Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Опиоидные пептиды: структура и функции 13
1.1 Строение и функции опиоидных пептидов 13
1.2 Метаболизм опиоидных пептидов 18
1.3 Опиоидные рецепторы 21
1.4 Опиоидные пептиды насекомых и их функции 28
1.5 Влияние опиоидных пептидов на поведение насекомых... 32
1.5.1 Воздействие опиоидных пептидов на пищевое поведение насекомых 33
1.5.2 Регуляция опиоидами локомоции насекомых 34
1.5.3 Влияние опиоидов на сложные формы поведения насекомых 36
1.6 Участие опиоидных пептидов в иммунных процессах... 37
1.7 Влияние опиоидных пептидов на ферментативную активность и геном 39
Глава 2 Объекты и методы исследования 45
2.1 Объекты исследования 45
2.2 Введение препарата мет-энкефалина 45
2.3 Исследование влияния пептидных гормонов на уровне транскрипции и трансляции 46
2.4 Исследование влияния пептидных гормонов на уровне рецепции 47
2.5 Приготовление экстрактов растворимых белков 47
2.6 Определение активности ферментов 48
2.6.1 Электрофоретические методы определения активности ферментов 48
2.7 Обработка полученных данных 51
2.7.1 Определение и расчёт относительной электрофоретической подвижности белковых фракций 51
2.7.2 Определение активности множественных форм ферментов, расчёт денситограмм 51
2.7.3 Статистическая обработка полученных данных 52
Глава 3 Исследование влияния мет-энкефалина на активность ферментов имаго американского таракана 53
3.1 Влияние мет-энкефалина на активность малатдегидрогеназы имаго американского таракана 53
3.2 Влияние мет-энкефалина на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы имаго американского таракана...
3.3 Влияние мет-энкефалина на активность сукцинатдегидрогеназы имаго американского таракана 62
3.4 Влияние мет-энкефалина на эстеразный комплекс ферментов имаго американского таракана
3.5 Влияние мет-энкефалина на фосфатазный комплексимаго американского таракана 74
3.5.1 Влияние мет-энкефалина на активность кислой фосфатазы имаго американского таракана 74
3.5.2 Влияние мет-энкефалина на активность щелочной фосфатазы имаго американского таракана 79
Глава 4 Исследование механизма действия мет-энкефалина 85
4.1. Исследование механизма действия мет-энкефалина по отношению к кислой фосфатазе жирового тела и грудных мышц самок и самцов имаго американского таракана с использованием ингибиторов транскрипции и трансляции
4 2 Исследование механизма действия мет-энкефалина по отношению к кислой фосфатазе жирового тела и грудных мышц самок и самцов имаго американского таракана с использованием налоксона 100
Глава 5 Исследование влияния мет-энкефалина на активность ферментов имаго колорадского жука 111
5.1 Иследование влияния мет-энкефалина на активность дегидрогеназного комплекса ферментов имаго колорадского жука 112
5.2 Влияние мет-энкефалина на активность эстеразного комплекса ферментов имаго колорадского жука 115
5.3 Влияние мет-энкефалина на фосфатазный комплекс имаго колорадского жука
5.3.1 Влияние мет-энкефалина на кислую фосфатазу имаго колорадского жука 119
5.3.2 Влияние мет-энкефалина на щелочную фосфатазу имаго колорадского жука 121
5.4 Сравнительная характеристика воздействия мет-энкефалина на активность ферментов имаго американского таракана и колорадского жука 124
5.4.1. Сравнительная характеристика воздействия мет-энкефалина на активность малатдегидрогеназы жирового тела и грудных мышц имаго американского таракана и общего
гомогената имаго колорадского жука 125
5.4.2. Сравнительная характеристика воздействия мет-энкефалина на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы жирового тела и грудных мышц имаго американского таракана и общего гомогената имаго колорадского жука 126
5.4.3. Сравнительная характеристика воздействия мет-энкефалина на активность сукцинатдегидрогеназы жирового тела и грудных мышц имаго американского таракана и общего гомогената имаго колорадского жука 128
5.4.4. Сравнительный анализ влияния мет-энкефалина на активность эстеразного комплекса жирового тела и грудных мышц имаго американского таракана и общего гомогената имаго колорадского жука 129
5.4.5. Сравнительный анализ влияния мет-энкефалина на активность кислой фосфатазы жирового тела и грудных мышц имаго американского таракана и общего гомогената имаго колорадского жука 131
5.4.6. Сравнительный анализ влияния мет-энкефалина на активность щелочной фосфатазы жирового тела и грудных мышц имаго американского таракана и общего гомогената имаго
колорадского жука 133
Заключение 135
Выводы 143
Литература 145
- Опиоидные пептиды насекомых и их функции
- Влияние мет-энкефалина на активность сукцинатдегидрогеназы имаго американского таракана
- Исследование механизма действия мет-энкефалина по отношению к кислой фосфатазе жирового тела и грудных мышц самок и самцов имаго американского таракана с использованием налоксона
- Влияние мет-энкефалина на кислую фосфатазу имаго колорадского жука
Введение к работе
Актуальность темы.
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что опиоидные пептиды насекомых являются объектом пристального внимания исследователей. Современный этап изучения механизма действия биологически активных веществ в первую очередь связан с поиском альтернативных моделей, ограничивающих использования теплокровных животных. Несмотря на отсутствие убедительных доказательств существования болевых рецепторов у насекомых, представители этого класса широко используются в качестве модельных тест-объектов для различных
f5 исследований в области нейроэндокринологии, биомедицины и биохимии
(Грицай и др., 1998).
Группа опиоидных пептидов является одной из многочисленных, многообразных и полифункциональных среди семейств нейропептидов (Ашмарин, 1996; Замятнин, 1997, 2004; Гомазков, 1997). Установлено, что именно опиоиды обнаружены у представителей практически всех крупных таксономических групп беспозвоночных, а опиатные рецепторы найдены даже
<,у> у одноклеточных животных. Очевидно, что опиоидная система является одной
из наиболее эволюционно древних сигнальных систем (Дьяконова, 2001). У насекомых с помощью иммуногистохимических и радиоиммуных методов обнаружено большое число соединений, сходных по своему строению с энкефалинами других животных, в частности млекопитающих, что свидетельствует о консерватизме опиоидов как регуляторных соединений, о сохранении их в процессе эволюции, а, следовательно, значимости для живого организма.
*6 Энкефалиновые пептиды у насекомых обладают чрезвычайно
широким спектром регуляторной активности, связанной с функционированием опорно-двигательной, нервной, эндокринной,
кровеносной, дыхательной, пищеварительной, выделительной, половой и иммунной систем организма (Триселева, 1998; Ашмарин, 2001; Дьяконова, 2001; Хавинсон и др., 2002; Nagabhushanam, 1995; Nassel, 1997.). Отмечено участие опиоидов в высвобождении нейрогормонов и нейромодуляторов, таких как проктолин, адипокинетические гормоны, ацетилхолин, октопамины и др. В то же время регуляторное участие опиоидов осуществляется, как правило, совместно с другими пептидами и низкомолекулярными субстанциями (Nassel, 1995, 1997). Наличие у млекопитающих системы регуляторных пептидов, так называемого гормонального континуума (Ашмарин, Обухова, 1986) позволяет допустить, что подобный уникальный комплекс присущ и насекомым.
Известно, что эффективность гормональной регуляции клеточного метаболизма определяется не только количеством гормона, но и уровнем в ней активных рецепторов. Доказано, что опиоидные рецепторы являются гетерогенной популяцией. На основании изучения связывания различных лигандов описано пять типов опиоидных рецепторов 5, ц, к, а и є (Шимановский, Гуревич, 2000). Однако, другие авторы считают, что существуют шесть типов опиоидных рецепторов - 8, ц, к, є, С, и X, а а-рецепторы не являются опиоидными, так как они не чувствительны к налоксону (Наволоцкая и др., 2002). Кроме того имеются сведения о существовании неопиоидного рецептора р-эндорфина, широко распространенного в организме млекопитающих (Наволоцкая и др., 2004) Существование опиоидных рецепторов в тканях насекомых также является установленным фактом (Stefano et al, 1989; Грицай и др., 2000,2001).
Установлено, что опиоидные пептиды вовлечены в регуляцию многих метаболических процессов и их энергообеспечение. Доказано участие опиоидов в контроле белкового, углеводного, липидного и нуклеинового обменов (Маслова и др., 1991; Лишманова и др., 1992; Реброва и др., 2001).
Кроме этого опиоиды принимают участие в регуляции интенсивности
биосинтеза и выделения различных биологически активных веществ (инсулин, окситоцин, вазопрессин, соматотропин, пролактин, простагландини, адренокортикотропный гормон и биологические амины).
Опиоидные пептиды воздействуют на различные виды обмена веществ позвоночных животных, изменяя активность разнообразных ферментных систем (Микодина, 1999; Филиппович, 1999; Сергутина, 2000; Реброва и др., 2001; Горелова и др., 2002; Самсонова, 2002; Зайцева, 2002). У насекомых исследовано влияние опиоидных пептидов и их аналогов на некоторые дегидрогеназы, фосфоглюкомутазу, кислую фосфатазу, эстеразы, монофенол-монооксигеназу и ДНК-полимеразу (Коничев и др., 1996; Минькова, 1999; Семина, 2000; Самсонова, Филиппович, 2000; Грутенко и др., 2001; Балакина, 2002; Park, Keelej, 1998; Vi et al., 1999).
Анализ воздействия опиоидных пептидов на активность дегидрогеназ жирового тела и грудных мышц мучного хрущака Tenebrio molitor и американского таракана Periplaneta americana показал, что энкефалины принимают участие в энергетическом обмене, регулируя активность соответствующих ферментов (Семина, 2000). Причем их воздействие характеризуется видовой и тканевой специфичностью. Рядом исследователей установлено стимулирующее воздействие энкефалинов на деятельность кислофосфатазного комплекса ферментов (Семина и др., 2001). Эти данные представляют большой интерес в свете предположений, что некоторые опиоиды обладают активностью кислой фосфатазы (Ашмарин, Каразеева, 1996).
Изучение механизма гормональной регуляции активности комплекса кислых фосфатаз у имаго американского таракана с применением актиномицина D и пуромицина показало, что воздействие энкефалинов затрагивает транскрипционные и трансляционные процессы (Semina et al., 1998).
Работ по сравнительному исследованию влияния опиоидов и их антагониста — налоксона на ферментативную активность насекомых в доступной литературе нами не обнаружено.
Цель и задачи исследования.
Основная цель исследования состояла в сравнительном изучении влияния мет-энкефалина на активность дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов имаго американского таракана и колорадского жука. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Провести детальное изучение влияния мет-энкефалина на активность эстераз, кислой и щелочной фосфатаз и дегидрогеназного комплекса ферментов имаго американского таракана спустя 1 час после инъекции опиоида.
Осуществить сравнительное исследование воздействия экзогенного мет-энкефалина на активность тест-ферментов самок и самцов американского таракана в жировом теле, грудных мышцах и общем гомогенате.
Исследовать механизм гормональной регуляции активности перечисленных ферментативных систем с использованием ингибиторов транскрипции и трансляции (актиномицин D и пуромицин), а также антагониста опиоидов - налоксона.
Сопоставить проявление биохимического эффекта мет-энкефалина по отношению к дегидрогеназному, эстеразному и фосфатазному комплексу ферментов американского таракана и колорадского жука.
Научная новизна работы.
Впервые проведено сравнительное изучение влияния мет-энкефалина на активность эстераз, кислой и щелочной фосфатаз и дегидрогеназного
комплекса ферментов имаго американского таракана и имаго колорадского
жука. Впервые исследован механизм действия опиоидного гормона мет-энкефалина на активность эстераз, кислых и щелочных фосфатаз и дегидрогеназного комплекса с использованием ингибиторов транскрипции и трансляции, а также антагониста опиоидов - налоксона.
Практическое значение работы.
Проведено исследование механизма гормональной регуляции активности дегидрогеназного, фосфатазного и эстеразного комплекса ферментов с целью разработки современных гормональных методов борьбы с насекомыми-вредителями, а также возможности использования нейрогормонов и медиаторов передачи нервного возбуждения, а также нейроактивных соединений, контролирующих их баланс, в качестве потенциальных инсектицидов четвертого поколения. Полученные данные вносят значительный вклад в развитие представлений о связи между гормональным сигналом и изменением активности мнжественных форм определенных ферментов в процессе экспрессии генома насекомых. Результаты исследований включены в лекционные курсы кафедры органической и биологической химии, а также семинарских занятий, спецкурсов и факультативов для студентов биолого-химического факультета Ml 11 У. Кроме того, результаты диссертационной работы использованы при подготовке 2 научно-методических статей по основам психоэндокринологии и воздействию психотропных веществ на организм человека.
Апробация работы.
Материалы диссертации в виде докладов и тезисов были представлены на заседаниях семинара «Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии» кафедры органической и биологической химии Ml И У (Москва, 2002-2005), научных сессиях биолого-химического факультета Ml И У (Москва). На межвузовской научно-практической
-И-
конференции «Актуальные проблемы экологии и безопасности жизнедеятельности» (Москва, апрель 2003), на VII Европейском Конгрессе Энтомологии (Салоники, Греция, 2002).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ и 2 работы находятся в печати.
Структура и объём работы:
Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Глава 1),освещающего современные данные о структуре и функциях опиоидных пептидов; описания объектов и методов исследования (Глава 2); изложения и обсуждения полученных экспериментальных данных (Главы 3-4); заключения; выводов; списка литературы и приложения. Работа изложена на 163 страницах компьютерного текста и включает таблицы, рисунки и схемы.
Опиоидные пептиды насекомых и их функции
Тем не менее, использование лигандов, обладающих стереоспецифическим сродством к разным типам опиоидных рецепторов млекопитающих, показало, что, они также активно связываются с различными тканями насекомых. Отсутствуют существенные генетические данные по этой тематике. В настоящее время не известно как сигнальные системы возникают физиологически, возможно сами опиоиды вызывают образование собственных рецепторов из мембранных белков (Harrison et al., 1994). Необходимо отметить, что существование опиоидных рецепторов в тканях насекомых является давно установленным фактом. Так, высокоаффинные места связывания мет-энкефалинподобных пептидов, были обнаружены в церебральном ганглии Locusta migratoria и в церебральном ганглии и средней кишке Leucophae maderae. Что касается рецепторов, выявленных в районе средней кишки, скорее всего, они расположены в пределах нервной системы. Т.о. энкефалины обеспечивают синаптические взаимодействия и моделируют активность непептидергических и/или пептидергических компонентов регуляции функционирования системы пищеварения (Stefano et al.., 1989 а). Высокое сродство к к -подобным рецепторам было установлено в л церебральном ганглии таракана L. maderae (Ford et al., 1986). Доказано наличие опиоидных рецепторов у Scotia segetum (Karabensch et al., 1985), Periplaneta americana (Weiss, Penzlin, 1987; Грицай и др., 1998,2000,2001). Следует отметить, что экстракты голов дрозофилы специфически связывают [Н лей-энкефалин и опиоидный лиганд [Ґ]-дипренорфин (Edley et al., 1982). Кроме того, в тканях сердечной мышцы Drosophola melanogaster опиоидные лиганды обнаружили специфическое связывание, характерное для мю - и к -рецепторов (Santoro et al., 1990). Также известно, что рецепторы FMRF-амидов находятся на задней поверхности сердца D. melanogaster, именно поэтому пептиды, инъецированные в передний отдел насекомого (Nichols et al., 1999), в отличие от пептидов, инъецированных в задний отдел (Johnson et al., 2000), не оказывают влияния на сердечный ритм. Это происходит из-за деградации FMRF-амида пептидазами на пути его следования к рецепторам. Взаимодействие FMRF-амид родственных пептидов с рецепторами обусловлено общей для них С - концевой Apr-Фен последовательностью, которая может быть специфична для определенного типа или подтипа рецепторов, которые запускают общий механизм. При этом С - концевой фенилаланин наиболее важен для реализации подобных эффектов (Merte, Nichols, 2002). Интересен тот факт, что так же фенилаланин ответственен за реализацию биологического эффекта энкефалинов рыб (Микодина, 1999). Т.о. хотя физиологические проявления активностей пептидов этого семейства эволюционно разошлись, лежащие в его основе сигнальные механизмы большей частью сохранились. N-концевая последовательность FMRF-амид родственных пептидов существенно отличается по структуре и длине, т.о. передается информация о специфике сигнала (Merte, Nichols, 2002). Например, N-концевая последовательность Тре-Про-Ала-Глу-Асп-FMRF проявляет более высокое сродство к одному или более рецепторам на нервно-мышечном синапсе личинок D. melanogaster (Hewes et al., 1988). Многочисленные исследования доказывают фармакологическое сходство опиоидных рецепторов насекомых и млекопитающих. Часто исследуются эффекты антагонистов опиоидных рецепторов (Zabala, Gomez, 1991). Особый интерес представляет ситуация совместного введения опиоидных агонистов и антагонистов. Возникающие при этом конкурентные взаимоотношения позволяют выявить неоднородность популяции опиоидных рецепторов, обслуживающих ту или иную физиологическую функцию (Zabala et al., 1984; Kavaliers et al., 1987). Потенциация эффектов опиоидного пептида низкой дозой налоксона позволяет предположить существование в рамках опиоидной системы американского таракана нескольких типов соответствующих рецепторов. Результаты серии опытов по совместной инъекции американскому таракану Periplaneta americana налоксона и бета-казоморфина-7 позволили заключить, что в рассматриваемом случае налоксон, по-видимому, инактивирует места специфического связывания бета-казоморфина-7 (мю-, дельта- и каппа-рецепторы), располагаясь преимущественно на мю -рецепторах, поэтому пептид вытесняется с них на другие места связывания (например, на к -рецепторы), через которые бета-казоморфин-7 и оказывает слабое ингибирующее влияние на защитные реакции (Грицай и др., 2001). Значимость рецепторов к -типа для развития защитных реакций показана и в литературе при работах с их специфическими лигандами (Ford et al., 1986). На основании полученных данных авторы предположили наличие в нервной системе таракана P. americana мест связывания, родственных опиоидным мю-, дельта- и каппа -рецепторам млекопитающих (Грицай и др., 2000; 2001). Из выше изложенного материала видно, что только в отношении американского таракана выдвинуто предположение о наличие в нервной системе опиоидных рецепторов трех типов (см. табл. № 1). В тканях представителей класса насекомых присутствует много разнообразных пептидов различного метаболического назначения и физиологического действия. Среди них, в частности, да- и трипептиды, выполняющие уникальную функцию хранения незаменимых аминокислот; пептиды средней молекулярной массы, обладающие сильным и ярко выраженным физиологическим действием, такие как миотропные, кардиоактивные, диуретические. Необходимо особо отметить, что в настоящее время мы располагаем сведениями лишь о незначительной части пептидов насекомых. Каждый год у этого класса животных выявляются ранее не известные неиропептиды, причем во многих случаях возникают трудности при отнесении их к тому или иному семейству. Так, баратин (Асп-Асн-Сер-Глн-Три-Гли-Гли-Ала) может оказаться первым членом нового пептидного семейства насекомых. Этот неамидированный нонапептид широко распространен в мозге и нервной цепочке таракана Laucophaea maderae, в мозге и ганглиях американского таракана, и саранчи Locusta migrattona.
Влияние мет-энкефалина на активность сукцинатдегидрогеназы имаго американского таракана
Полифункциональный эстеразный комплекс ферментов обеспечивает широчайший спектр разнообразных реакций на клеточном и организменном уровнях. Тем не менее, эстеразы насекомых чаще всего исследуют применительно к механизму формирования резистентности (Хрунин, 2000; Романова, 2004; Harold, Ottea, 2000; Riley et ai., 2000; Small, Hemingway, 2000; Valles et al, 2001). При этом изменения активности этих ферментов под воздействием различных гормонов остаются практически не изученными (Коничев и др., 1996; Минькова, 1999; Семина, 2000; Самсонова, Филиппович, 2000; Грунтенко и др., 2001; Балакина, 2002; Park, Keeley, 1998; Vie et al., 1999).
Сравнительное изучение влияния мет-энкефалина и дофамина на активность эстеразного комплекса ферментов нервной цепочки, жирового тела и грудных мышц самок и самцов американского таракана показало, что эффективность влияния мет-энкефалина на суммарную активность эстераз тканей таракана зависит от пола животного. Установлено, что в большинстве случаев опиоид сильнее ингибирует комплекс ферментов самцов насекомого, по сравнению с самками (Балакина, 2002).
Однако данная закономерность проявляется на всем протяжении тестируемого времени после инъекции только в нервной цепочке.
Стабильно более высокая эффективность опиоида по отношению к эстеразам именно нервной цепочки самок имаго американского таракана согласуется с имеющимися данными о том, что именно в нервной системе самок сверчка Gryilus bimaculatus активированы опиоидные механизмы, которые принимают участие в подавлении их агрессии (Dyakonova et al., 2000). Автор предполагает, что экзогенный мет-энкефалин, конкурируя с эндогенными опиатами за рецепторы нервной системы самок таракана, частично утрачивает эффективность.
Анализируя данные Грицай и др. (2001) в нервной системе Periplaneta americana локализованы ц- и 5-опиоидные рецепторы, агонистом которых является мет-энкефалин (Шимановский, Гуревич, 2000). Следовательно, воздействие пептида на эстеразную активность может осуществляться благодаря связыванию с соответствующими рецепторами.
Поскольку в нервной системе самок и самцов тараканов Leucophaea maderae обнаружено разное количество опиоидных рецепторов (Stefano et al., 1989 а), то можно предположить, что таким образом формируется половая специфичность действия мет-энкефалина на эстеразы тканей имаго американского таракана.
Показано, что эстеразная активность существенно зависит от гормонального статуса насекомых, на нее влияют ЮГ и экдистероиды (Кутузовой и др., 1985; Шамшина, 1986; Lenoir-Rousseaux et al., 1994), Поэтому нельзя исключить, что мет-энкефалин действует на активность этого ферментного комплекса, благодаря регуляции титра выше упомянутых гормонов. Половая специфичность подобного влияния, возможно, обеспечивается по аналогии с влиянием опиоидов на секрецию вазопрессина у млекопитающих. Обнаружено, что эффективность воздействия опиатных агонистов на диурез отличается у самцов и самок крыс из-за полового диморфизма влияния опиатов на секрецию этого гормона (Vaccarino, Kastin, 2001). Полученные данные о половой специфичности влияния опиоидного пептида и дофамина на активность эстеразного комплекса ферментов имаго американского таракана в определенной степени подтвердили гипотезу о том, что изучаемые соединения, а также ювенильные и стероидные гормоны являются участниками единого континуума, регулирующего функционирование эстераз у насекомых (Балакина, 2002).
Кроме того обнаружено, что мет-энкефалин с разной эффективностью изменяет активность эстеразного комплекса ферментов нервной цепочки, жирового тела и грудных мышц имаго американского таракана. Оказалось, что опиоидные пептиды наиболее эффективно влияют на ферменты нервной системы, играя значительную роль в регуляции ее функций.
Мы поставили себе целью подробно изучить, каким образом мет-энкефалин изменяет активность эстераз жирового тела и грудных мышц имаго американского таракана через 1 час после инъекции соответствующего препарата. В результате проведенных исследований показано, что мет-энкефалин снижает суммарную активность эстераз жирового тела и грудных мышц имаго американского таракана (рис 3.9).
Исследование механизма действия мет-энкефалина по отношению к кислой фосфатазе жирового тела и грудных мышц самок и самцов имаго американского таракана с использованием налоксона
Физиологические эффекты опиоидных пептидов, их агонистов и антагонистов характеризуются сложной зависимостью от количества вводимого препарата. Следует отметить, что зависимость характера действия налоксона на защитную реакцию таракана от дозы достаточно хорошо совпадает со сведениями, полученными на позвоночных (Яснецов, 1991). В дозах 1-5 мкг/г налоксон, не вызывая собственных физиологических эффектов у американского таракана, ведет себя как антагонист опиоидных рецепторов. Свойства агониста проявляет с дозы 10 мкг/г, действуя в одном направлении с опиоидами. Причем длительность эффектов составляла 45-75 минут для доз до 20 мкг/г, 2 часа - для доз до 100 мкг/г (Грицай и др., 2001).
Полученные на других энтомологических объектах результаты в зависимости от вида насекомого и метода, исследования сильно варьируют. Так, налоксон в высоких дозах тормозил, подобно морфину, возникновение защитного поведения на повышенную температуру (Zabala et al., 1991) и богомола на электростимуляцию (Zabala et al., 1984) (128 мкг/г и 64 мкг/г, соответственно). Эффекты характеризовались большей длительностью - 4 часа. В более низких дозах (64 мкг/г и 48 мкг/г, соответственно) налоксон выступал как опиоидный антагонист и, не вызывая собственных физиологических эффектов, блокировал действие морфина. Этот эффект сохранялся и при меньших дозах налоксона - 32 и 16 мкг/г; его длительность составляла не менее 3 часов. Препарат в дозе 54 мкг/г изменял порог чувствительности обезглавленного таракана к удару электрического тока при соприкосновении его конечности с раствором электролита (Weiss, Penzlin 1987). Доза налоксона 1,1 мкг/г блокировала действие морфина на защитную реакцию пчелы - выбрасывание жала в ответ на электростимуляцию; доза 4,5 мкг/г ингибировала ее полностью (Nunez et al., 1983).
Р-казоморфин-7 является одним из природных опиоидных пептидов. Будучи весьма близок по структуре к энкефалинам, он отличается большей длиной молекулы и большей устойчивостью к действию протеолитических ферментов. Последнее свойство связано с наличием в его структуре трех остатков пролина. 3-казоморфин-7 имеет высокое сродство к рецепторам \х -типа и несколько меньшее - к другим типам опиоидных рецепторов. Эффективность Р-казоморфина-7 в опытах на позвоночных заметно выше, чем в тестах на американском таракане. К снижению болевой чувствительности у крыс приводило использование дозы пептида 10-20 мкг/г (Дубынин и др., 1992; Маклакова и др., 1993). В исследовании, проведенном на американском таракане, доза пептида 50 мкг/г вызывала лишь слабые кратковременные эффекты (Грицай и др, 2001).
Кроме того, выявлено, что лей-энкефалин и даларгин вызывают изменение содержания нуклеиновых кислот у личинок восковой моли Galieria mellonella и мучного хрущака Tenebrio molitor, причем проявляют наибольшую активность при введении 10" - 10 ,и моль на особь. Причем введение лей-энкефалина и даларгина приводило к изменениям интенсивности синтеза ДНК через сутки, РНК и белков - через двое и трое суток (Минькова, 1999). Для FMRF-амидов также характерны ничтожно малые пороговые концентрации. Эти пептиды существенно повышают число мышечных сокращений D. melanogaster даже в концентрации 10"й - 10"у М (Hewes et al., 1988).
Для большинства описанных ситуаций характерен колоколообразный тип кривых доза-эффект, когда влияние пептида не проявлялось в средних или больших концентрациях, но было достоверно выражена в ничтожно малых дозах. Также следует отметить такую важную особенность опиоидных пептидов, как их длительное последействие. Необходимо обратить внимание на то, что эффект однократно введенного вещества может проявиться характерным образом через несколько дней и сохраняться затем неделями (Ашмарин, Каменская, 1988).
Если учесть, что время «жизни» большинства пептидов в организме исчисляется от десятков секунд до нескольких минут, долговременность физиологических реакций не укладывается в рамки традиционных объяснений.
Согласно гипотезе, совместно с другими веществами-регуляторами пептиды образуют функциональную непрерывность, континуум, обеспечивающий реализацию процессов различного уровня и сложности. Феномен длительного последействия однократно введенной пептидной субстанции требует допущения, что в организме предсуществуют неактивные до поры системы в форме иерархически выстроенного континуума пептидных регуляторов. Биологический смысл существования длительных регуляторных процессов, складывающихся из кратковременных звеньев, очевиден. В отличие от систем, основанных на долгоживущих регуляторах, такая система является более гибкой в меняющейся ситуации, при поступлении новых сигналов (Ашмарин, Стукалов, 1996).
Влияние мет-энкефалина на кислую фосфатазу имаго колорадского жука
Настоящая работа посвящена сравнительному исследованию воздействия мет-энкефалина на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, эстеразного и фосфатазного комплексов ферментов тканей имаго американского таракана и общего гомогената имаго колорадского жука.
Опиоидные пептиды - полифункциональные соединения. Спектр их воздействия чрезвычайно широк. Литературные данные свидетельствуют о том, что функции энкефапинов в организме человека и животных крайне разнообразны. Это и иммунные ответы организма, и многообразные поведенческие реакции, и различные типы обмена (углеводный, белковый, липидный, водно-солевой), и влияние на гуморальную и нервную системы организма. У насекомых энкефалиновые пептиды оказались причастными к контролю терморегуляции, двигательной активности, поведенческим реакциям. Важное направление работ связано с участием энкефапинов в регуляции иммунной активности насекомых.
Молекулы тептодов характеризуются полифункциональностью, поскольку одна молекулярная структура, как правило, обладает целым набором типов различных активностей. Способность одного олигопептида влиять на функционирование важнейших регуляторных систем организма: нервной, эндокринной и иммунной, привело к употреблению кроме термина "физиологически активный пептид" или "нейропептид" и таких, как "пептидный гормон" и "пептидный иммуномодулятор". Кроме того, развитие представлений об интеграции физиологических функций вызвало появление термина "интегративные пептиды".
Большинство известных физиологически активных пептидов наряду с млекопитающими присутствуют также у земноводных, моллюсков, рыб, насекомых и выполняют те же физиологические функции. Поэтому есть основания считать, что олигопептиды как позвоночных, так и беспозвоночных принимают участие в функционировании трех важнейших регуляторных систем организма: нервной, эндокринной и иммунной. Кроме того, сопряженность разнообразных функций, по-видимому, лежит в основе процессов, ответственных за морфогенез.
Рассмотрение системы различных регуляторных процессов, осуществляемых при участии физиологически активных пептидов, учет их специфичности и полифункциональности привел к возникновению гипотезы о существовании непрерывной совокупности, или континуума, регуляторных пептидов. В соответствии с ней при определенной группировке многочисленные регуляторные пептиды образуют более или менее постепенные переходы спектров биологической активности, обеспечивающие любые допустимые комбинации влияния на функции организма.
Более 30 лет назад в мозге были открыты вещества, влияющие на центральные функции высших организмов. Они были названы энкефалинами и эндорфинами и дали начало изучению большой и значимой группы опиоидов, список которых непрестанно пополняется. Исходя из рассмотренных особенностей, можно сделать вывод о взаимосвязи структуры опиоидных пептидов и их функции. И действительно, два физико-химических параметра могут определять спектр заданной функциональной активности природных олигопептидов. Комбинации положительно заряженных и определенных циклических радикалов участвуют в реализации функциональной активности опиоидных пептидов, а уникальное распределение этих радикалов вдоль линейной структуры или в пространственной конфигурации молекулы определяют специфичность действия, то есть величину активности. Наличие указанных радикалов и лежит в основе полифункциональности, а именно способности связываться с различными рецепторами. Сам рецептор представляет собой входные ворота, через которые информационный сигнал превращается в физиологический акт. -136 Поэтому обнаружение специфичных рецепторов означает возможность фармакологического воздействия на физиологическую функцию с помощью веществ, имитирующих структуру пептида, которые будут действовать как антагонисты рецепторов или агонисты-усилители физиологического эффекта. Большинство опиоидов обладает более или менее выраженным обезболивающим действием, реализуемым через рецепторы. Однако не менее важным представляется их влияние на функциональную активность мозга: снижение или усиление эмоционального поведения, индукция "чувства удовлетворения", то есть функция внутренних факторов подкрепления. Некоторые опиоидные пептиды, в частности энкефалины, являются мощными активаторами разновидности lSIK-лимфоцитов, убивающих раковые клетки. Поскольку в литературе имеются сведения, что рецепторы опиоидных гормонов и сами гормоны обнаружены в ядерном матриксе, в кариоплазме, то не исключено прямое воздействие энкефалинов на процессе транскрипции и последующей трансляции белков, в том числе и рецепторов. У насекомых энкефалиновые пептиды оказались причастными к контролю терморегуляции, двигательной активности, поведенческим реакциям. Важное направление работ связано с участием энкефалинов в регуляции иммунной активности насекомых. Отмечено значение опиоидных пептидов в высвобождении нейрогормонов и нейротрансмиттеров, в то время как регуляторное участие опиоидов в многообразных физиологических процессах осуществляется, как правило, совместно с другими пептидами и низкомолекулярными субстанциями. Выявлен перечень определенных гормон-зависимых ферментов как у млекопитающих, так и у насекомых. Это дает основание предположить наличие у насекомых континуума регуляторных пептидов. Установлено, что биохимический эффект исследованного опиоидного пептида характеризуется тканевой и видовой специфичностью и сопровождается гормональной индукцией активности кислой и щелочной фосфатаз. Выявлено, что отдельные молекулярные формы КФ синтезируются de novo. При изучении воздействия мет-энкефалина на малатдегидрогеназы американского таракана было установлено, что биохимический эффект мет-энкефалина характеризуется тканевой специфичностью, что свидетельствует об особенностях метаболических процессов, протекающих у американского таракана в тестируемых тканях — жировом теле и грудных мышцах. Не вызывает сомнения тот факт, что данный опиоидный пептид принимает участие в энергетическом обмене исследованного насекомого посредством регуляции углеводного обмена цикла ди- и трикарбоновых кислот. Вопрос о характере поведения МДГ в митохондриях насекомых очень важен, так как с "" помощью этого фермента осуществляется процесс тканевого дыхания, сопряженный с окислительным фосфорилированием, в результате чего запасается значительная часть энергии в форме АТФ, которой принадлежит ведущая роль в регуляции клеточного метаболизма. Проведенное исследование влияния мет-энкефалина на активность молекулярных форм глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы жирового тела и грудных мышц имаго американского таракана позволяет сделать вывод о том, что, во-первых, действие опиоида тканеспецифично. Так, ингибирующее влияние мет-энкефалина оказалось более значительно в жировом теле и менее - в грудных мышцах таракана. Во-вторых, отмечено селективное воздействие опиоида на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ обеих тестируемых тканей имаго P. americana. Не было выявлено закономерности в действии гормона на индивидуальные формы ферментов обеих тканей. Ингибируются как мало, средне, так и высокоподвижные формы Г-6-ФДГ. Также неспецифично происходит активация форм фермента.
