарушает их способность передвигаться, а затем ведет к гибели в результате общего паралича всех органов. Существует 3 типа нейротоксического действия: действие на Ыа+-каналы и невозможность передачи сигнала через синапс действие на СГ-каналы и снижение порога чувствительности при передаче нервного импульса действие на Са +-каналы и нарушение мышечного сокращения. Основной мишенью действия пиретроидов являются чувствительные к изменению напряжения натриевые каналы мембран нервных клеток центральной и периферической нервной системы наземных членистоногих. Пиретроиды индуцируют медленно прогрессирующую, необратимую деполяризацию мембраны, которая сопровождается постоянным потоком ионов натрия внутрь аксона. Это приводит к блокаде потенциала действия и нервной проводимости. Предполагают, что воздействие пиретроидов на натриевые каналы осуществляется через лппидную фазу плазматической мембраны или через мембранные рецепторы, расположенные рядом с каналами (Laufter J. et. al., 1985, Chang СР., Plapp F.W., 1983). Кроме того, Schouest L.P. et al. (1986) показан механизм блокировки пиретроидами нервно-мышечной передачи в нервной системе насекомых. Проявляющиеся симптомы отравления пиретроидами являются результатом воздействия на натриевые каналы пресинаптических нервных окончаний нервно-мышечных синапсов. Деполяризация в этом случае приводит к возрастанию выброса неиромедиатора, а в дальнейшем - к истощению пузырьков на пресинаптической мембране из-за непрерывного возбуждения и выделения медиатора. Schouest L.P. et al. (1986) удалось выявить указанные ультраструктурные изменения в нервно-мышечных окончаниях и доказать их связь с блокадой нервной проводимости. Концентрации пиретроидов, вызывающие ингибирование тормозящих нервно-мышечных синапсов, существенно выше тех, которые вызывают изменения натриевых каналов. Так, установлено, что дельтаметрин обладает способностью модифицировать натриевые каналы в концентрации а его способность блокировать у насекомых рецепторы синаптических мембран, регулирующие транспорт ионов хлора через хлорные каналы, проявляется только в концентрации 10 10"7M(NarahasyiT.f1987). Есть сведения о том, что пиретроиды обладают способностью ингибнровать различные Ca f- АТФ-азы в нервной системе насекомых в интервале концентраций 10"7-10"8М (Katz L.S.,Marguis J.К, 1989). Токсикокинетика. Как известно, многие пестициды, обладая высокой липофильностью.
Уровень ПОЛ и антиоксидантний статус в митохондриях клеток мозга и печени взрослых крыс
Интенсивность дыхания определялась для оценки общего функционального состояния митохондрий. Исследования показали (табл.4.1.1), что в мягких условиях митохондрии мозга поглощали в 2 раза больше (р 0,05) кислорода на миллиграмм митохондриального белка, чем митохондрии печени. Этот факт можно объяснить тем, что в митохондриях печени у взрослых крыс активно функционирует гораздо большее количество ферментных систем, чем в митохондриях мозга. Отношение белки дыхательной цепи /все митохондриальные белки в печени будет меньше, чем в мозге, следовательно, и поглощение кислорода на мг митохондриального белка в печени будет меньше. С другой стороны большая скорость поглощения кислорода может быть вызвана частичным разобщением дыхания и фосфорилирования (Ротенберг Ю.С., 1980, Скулачев В.П., 1999) в митохондриях мозга. Различий между самцами и самками обнаружено не было. Для оценки интенсивности ПОЛ в митохондриях клеток определяли уровень содержания КД и ТБК-РП (табл.4.1.1). Полученные данные показали, что содержание продуктов ПОЛ в митохондриальной фракции мозга выше, чем в печени. При этом уровень ТБК-РП в мозге выше в 10 раз (р 0,05) у самок и в &ь5 раз (р 0,05) у самцов, а уровень КД. по сравнению с печенью увеличен только в 2,35 раза (р 0,05) и только у самцов. Многие авторы считают, что накопление в митохондриях мозга малонового диальдегида, липофуцина и других конечных продуктов ПОЛ, является индикатором их деструкции, более ранней по сравнению с другими органами (Гусев В.А., Панченко Л.Ф.. 1997, Анисимов В.Н., 2000, Sohal R.S, Brunk U.T., 1989). Одной из причин может быть увеличение с возрастом в мозге продукции АФК. в связи с повышением активности моноаминооксидазы (Волчегорский И.А. с соавт, 2001), продуцирующей bTjOi, которая сама повреждает мембраны и снижает активность СОД (Лущак В.И., 2000). Именно более высокое содержание продуктов ПОЛ в митохондриях мозга может косвенно подтвердить рост АФК и возможность разобщения дыхания (Скулачев В.П., 1999, Лущак В.И., 2000), способствующее повышению скорости поглощения кислорода, как и наблюдается в нашем исследовании. Интенсивность ПОЛ отличается у разнополых крыс. У самок в митохондриях мозга количество КД в 1,5 раза выше чем у самцов (р 0,05). При этом уровень ТБК-РП достоверно не отличался. В печени у самок содержание КД значительно - в 4 раза - вьше (р 0,05), однако содержание ТБК-РП наоборот в 2 раза (р 0,05) меньше, чем у самцов. В некоторых исследованиях отмечаются половые отличия, как в количестве продуктов ПОЛ, так и в действии на их уровень антиоксидантов (Сергеев П.В., 1999). В работе MB. Козак (2000) отмечается более высокое содержание ТБК-РП в гомогенате печени самцов по сравнению с самками, что совпадает с нашими данными. Состояние АОС оценивали по общей глутатионпероксидазной активности (ГП-активности) и активности супероксидднсмутазы (СОД) (табл. 4.1.2). В печени и у самок и у самцов активность обоих ферментов примерно в 2 раза выше, чем в мозге, что согласуется с литературными данными (Герасимов A.M. с соавт.,1976, De Marchena О. et.al., 1974). Установлено, что активность СОД не имеет отличий у самцов и самок. Однако глутатиоппероксидазная активность у самцов выше, чем у самок на 30% (р 0,05} и 60% (р 0,05) в мозге и печени соответственно. Если рассматривать вклад в общую глутатионпероксидазную активность ферментов глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы, то можно сделать следующие наблюдения. В мозге вклад этих ферментов в глутатионпероксидазную активность примерно одинаковый, а в печени больший вклад в общую активность вносит глутатионпероксидаза. В мозге у самок отличия в активности ферментов недостоверны, у самцов активность глутатионпероксидазы выше активности глутатионтрансферазы в 1,5 раза. В печени самок активность глутатионпероксидазы по сравнению с глутатионтрансферазой выше в 1,34 раза. У самцов данный показатель выше в 1,94 раза. Эти результаты согласуются с литературными данными о качественных и количественных различиях в изоферментном составе белков, обладающих ГП-активностью, у самцов и самок (Ookawa К. at. al., 1998). Отличия общей ГП-активности между самцами и самками обусловлены более высокой активностью глутатионпероксидазы у самцов, как в мозге, так и в печени. При этом в литературе отмечается большая активность глутатионтрансферазы в печени у самцов по сравнению с самками (Колесниченко Л.С, КулинскиЙ В.И., 1989). Возможно, такое распределение больше характерно для цитоплазматической, а не митохондриальной фракции клеток печени. Обращает на себя внимание тот факт, что в митохондриях клеток печени активность ферментов выше, чем в мозге, при этом концентрация продуктов ПОЛ ниже. Можно предположить, что антиоксидантная система в печени более эффективна, в то время как в мозге наблюдается иной баланс между уровнем продуктов ПОЛ и активностью антиоксидантных ферментов. При этом в митохондриях самок по сравнению с самцами наблюдается повышенное содержание КД, но пониженное содержание ТБК-РП и в мозге и в печени, хотя активность ферментов в мозге одинакова, а в печени отличается только общая ГП активность. Повышенное содержание ТБК-РП с одновременным повешением ГП-активности у самцов можно объяснить стимуляцией ГП продуктами ПОЛ, описанную у разных авторов (КулинскиЙ В.И., Колесниченко Л.С., 1993, Ланкин В.З. с соавт., 2000, Вартанян Л.С.,2001). Таким образом, все показатели имеют выраженные межорганные различия. Причем антиоксидантная защита сбалансирована в митохондриях печени и мозга по-разному. Уровень продуктов ПОЛ достоверно отличается у самцов и самок. По активности ферментов о половом диморфизме можно говорить только в митохондриях печени и только для ГП. Нельзя исключать, что на процессы свободнорадикального окисления в митохондриях оказывают влияние половые гормоны. Наличие межорганных различий и полового диморфизма в интактных митохондриях взрослых крыс, позволяют использовать их в качестве модели для соответствующей дифференцированной оценки токсического действия химических агентов на организм млекопитающих.
