Введение к работе
Актуальность темы.
Актуальной задачей современной физиологии и фундаментальной медицины является выяснение участия митохондрий (MX) в определении физиологического состояния организма, выявлении различий между нормой и патологией по реакциям MX. Сложились такие пограничные между биохимией, физиологией и медициной области знания как Митохондриальная физиология, Митохондриальные болезни, Митохондриальная медицина. Они базируются на понимании того, что нарушения митохондриальных процессов лежат в основе развития патологических изменений в организме. Однако это установлено в исследованиях сильно выраженных патологий, в том числе, обусловленных генетическими нарушениями. В настоящее время наиболее актуальной задачей является выявление ранних дисфункций MX, предшествующих клиническим проявлениям болезни и гораздо легче поддающихся нормализации или позволяющих вовремя устранить причину болезни. Они плохо обнаруживаются в принятых условиях исследования изолированных митохондрий. Тем более использование для этой цели биоптатов тканей от больных не оправдано для широких исследований и ввиду травматичное для человека, и ввиду грубого повреждения митохондрий, маскирующего функциональные изменения, что и было предметом нашего исследования.
Связь структурных изменений и функции макромолекул на микроскопическом уровне была ведущей идеей в исследованиях основателя Института Биологической Физики, Г.М. Франка. Еще в 60-е г. работами А.Л. Шабадаша, проводившимися в Московском Институте Биофизики, родоначальнике Института Биофизики в Пущино, было показано, что структура митохондрий претерпевает цикл изменений в клетке «отдельные бусинки - цепь бусинок - плотный точечный шар» при различных функциональных состояниях клетки (Шабадаш, 1968). В настоящее время установлено, что MX в клетках объединены в динамичную сеть с участием эндоплазматического ретикулума - митохондриально-ретикулярную сеть (МРС); структурные изменения МРС связаны с физиологическими условиями и метаболическим состоянием MX (Bereiter-Hahn and Voth, 1994; van der Bliek, 2009). Достигнуты большие успехи в выяснении механизмов организации этой сети, осуществляющейся двумя противоположными процессами - деления и слияния MX (Hoppins et al., 2007; Palmer et al., 2011).Процессы слияния и деления MX включены в разные виды жизнедеятельности клетки: эмбриональное развитие, дыхание, кальциевая сигнализация, активность нейронов, апоптоз и др. (Chan, 2006; Suen et al.,
2008). Таким образом, взаимосвязь структурной организации и функции МРС становится очевидной.
Биофизический подход помог нам увидеть недостаток принятых биохимических методов изучения выделенных MX, состоящий в разрушении МРС и поставить задачу максимально возможного сохранения ее в исследованиях ex vivo для более полного наблюдения физиологической регуляции, осуществляющейся в организме. Это было осуществлено на основании сочетания традиционного цитохимического метода изучении MX в лимфоцитах на мазке крови с современными и улучшенными разработками состава сред в биохимических исследованиях. Разработанный метод был назван цитобиохимическим (ЦБХ).
Фундаментальным открытием в области физиологической регуляции было выявление связи системы висцеральной регуляции, состоящей из двух реципрокных частей - адренергическои и холинергическои, с митохондриальными процессами через окисление только двух субстратов: янтарной кислоты (ЯНТ) и а-кетоглутарата (КГЛ) и их дегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназу (СДГ) и а-кетоглутаратдегидрогеназу (КДГ) (Бабский и др., 2001; Кондрашова и др., 2003). Согласно этим представлениям окисление ЯНТ осуществляет энергообеспечение при активности тканей, а окисление КГЛ - в состоянии восстановления после деятельности. Эти представления были обоснованы исследованиями на организме (Maevsky et al., 1982; Кондрашова и Бабский, 1986) а также опытами на выделенных MX (Кондрашова и Долиба, 1989; Долиба и др., 2001; Шостаковская и др., 1986).Опыты на организме показали, что субстраты обладают сильным регуляторным действием в организме, причем в концентрациях много меньше тех, которые необходимы для обеспечения митохондрий субстратом (Maevsky et al., 1982; Маевский и др., 2001; Бабский и др., 2001; Кондрашова, 2002). Это привело к предположению, что механизм физиологической активности ЯНТ и КГЛ является сигнальным. Такое представление было поддержано независимым открытием специфических рецепторов именно только для этих двух субстратов (Не et al., 2004).
Цели и задачи диссертационной работы.
Целью работы была разработка методов исследования MX, сохраняющих организацию MX, через которую осуществляется физиологическая регуляция, удовлетворяющих запросы диагностики. Использование разработанных методов для исследования различных физиологических состояний организма, выявляющего баланс симпатической и парасимпатической регуляции в организме.
Задачи исследования: 1. Исследование возможности сохранения нативной МРС в гомогенате печени крысы при биохимических исследованиях.
-
Изучить влияние компонентов среды и условий выделения на организацию MX в гомогенате печени крысы;
-
Изучить влияние веществ, используемых в полярографических исследованиях на организацию MX в гомогенате печени крысы;
2. Исследовать изменения МРС и дыхания MX при изменениях
физиологического состояния, вызванного ИС различной продолжительности;
3. Исследование возможности сохранения нативной МРС в лимфоцитах,
иммобилизованных на стекле при их исследовании цитобиохимическим методом;
-
Определить сохранность МРС в лимфоцитах на мазке крови;
-
Оптимизировать состав среды инкубации для сохранения состояния покоя MX в лимфоцитах на мазке крови при измерении их активности;
4. Определить чувствительность цитобиохимического метода к изменениям
физиологического состояния организма на моделях стресса различной интенсивности;
-
Исследовать ответы СДГ и КДГ при повышении адренергической регуляции в организме в ответ на тяжелые формы стресса;
-
Для выявления возможностей ранней (доклинической) диагностики патологических состояний исследовать чувствительность разработанного метода на мягких моделях стресса;
-
Исследовать изменения активности СДГ в ответ на введение ЯНТ как синергиста АДР;
-
Исследовать ответ СДГ и КДГ на стрессовые воздействия в зависимости от исходного физиологического состояния.
Научная новизна.
Впервые показано, что под воздействием условий, создаваемых в полярографической ячейке для исследования дыхания MX, происходит разрушение МРС. Это является причиной, которая ослабляет или делает невозможным наблюдение на выделенных препаратах физиологических изменений дыхания MX.
Благодаря использованию метода, сохраняющего для исследований нативную сеть MX, получены новые экспериментальные доказательства существования связи активности адренергической системы с сукцинатдегидрогеназой, окисляющей янтарную кислоту, а холинэргической регуляции с а-кетоглутаратдегидрогеназой, окисляющей а-кетоглутаровую кислоту.
Выявленные изменения митохондриальных процессов на разработанной модели перехода от физиологического напряжения, вызывающего усиление адаптационных реакций, к предпатологии, связанной с возникновением повреждений
метаболизма, позволяют впервые описать механизм перехода от стимулирующего действия нагрузок к повреждающему.
Практическая ценность.
Работа имеет фундаментальную и практическую значимость как принципиально новый, высокочувствительный к изменениям в организме диагностико-информативный способ измерения баланса симпатической — парасимпатической систем по измерению активностей СДГ И КДГ в лимфоцитах крови.
Эта разработка остро востребована в медицине для ранней диагностики доклинических нарушений физиологического состояния.
Дополнительным преимуществом предлагаемого метода является то, что работа проводится в капле крови на мазке, что позволяет широко применять метод в клинике в отличие от обычных способов, требующих взятия биоптата ткани.
На основе понимания биохимических механизмов предпатологических изменений могут быть предложены новые способы диагностики состояний организма, а также усиления адаптации и коррекции ее нарушений путем использования природных веществ, в частности метаболитов митохондрий.
Апробация. Основные положения диссертации докладывались на8-й международной конференции «Митохондриальная физиология» ("МІР", Бордо, Франция, 2011); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005, 2007, 2009, 2011), Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы стресса» (Витебск, 2011), YIII и IX съездах Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 2008, 2010), III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии (Москва, 2010), 16-ми 14-м Европейских конференциях по Биоэнергетике (ЕВЕС, Варшава, Польша, 2010, Москва, 2006) и др.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано более 24 печатных работ, из них 1 патент и 8статей.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения. Работа изложена на 135 страницах, содержит 5 таблиц и 29 рисунков. Список литературы включает 210 источников отечественной и зарубежной литературы.
