Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы
1.1. Экспериментальные подходы, используемые для получения и изучения свойств изолированных субъединиц олигомерных ферментов..8
1.2. Структура ГАФД и прявления взаимодействия субъединиц в олигомерной молекуле фермента 24
1.3. Факторы, влияющие на функционирование ГАФД в физиологических условиях ...44
Экспериментальная часть
2.1. Материалы . 50
2.2. Получение 1,3-дифосфоглицерата 51
2.3. Выделение ГАФД из пекарских дрожжей 52
2.4. Выделение фосфоглицераткиназы из пекарских дрожжей 53
2.5. Иммобилизация ферментов 55
2.6 Определение концентрации белка
2.6.1. Определение концентрации растворимого белка 57
2.6.2. Определение концентрации -иммобилизованного белка 58
2.,7. Определение активностей ферментов ...59
Результаты и их обсуждение
3.1. Получение нативных мономеров ГАФД 61
3.2. Получение иммобилизованных мономеров ЛДТ .. 73
3.3. Получение иммобилизованных тримеров ГАФД 80
3.4. Проявление межсубъедини чной кооперативности ГАФД в катализе . 91
3.5. Комплекс ГАФД с фосфоглицераткиназой 109
3.6. Влияние образования комплекса ГАФД с фосфоглицераткиназой на кооперативность активных центров ГАФД .115
Заключение 120
Выводы 122
- Структура ГАФД и прявления взаимодействия субъединиц в олигомерной молекуле фермента
- Выделение фосфоглицераткиназы из пекарских дрожжей
- Определение концентрации -иммобилизованного белка
- Проявление межсубъедини чной кооперативности ГАФД в катализе
Введение к работе
Последние десятилетия развития энзимологии ознаменовались решающими достижениями в раскрытии механизмов действия мономерных ферментов. Однако механизмы действия и сам смысл существования ферментов-олигомеров остается во многом невыясненным. Причем, если изучение гетероолигомерных ферментов идет относительно успешно и положение о разделении регуляторних и каталитических функций неодинаковых субъединиц является общепризнанным, то выяснение механизмов действия энзимов, состоящих из идентичных субъединиц, оказалось очень сложной задачей.
К настоящему времени описано немало ферментов, построенных из одинаковых субъединиц, характерным свойством которых является разнообразие проявления кооперативности между активными центрами олигомера. Для некоторых из них получены доказательства взаимодействия активных центров в ходе катализа, что подчеркивает особую важность выяснения молекулярных механизмов специфических белок-белковых взаимодействий, лежащих в основе этого явления.
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД) служит удобным объектом для такого рода исследований. На этом модельном ферменте детально изучена кооперативность активных центров тетрамера в отношении связывания кофермента (НАД) и явление "полуцентровой реактивности"; сделаны первые шаги в выяснении механизмов этих явлений. Демонстрация каталитической кооперативности субъединиц позволила отнести ГАФД к числу ферментов, функционирующих по механизму "флип-фяоп", предполагающему тесное сопряжение отдельных стадий реакций на соседних субъединицах. Роль специфических белок-белковых взаимодействийвшшгомерной молекул фермента может быть, таким образом, связана с обеспечением термодинамических
преимуществ, благодаря которым отдельная неактивная субъединица
приобретает в составе макромолекулы способность к катализу. Существует, однако, альтернативная возможность, обычно не рассматриваемая в тех случаях, когда фермент функционирует по механизму "флип-флоп". Эта возможность предполагает, что изолированные субъединицы олигомера полностью способны к катализу. В этом случае кооперативность активных центров, возникающая при ассоциации субъединиц в тетрамер,уже не может рассматриваться как обязательная предпосылка катализа. Ее роль, очевидно, должна заключаться в определенном изменении каталитических свойств мономера, вызванном образованием контактов с соседними субъединицами.
Основной задачей нашей работы явилась попытка разграничить эти две возможности применительно к ГАФД. При этом мы полагали, что поставленная задача выходит за рамки исследования отдельного фермента, а ее решение поможет выявлению определенных закономерностей в механизме действия ферментов - олигомеров, построенных из одинаковых субъединиц.
В качестве экспериментального подхода мы решили использовать сравнительное исследование свойств мономерной и олигомерной форм фермента, полученных в стабильном состоянии путем иммобилизации на нерастворимом носителе.
Нам удалось, впервые получить нативный мономер ГАФД, полностью сохранивший каталитическую активность, и способный к ре-ассоциации с субъединицами из раствора. Причем, разработанный метод получения отдельной субъединицы олигомерного фермента может быть использован и для изучения других олигомерных ферментов.
Использование иммобилизованного мономера, а также различных способов диссоциации и реассоциации субъединиц ГАФД, позволило получить различные олигомерные формы дегидрогеназы, иммобилизованные на носителе: димеры,тримеры, а также олигомеры-гибриды,
построенные из нативных и химически модифицированных субъединиц. Изучая каталитические свойства субъединицы фермента до и после её реассоциации с другими субъединицами, мы ожидали выяснить, какое влияние оказывает образование межсубъединичных контактов на функционирование активного центра этой субъединицы. Так, было важно проверить, как сказывается на активности субъединицы собственно наличие контактов с соседней (соседними) субъединицей при отсутствии влияния, исходящего из другого активного центра. Для этого были найдены условия, при которых химическая модификация активного центра одной субъединицы не отражалась на активности соседних.
Сравнение каталитических свойств разных иммобилизованных форм ГАФД в прямой и в обратной реакции привело нас к заключению, что кооперативность активных центров олигомера выявляется лишь в определенных условиях, то есть не может считаться предпосылкой катализа. Было также установлено, что каталитическая кооператив-ность сохраняется в изолированном димере и заключается, по-видимому, в попеременном функционировании соседних активных центров.
Исходя из представления о том, что данное свойство фермента
зависит от конформационных изменений, передающихся по межсубъеди-
ничным контактам, мы считали вероятным влияние на кооперативность
активных центров олигомера со стороны факторов, способных изме
нять (или фиксировать) конформационное состояние белка. К числу
таких факторов может относиться взаимодействие с функционально
связанными ферментами. Поэтому мы разработали условия получения
комплекса ГАФД с фосфоглицераткиназой и исследовали каталитичес
кие свойства мономерной и олигомерных форм фермента в составе
таких комплексов. Полученные результаты показали, что специфичес
кие белок-белковые взаимодействия, возникающие между двумя функ
ционально связанными ферментами, , действительно
способны изменить характер кооперативности активных центров.
Б целом результаты настоящей работы показали, что наличие каталитической активности у отдельной субъединицы олигомерного фермента и ярко выраженная кооперативность активных центров субъединиц явления совместимые, и позволили охарактеризовать механизмы регуляции активности мономера ГАФД путем специфических белок-белковых взаимодействий разной природы.
В соответствии с задачами, стоявшими перед нами при выполнении экспериментальной части исследования, обзор литературы включает рассмотрение работ, посвященных получению изолированных субъединиц олигомерных ферментов, а также суммирует основные сведения об особенностях четвертичной структуры ГАФД и различных проявлениях кооперативности активных центров тетрамера.
Заключительный раздел литературного обзора посвящен изучению регуляции функционирования ГАФД в физиологических условиях.
Остальная часть диссертации включает экспериментальный раздел, в котором описаны методы исследований, обсуждены полученные результаты. Мы сочли необходимым суммировать основные итоги работы в кратком заключении.
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Структура ГАФД и прявления взаимодействия субъединиц в олигомерной молекуле фермента
Тетрамерная молекула ГАФД, тлеющая молекулярную массу около 144000 Фа , СОСТОИТ из идентичных по химическому строению субъединиц, молекулярный вес которых равен 36000, включающих приблизительно 330 аминокислотных остатков. Каждая из субъединиц организована в пространстве в два функциональных домена-нуклеотид-связывающий и каталитический и содержит одну высокореактивную Н -группу / 18, 54J. Исследование механизма реакции окисления 3-фосфоглицеринового альдегида привело к представлению о непосредственном участии SH-группы в образовании фермент-субстратного комплекса /"76_7.
Исследование стехиометрии связывания коэнзима (НАД) с ГАФД, проведенное различными авторами (равновесный диализ /"27,32,337 , ультрацентрифугирование /38/, спектрофотометрическое титрование /7,I22/J флуориметрическое титрование /б7,ГШ7)позволило установить, что присоединение осуществляется к каждому.из четырех активных центров олигомера. Связывание коэнзима вызывает структурные изменения молекулы ГАФД, делая ее более "компактной" и приводит, по-видимому, к переориентации субъединиц в тетрамере. Конформационные сдвиги,сопровождающие присоединение НАД , вероятно, лежат в основе кооперативности, обнаруживаемой при последовательном насыщении отдельных активных центров.
Так, связывание НАД" с ГАФД из мышц кролика / 73_7, омара /387, осетра /257 и определенных условиях характеризуется отрицательной кооператив-ностью, то есть ослаблением сродства к коэнзиму по мере заполнения активных центров. Первые два эквивалента НДЦ+ к молекуле ГАФД из мышц кролика присоединяются очень прочно, с константами диссоциации 10 М и 10 - 10 М для первого и второго центра. Третья и четвертая молекулы связываются слабее: константы диссоциации равны: 3 10 и 4 10 М соответственно (3С, рН 7,4) /"138У. Причем при повышении температуры в этой работе наблюдалось постепенное исчезновение отрицательной кооперативности и различий между константами диссоциации четырех молекул НДЦ+/"138_/ .
Зависимость прочности связывания каждого из четырех.эквивалентов НАД+ от степени насыщения лигандом активных центров можно объяснить в рамках выдвинутого Кошландом [ 32 J представления о передаче конформационных изменений, индуцируемых присоедине-неием коэнзима к одной из субъединиц, на соседние. В ряде работ /"13,120.7 было показано, что наиболее существенные конформацион-ные изменения наступают при полунасыщении тетрамера ГАФД коэнзимом, тогда как эффект третьего и четвертого эквивалентов НАД+ оказывается менее выраженным. Это позволило выдвинуть предположение о существовании двух типов коэнзим-связывающих участков, отличающихся по сродству к НАД+, что было впоследствии подтверждено в целой серии работ Сейду и Бернхарда на ферменте из мышц осетра С 88,89,122, 126 7.
Более сложный тип кооперативности свойствен дрожжевому ферменту. В определенных условиях от сочетает черты как положительной, так и отрицательной кооперативности. Константы ассоциации для четырех последовательно заполняющихся центров оказались равными 4,5-10%; 1,4 10%; 7,5- Ю4М; 3,6-10% при 4С и рН 8,5 33j. Причем при повышении температуры до 40С связывание становится положительно кооперативным / 697, а при нейтральных
рН и 20С НАД4 одинаково прочно связывается со всеми активными центрами фермента /22j, Характер зависимости сродства отдельных активных центров к НАД4- по мере их насыщения оказалось возможным объяснить на основании модели, допускающей возникновение последовательных конформационных изменений, передающихся с одной субъединицы на другую по контактам разных типов /I3Q/.
Хотя возможность предшествующей ассиметрии активных центров апофермента ГАФД исключить нельзя (см.стр.29 ), этот фактор вряд ли следует считать ответственным за все многообразие кооперативных эффектов, наблюдаемых цри связывании НАД4" дегидрогеназой из различных источников. Существование четырех различных констант связывания НАД - с ГАФД из мышц кролика, а также сложный характер кооперативности у дрожжевого фермента указывают на вовлечение разных типов контактов между субъединицами в их взаимное влияние и не могут быть объяснены лишь на основании представления о пред-существующей асимметрии олигомера.
Выделение фосфоглицераткиназы из пекарских дрожжей
Все выделение проводили при комнатной температуре. Цитолиз дрожжей осуществляли путем инкубации в растворе аммиака. К литру 0,5М раствора аммиака, содержащего I г ЭДТА (динатриевая соль), интенсивно перемешиваемого, медленно добавляли 450 г высушенных дрожжей - эта процедура занимала 30 минут. Образовавшиеся сгустки размельчали и перемешивание продолжали в течение нескольких часов. Студнеобразную массу оставляли на ночь. На следующий день перемешивание продолжали: в общей сложности оно осуществлялось в течение 20-24 часов после добавления дрожжей. Затем добавляли 800 мл 0,5М молочной кислоты; рН доводили до 7,0 охлажденной 5М молочной кислотой, доведенной до рН 3,5 аммиаком. Смесь центрифугировали при 20000 в течение 15 минут, осадок отбрасывали. К экстракту добавляли сульфат аммония (100 г на литр); рН доводили до 4,3, используя холодный раствор 5М лактата аммония. Во время добавления лактата аммония смесь тщательно перемешивали для уменьшения степени денатурации белка. После стояния в течение 10 минут при рН 4,3 смесь центрифугировали (20000л , 15 мин). Осадок отбрасывали. Снова добавляли сульфат аммония (250 г на литр супернатанта), и растворяли его в течение 15 минут. После 30-минутного стояния центрифугировали как описано выше. Суперна -54-тант отбрасывали. Осадок растворяли в 800 мл 40 мМ Трис (основание), содержащем I мМ ЭДТА, рН раствора доводили до 7,5 добавлением ЕЛ Триса. К полученному раствору при перемешивании добавляли 340 г сульфата аммония на литр в течение 15 минут. После 30-минутного стояния образовавшийся осадок отделяли центрифугированием и отбрасывали. Снова добавляли сульфат аммония (150 г на литр), образовавшийся осадок отделяли центрифугированием, как указано выше. Этот осадок растворяли в небольшом объеме I мМ ЭДТА, рН 7,0.
Раствор обессоливали гель-фильтрацией через колонку с сефа-дексом $-25 (1,5 см х 30 см) и добавляли к нему раствор прота-мин-сульфата (I г на 50 мл воды), доводили до рН 7,0 Трисом. Полученный осадок удаляли центрифугированием. Затем к супернатан-ту добавили 0,01 объема IM Триса.и рН понизили до 6,0 Ш каколиловой кислотой. Этот раствор после разведения-буфером (10 мМ Трис, I мМ ЭДТА, доведенный до рН 6,0 какодиловой кислотой) до 800 мл, помещали на колонку с КМ-иеллгалозой (16 см х 30 см, уравновешенную Трис-ЭДТА-какодилатным буфером).
После нанесения всего количества белка на колонку, начинали элюцию линейным градиентом KCI. Для образования градиента использовали смеситель, состоящий из двух сосудов, один из которых содержал I л буфера, а другой I л буфера, приготовленного на 0,2М KCI. Скорость тока - 120 мл/ч. Объединяли фракции, содержавшие больше 300 единиц активности киназы на мл. Белок осавдали, добавляя 600 г сульфата аммония на литр элюата. Осадок собирали центрифугированием при 20000 ff в течение 30 мин и растворяли в небольшом объеме воды. Раствор доводили до объема 40-50 мл еще раз центрифугировали. Отбирали 30 мл и наносили их на колонку с се$а-дексом Q-I00 (8 см х НО см); для уравновешивания колонки использовали 10 мМ имидазол, содержащий 0Д5М /УаСІ и I мМ ЭДТА,рН 7,0.
Элюпдю проводили в течение ночи со скоростью тока 30-40 мяв час. Аналогичным образом обрабатывалась вторая половина раствора. Фракции, содержавшие активность объединяли; белок высаливали, добавляя 600 г сульфата аммония на литр. Осадок растворяли в 20 мМ К -фосфатном буфере рН 6,5. К полученному раствору осторожно добавляли насыщенный раствор сульфата аммония, при этом концентрация белка,составляла около 20 мг/мл. мутный раствор оставляли при комнатной температуре для кристаллизации, которая занимала несколько дней.
Круглодонную колбу на 50 мл устанавливали в ледяной бане на магнитную мешалку, помещали в нее бромі магнит. Горлышко колбы закрывали притертой делительной воронкой с раствором КСУ в воде. На 2,6мл%брали 0,2 мл дистиллированной воды и 3,6 г КСУ в 20 мл воды. Раствор КСУ добавляли по каплям из делительной воронки в колбу, содержимое которой интенсивно перемешивалось до перехода красно-коричневого цвета раствора в светло-желтый. После окончания добавления цианида содержимое колбы перемешивали еще 10 минут, а затем ВгС// перегоняли при температуре 80-90 в глицериновой бане в сухую колбу с притертым шлифом.
Активация сефарозы 4В.
Сефарозу промывали 0,1М фосфатом натрия рН II, затем бидис-тиллятом до нейтрального рН и слегка подсушивали током воздуха на стеклянном фильтре. Затем сефарозу взвешивали и заливали холодным ІМ фосфатом натрия (I мл на I г сефарозы), добавляли 20$ раствор ВтСУ в диоксане и, после непрерывного перемешивания в течение 8 мин, переносили на стеклянный фильтр и промывали холодным бидистиллятом и 100 мМ фосфатом натрия, содержащим 5 мМ ЭДТА рН 8,3.
Количество БгСУ, добавляемого к сефарозе, варьировало в зависимости от требуемой для данной иммобилизации степени активации сефарозы: для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы - 3 мг на I мл уплотненной сефарозы, для фосфоглицераткиназы -20 мг В?СУ t для лактатдегидрогеназы - 5 мг В7С/ и 50 мг ВгС/К
Определение концентрации -иммобилизованного белка
Концентрацию иммобилизованного белка определяли, измеряя оптическую плотность суспензии сефарозы в растворе полиэтиленгликоля / ПЭГ, молекулярный вес 20000/при 280 нм /"48 У . Использование ПЭГ основано на его способности уменьшать светорассеяние на частицах сефарозы.
0,2 - 1,0 мл суспензии иммобилизованного на сефарозе белка помещали в кварцевую кювету с длиной оптического пути I см и добавляли 50% раствор ПЭГ до объема 3 мл. Смесь тщательно перемешивали так, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха. Измерение оптической плотности проводили относительно контрольной пробы, в которую помещали такой же объем сефарозы, как и в опытную, но сефароза не содержала ковалентно связанного белка.
Количество белка в опытных пробах вычисляли по калибровочной кривой, которая была получена следующим образом. К постоянному количеству неактивированной сефарозы, объем которой был равен объему сефарозы в исследуемом опытном образце, добавляли увеличивающиеся количества белка. Объем доводили до 3 мл Ъ0% раствором ПЭГ, после чего смесь перемешивали и определяли оптическую плотность по отношению к оптической плотности сефарозы в кювете, не содержащей белка. Этим методом можно определить до 10 мкг связанного с сефарозой белка.
Количество фосфоглицераткиназы, связавшейся с иммобилизованной ГАФД, определяли таким же образом в ПЭГ, но в контрольный препарат вместо неактивированной сефарозы добавляли соответствующий препарат иммобилизованной ГАФД, свободной от киназы. Калибровочный график строили, добавляя в контрольную пробу увеличивающиеся количества фосфоглицераткиназы.
В данной работе содержание белка в; различных препаратах иммобилизованных ферментов характеризуется количеством мкг белка, приходящимся на I мл уплотненной / центрифугирование при 3000 о / сефарозы.
Активность растворимой и иммобилизованной ГАФД из пекарских дрожжей в прямой реакции / окисление 3-фосфоглицеринового альдегида / определяли в 0,1 М Трис-CI буфере, рН 7,9. Концентрация ЭДТА в кювете составляла 5 мМ; НАД4" - 400 мкМ при работе с растворимым ферментом и 2 мМ - при работе с иммобилизованным; З -ФГА -400 мкМ при работе с растворимым и 1,5 мМ при работе с. иммобилизованным ферментом. Иммобилизованный фермент / 0,1 - 0,4 мл / вносили в кювету в виде суспензии сефарозы / соотношение сефарозы и буфера зависело от типа изучаемого препарата / . Реакцию начинали добавле нием 3-ФГА и проводили измерение образования Н/ЩН спектрофотометри-чески при длине волны 340 нм, 25С и постоянном перемешивании в течение 45 сек.
В обратной" реакции / восстановительное дефо. сформирование 1,3-дифосфоглицерата / активность иммобилизованной ГАФД измеряли в среде, содержащей 0,1 М Трис О4»1 мМ ЭДТА 0)І м КСІ» »3мМ НАДН, рН 7,0. Реакцию начинали добавлением 1,3-ДФГ и измеряли снижение концентрации ЩЩспектофотометрически при длине волны 340нм, 25С и постоянном перемешивании в течение 45 сек.
Активность фосфоглицераткиназы определяли в сопряженной системе в присутствии избытка ГАФД при 340 нм и 25С. Реакционная смесь, приготовленная на 0,1 М триэтаноламиновом буфере, рН 7,5, годержала НАДН - 0,24 мМ для растворимого и 0,6 мМ для иммобилизованного фермента, АТФ - соответственно 2,4 мМ и б мМ, UgSO - соответственно 8 мМ и ІбмМ, 3-ФГК - соответственно 8 мМ и 16 мМ, растворимую ГАФД - 0,46 мкМ и 0,92 мкМ.
Активность растворимой и иммобилизованной лактатдегидрогеназы определяли спектофотометрически по убыли НАДН при 340 нм и 25С в среде следующего состава: 0,1 М фосфат калия, рН 7,4, I мМ ЭДТА, НАДН - 0,8 мМ для растворимого и 2 мМ для иммобилизованного фермента, пируват - 0,8 мМ и 2 мМ соответственно. Реакцию начинали пируватом.
Проявление межсубъедини чной кооперативности ГАФД в катализе
Получение препарата изолированных мономеров ГАФД открыло возможность выяснить, что дает образование четвертичной структуры для функционирования фермента.
Как описано выше (стр. 72 ) нами было показано, что мономерная иммобилизованная форма дегидрогеназы в реакции окисления 3-фосфоглицеринового альдегида (3-ФГА) - прямой реакции (см.лит. обзор, стр.25 ) обладает такой же каталитической активностью, как форма тетрамерная. Интересно было выяснить, существуют ли условия, при которых тетрамеры и мономеры функционировали бы по-разному.
Мы решили изменить состав реакционной смеси, снизив концентрацию кофактора (НАД ") по сравнению с величиной, используемой в кинетических экспериментах, когда концентрация НАД4 намного больше концентрации активных центров фермента. Нашей целью было сравнить начальные скорости реакции, катализируемой мономерной и тетрамерной формами дегидрогеназы в условиях, когда концентрация кофермента приближалась бы к концентрации активных центров фермента (ситуация, вероятно, близкая к условиям ш ЖУ& так как концентрация ГАФД в цитоплазме превышает 10"% , а концентрация НАД " приблизительно равна 10"" М / 18 /.
С тем, чтобы проводить реакцию в стационарном режиме, было необходимо обеспечить регенерацию кофактора, первоначально добавленного в определенной (достаточно низкой) концентрации. Это достигалось следующим образом (см.рис.15).
Кроме иммобилизованного препарата ГАФД, в систему добавляли иммобилизованную на отдельном носителе лактатдегидрогеназу (ЛДГ)-степень активации составляла 50 мг ВгСУ на I мл геля; при этом практически все субъединицы фермента ковалентно связаны с носителем, что предотвращает диссоциацию ЛДГ и переход субъединиц в раствор. Система также содержала I мМ пируват, 50 мМ пирофосфат и 5мМ арсенат. Реакцию начинали одновременным добавлением 3-ФГА в конечной концентрации 1мМ и НАДН в конечных концентрациях 0,5-60 мкМ. ЛДГ регенерировала НАД+ из НАДН, тем самым обеспечивая препарат ГАФД стационарно низкими количествами кофактора. Инкубация велась при 25С и перемешивании. Реакция останавливалась через определенные интервалы времени путем отделения двух иммобилизованных ферментов от реакционной смеси на стеклянном фильтре. Скорость реакции определяли по убыли 3-ФГА в реакционной смеси, измеряя концентрацию 3-ФГА энзиматически.
Для сравнения использовали препараты иммобилизованных мономеров и тетрамеров ГАФД, взятых в таких количествах, чтобы концентрация активных центров была в обоих случаях одинаковой. Поэтому мы полагали, что в случае неодинаковой активности мономерной и олигомерной форм фермента обнаруженные отличия можно будет целиком отнести за счет взаимодействия активных центров в ходе катализа.
На рис. 16 представлена зависимость активности иммобилизованных мономеров и тетрамеров от концентрации кофактора (концентрация добавленного в систему НАДН). Как видно из рисунка, при самой высокой использованной нами концентрации НАДН мономер и тетрамер обнаруживают одинаковую активность. Аналогичные результаты мы получали и ранее, изучая активность иммобилизованных препаратов при насыщающих концентрациях НАД+ (см. табл.3).Вместе с тем, при самых низких концентрациях НАДН (менее 25 мкМ) мер оказывался существенно активнее мономера. Мы полагали, что это может быть обусловлено снижением сродства мономера к НАД4 к пробам 5 и 5 . и его неспособностью образовывать комплекс с коферментом. Дальнейшее повышение концентрации кофермента (до 25-60 мМ) привело к получению обратной зависимости - активность мономера оказалась заметно выше, чем активность тетрамерной формы дегидрогеназы.
Таким образом, был выявлен диапазон концентраций кофактора, в котором можно обнаружить влияние межсубъединичных взаимодействий на функционирование фермента-олигомера.
Полученные результаты показывают, что при низкой концентрации НАД4", недостаточной для насьщения активных центров ( К для НАД равна 5 ЮМ) существование контактов между субъединицами накладывает определенные ограничения на их работу.
Как уже указывалось, исследованиями, проведенными на ферментах из мышц осетра, установлено, что стадией, ограничивающей скорость реакции, служит диссоциация НАДН либо фосфоролиз ацилфер-мента. Фосфоролиз может осуществляться только после замены НАДН на НАД4" l26j. Следовательно скорость реакции должна зависеть от соотношения концентраций присутствующих в растворе окисленной и восстановленной форм кофермента. Мы полагали, что мономер и тет-рамер могут характеризоваться разным сродством к НАДН в тройных комплексах с ацилферментом (рис.13). Эти различия (возможно, менее прочное связывание НАДН мономером) не отражаются на активности в условиях большого избытка НАД4" в среде (3-5 мМ), но делаются заметными в присутствии его ненасыщающих концентраций.
Описанные выше отличия в каталитической активности мономерной и тетрамерной.форм ГАФД можно рассматривать как первое указание на взимодействие активных центров олигомера в прямой реакции, осуществляющейся в стационарном режиме. Кардон и Бойер / 21_7 недавно показали неэквивалентность активных центров ГАФД из мышц кролика в предстационарной фазе реакции, что также свидетельствует в пользу каталитической кооперативности субъединиц.
Значительно глубже разработан вопрос относительно взаимодействия активных центров при осуществлении обратной реакции -восстановительного дефосфорилирования 1,3-дифосфоглицерата (1,3-ДФГ). Как уже обсуждалось в обзоре литературы, ряд результатов, полученных при исследовании тетрамерного фермента в растворе, указывал на необходимость присутствия НАД в активном центре одной из субъединиц функционального димера для восстановительного дефосфо-рилирования 1,3-ДФГ в соседнем активном центре /"126 _7. Это "активирующее" влияние НАД " объясняли конформационным изменением, передающимся по внутридимерным контактам и необходимым для осуществления обратной реакции. Это позволяло ожидать, что размыкание этих контактов, сопровождающее получение изолированного мономера, приведет к потере им способности осуществлять обратную реакцию»
Результаты нашей работы показали, однако, что это не так, В первой серии экспериментов мы сравнили удельную активность мономера и тетрамера в реакционной среде, содержащей фиксированную концентрацию НАДІЇ и варьирующие концентрации 1,3-ДФГ. Как видно из рис 1 мономеры в обратной реакции катализируют восстановление 1,3-ДФГ с приблизительно в 2 раза большей эффективностью, чем тетрамеры: для мономеров %ущс =58,8 rJ , K/7? = = 1,01.10- для тетрамеров =37,6 f , К =1,14-10-
