Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор данных литературы 7
1.1. Распределение и функции митохондрий в клетке 9
1.2. Цитоскелет, как средство внутриклеточного транспорта 10
1.2.1. Особенности системы микротрубочек 11
1.2.2. Особенности актинового цитоскелета 11
1.2.2.1. Полимеризация новых актиновых микрофиламентов. Агр2/3 -комплекс 12
1.2.2.2. Роль белков форминового семейства в организации актинового цитоскелета 13
1.2.3. Регуляция внутриклеточной организации микротрубочек и актинового цитоскелета 15
1.2.4. Участие двух цитоскелетных систем в транспорте митохондрий 18
1.3. Молекулярные моторы, участвующие в движении митохондрий 19
1.4. Регуляция распределения митохондрий как процесс переключения между стационарным и подвижным состояниями 22
1.5. Видеомикроскопические подходы к наблюдению митохондрий в живых клетках 26
Глава 2. Материалы и методы 30
2.1. Культивирование клеток 30
2.2. Флуоресцентная микроскопия 31
2.2.1. Фиксация клеток 31
2.2.2. Процедура иммунофлуоресцентного окрашивания 32
2.2.3. Антитела, используемые в работе 32
2.2.4. Окрашивание актина 33
2.3. ДНК конструкции 33
2.4. Трансфекция клеток 34
2.5. Микроинъекция 35
2.5.1. Микроинъекция кДНК 35
2.5.2. Микроинъекция белка 35
2.6. Получение видеомикроскопических данных 35
2.7. Обработка данных 36
Глава 3. Результаты исследования 38
3.1. Наблюдение митохондрий в живых клетках 38
3.2. Определение подвижности митохондрий клетках 39
3.3. Подвижность митохондрий находится под контролем внешних факторов 43
3.4. Лизофосфатидная кислота ингибирует подвижность митохондрий через белок RhoA 45
3.5. Белок RhoA регулирует распределение митохондрий, действуя через свои белки-мишени 47
3.5.1. Изменение активности Rho киназы не влияет на подвижность митохондрий 47
3.5.2. Белок mDial играет ключевую роль в регуляции транспорта митохондрий 49
3.6. Роль F-актина в ингибировании движения митохондрий 51
3.7. Полимеризация актина, стимулируемая независимыми от mDial способами, не снижает подвижность митохондрий 54
Глава 4. Обсуждение результатов 58
Выводы 62
Список использованной литературы 63
- Полимеризация новых актиновых микрофиламентов. Агр2/3 -комплекс
- Регуляция распределения митохондрий как процесс переключения между стационарным и подвижным состояниями
- Процедура иммунофлуоресцентного окрашивания
- Лизофосфатидная кислота ингибирует подвижность митохондрий через белок RhoA
Введение к работе
Митохондрии играют важнейшую роль в физиологии клетки. Они обеспечивают клетку энергией в форме молекул АТФ, участвуют в регуляции концентрации ионов кальция в цитоплазме, а также являются важнейшим звеном в процессе программируемой клеточной гибели. Для нормального функционирования митохондрий важное значение имеет их внутриклеточное распределение: во многих клетках митохондрии локализуются вблизи мест высокого потребления энергии или повышенной концентрации кальция. Локализация митохондрий находится под контролем внешних и внутренних факторов и достигается при помощи транспорта этих органелл вдоль микротрубочек и актиновых филаментов моторными белками. Чтобы работа различных моторных белков в клетках была скоординирована, необходимо наличие четкой системы их регуляции. Регуляция распределения митохондрий может происходить как на стадии собственно транспорта, в результате изменения активности моторных белков и организации микротрубочек и актиновых филаментов, так и при посредством регуляции взаимодействий митохондрий с неподвижными цитоскелетными структурами.
В отличие от других органелл, митохондрии большую часть времени проводят в неподвижном состоянии. Вопрос о том, какие именно белки участвуют в непосредственном удерживании митохондрий в неподвижном состоянии, в настоящее время остается открытым. Накапливается все больше данных, свидетельствующих о наличии стационарных взаимодействий между митохондриями и элементами цитоскелета. Тем не менее, сигнальные пути, лежащие в основе регуляции переключения между стационарным и подвижным состоянием митохондрий, еще не определены.
Мы обнаружили, что в клетках CV-1 митохондрии переходят из подвижного состояния в стационарное в ответ на добавление одного из основных факторов роста, лизофосфатидной кислоты (LPА). Связываясь с рецепторами на поверхности клеток, LPA вызывает такие изменения в клетках, как образование актиновых стресс-фибрилл, созревание фокальных контактов и стабилизацию микротрубочек в направлении движения клетки.
Целью настоящей работы было установить механизмы передачи сигнала LPA, контролирующего подвижность митохондрий, и определить участников этой передачи.
Мы показали, что за подвижность митохондрий отвечает регуляторный сигнальный каскад, включающий белок RhoA и активируемый им белок mDial. LPA, связываясь с клеточными рецепторами, стимулирует активацию малой ГТФ-азы RhoA, которая затем активирует белок mDial, относящийся к семейству форминов. Активный белок mDial стимулирует полимеризацию актина, и образующиеся структуры актинового цитоскелета взаимодействуют с митохондриями, которые в результате переходят в стационарное состояние.
Полимеризация новых актиновых микрофиламентов. Агр2/3 -комплекс
Полимеризация актина происходит в результате присоединения мономеров актина (G-актин) к уже существующим филаментам (F-актин). Центральную роль в полимеризации актина играет белковый комплекс Агр2/3, который может инициировать сборку новых актиновых филаментов (Mullins et al., 1998; Zigmond, 1998). Этот комплекс состоит из двух актиноподобных белков Агр2 и АгрЗ и еще пяти дополнительных белков. Было показано, что Агр2/3 комплекс инициирует образование нового филамента под углом 70 сбоку от существующего. Агр 2/3 комплекс остается связанным с минус концом нового актинового филамента, тем самым стабилизируя его. В результате полимеризации, стимулируемой Агр2/3, образуется разветвленная сеть актиновых филаментов, в местах ветвления которой находится комплекс Агр2/3 (см. обзоры Pollard et al., 2000; Pollard and Beltzner, 2002; Evangelista et al., 2003).
Хотя активность Агр2/3 комплекса в клетках довольно низка (Mullins et al., 1998), она может быть повышена при участии белка ActA, который был впервые найден в бактерии рода Listeria. Активируя эндогенный Агр2/3 комплекс, этот белок помогает клеткам Listeria двигаться внутри зараженной ею клетки за счет полимеризации актинового хвоста с одной стороны бактерии (Welch et al, 1997а; Welch et al., 1998). В эукариотических клетках аналогичный механизм активации Агр2/3 осуществляется белками семейства WASP. Было показано, что С-концевой домен белка N-WASP данного семейства связывается с Агр2/3 комплексом и значительно увеличивает его способность инициировать сборку новых актиновых филаментов (Rohatgi et al., 1999). В клетках мономерный актин (G-актин) находится в комплексе с белком профилином; белки семейства WASP способны связывать профилин и поставлять, таким образом, мономеры актина к Агр2/3 комплексу (Higgs and Pollard, 2001; Yang et al., 2000), повышая скорость полимеризации.
В клетках Агр2/3 комплекс располагается в местах активной полимеризации актина. Так, в подвижных фибробластах Агр2/3 комплекс локализуется вблизи переднего края клетки и участвует в полимеризации актина, образующего ламеллоподии (Kelleher et al., 1995; Welch et al., 19976; Machesky et al., 1997).
В основе полимеризации других актиновых структур, таких как стресе фибриллы и филлоподии, лежит другой механизм инициации новых актиновых филаментов. Этот механизм регулируется форминами и происходит независимо от Агр2/3 комплекса. Формины образуют семейство высоко консервативных эукариотических белков, вовлеченных в ряд клеточных процессов, включая клеточную поляризацию, цитокинез, формирование акросомы в спермин, а также морфогенез (см. обзоры: Ridley, 1999; Wasserman, 1998; Zeller et al., 1999). Принадлежность к форминовому семейству определяется наличием двух соседних гомологичных форминовых доменов, FHI и FH2 (Castrillon and Wasserman, 1994; Wasserman, 1998), регулирующих сборку актиновых микрофиламентов (Evangelista et al., 1997; Evangelista et al., 2002; Sagot et al., 2002; Watanabe et al., 1999). Было показано, что богатый пролином домен FH1 способен связываться с актин-связывающим белком профилином, способствуя нарушению связи между профилином и актиновым мономером, и их диссоциации (Chang et al., 1997; Evangelista et al., 1997; Imamura et al., 1997; Watanabe et al., 1997). В результате актиновый мономер оказывается вблизи FH2 домена (СагІІег and Pantaloni, 1997), который катализирует его присоединение к растущему концу актинового филамента (Copeland and Triesman, 2002). Первые доказательства участия форминов в сборке актиновых филаментов были получены в дрожжевых клетках. В транс фи цированных клетках, экспрессирующих N-концевой участок форминового белка Bnilp, содержащий FH1 и FH2 домены, наблюдалось повышенное содержание пучков актиновых филаментов (Evangelista et al.,1997). Вслед за этим было показано, что экспрессия N-концевого участка mDial, другого белка из этого семейства, найденного у млекопитающих, стимулировала образование стресс фибрилл (Watanabe et al., 1999) и увеличивала внутриклеточное содержание полимерного актина (Copeland and Treisman, 2002).
В отличие от Агр2/3 комплекса, который оказывается связанным с минус концом растущего актинового филамента, формины взаимодействуют с быстро растущим плюс концом филамента и стабилизируют его, при этом полимеризация актина не прекращается после связывания (Pruyne et al., 2002). Таким образом, формины могут стабилизировать актиновые филаменты, но в отличие от других стабилизирующих F-актин белков, они не ингибируют полимеризацию актина, а регулируют ее. В результате активации форминов, актин в клетках полимеризуется в виде пучков неразветвленных поляризованных филаментов, на плюс-конце которых находится форминовый белок (Evangelista et al., 2003).
Регуляция распределения митохондрий как процесс переключения между стационарным и подвижным состояниями
Локализация митохондрий в клетке напрямую связана с их функциями в клетке (синтез АТФ, регуляция уровня ионов кальция и передача сигнала при апоптозе). В ответ на внешние сигналы, потребность отдельных участков клетки в функциях митохондрий может изменяться. Это в свою очередь требует перераспределения митохондрий в клетке. В работе из лаборатории П. Холленбека (Morris and Hollenbeck, 1993) авторы манипулировали активностью растущего конуса роста аксона, изменяя его локальную потребность в энергии. Было показано, что митохондрии образуют кластеры в непосредственной близости к активному конусу роста, а при переводе конуса роста в неактивное состояние периферическое скопление митохондрий исчезает, и они диспергируют по всей длине аксона. При этом изменяется активность моторных белков, отвечающих за транспорт митохондрий в направлении плюс-конца микротрубочек, определяя общее направление движения. Интересно также, что в области активного конуса роста большинство митохондрий находится в стационарном состоянии и относительно небольшая их часть двигается к периферии, а при инактивации конуса роста большинство митохондрий оказывается подвижными и двигается уже в направлении тела клетки. Эти данные свидетельствует о наличии регуляции транспорта и локализации митохондрий по двум механизмам: 1) регуляция активности моторных белков, осуществляющих траснпорт митохондрий; 2) переключение между подвижным состоянием и состоянием покоя (заякоренным состоянием).
Поскольку многие известные молекулярные моторы являются фосфопротеинами, их локальное фосфорилирование/дефосфорилирование может изменять свойства моторов и связанного с ними внутриклеточного транспорта. Фосфорилирование может изменять не только активность моторных белков динеина и кинезина (Matthies et al., 1993; Mcllvain et al., 1994; Chilcote and Johnson, 1990; Hamasaki et al., 1991; Barkalow et al., 1994), но также и их способность связывать транспортируемые органеллы (SatoYoshitake et al., 1992; Lee and Hollenbeck, 1995; Dillman and Pfister, 1994). Возможно, эти механизмы также отвечают за регуляцию траспорта митохондрий. Так, было показано, что фактор некроза опухоли (TNF) подавляет функцию моторного белка кинезина, активируя киназу, фосфорилирующую его легкие цепи, нарушая при этом транспорт митохондрий в направлении плюс конца микротрубочек (De Vos et al., 2000). Тем не менее, даже при нормальной активности моторных белков, митохондрии могут оставться неподвижными вследствие взаимодействий, более прочных, чем усилие, производимое моторными белками. В нескольких работах высказывается предположение, что в основе ингибирования движения митохондрий лежит взаимодействие этих органелл с такими элементами цитоскелета, как промежуточные филаменты и актиновые микрофиламенты (Krendel et al., 1998, Wagner et al., 2003, Leterrier et al. 1994, Trinczek et al., 1999). Было показано, что в нервных клетках митохондрии способны прикрепляться к нейрофиламентам, и сила этого взаимодействия зависит от мембранного потенциала митохондрий (Wagner et al., 2003). Что касается заякоривания митохондрий на микротрубочках, то предполагается участие белков, ассоциированных с микротрубочками (MAP). Было продемонстрировано, что высокомолекулярные белки, ассоциированные с микротрубочками (HMW-MAP) специфически связываются с поверхностью митохондрний (Leterrier et al., 1994) . Повышенная экспрессия другого МАР-белка, Таи препятствовала движению митохондрий, не влияя при этом на активность моторных белков (Trinczek et al., 1999).
Появляется все больше работ, указывающих на то, что полимерный актин также препятствует транспорту митохондрий. Так было показано, что разборка актиновых филаментов в клетке приводит к увеличению скорости движения митохондрий вдоль микротрубочек (Krendel et al., 1998). Участие актиновых филаментов в регулируемом заякоривании митохондрий было также продемонстрировано при изучении быстрого аксонального транспорта митохондрий (Chada and Hollenbeck, 2003; Chada and Hollenbeck, 2004). Локальная стимуляция аксона микросферами с присоединенными к их поверхности молекулами нервного ростового фактора (NGF), приводила к тому, что митохондрии скапливались вблизи стимулируемых участков клетки и переставали двигаться. Этот эффект был специфичен для митохондрий, поскольку NGF никак не влиял на транспорт и распределение других органелл в клетке. При этом, неподвижное состояние митохондрий полностью нарушалось после деполимеризации актиновых филаментов латранкулином В, свидетельствуя о том, что полимерный актин необходим для удержания митохондрий в стационарном состоянии. В данной работе было также показано, что переключение между стационарным и подвижным состояниями митохондрий является регулируемым механизмом. Регуляторную роль в этом процессе играет фосфоинозитид 3-киназа (РІ 3-киназа). Было показано, что ее ингибирование полностью подавляет эффект иммобилизации митохондрий, вызываемый NGF (Chada and Hollenbeck, 2004).
Помимо PI 3-киназы, в настоящее время выявлен ряд других молекул, участвующих в регуляции подвижности митохондрий. Особенное внимание уделяется молекулам, которые напрямую связаны с метаболизмом митохондрий. В работе из лаборатории М. Шитца (Miller and Sheetz, 2004) авторы показали, что двигающиеся митохондрии в основном останавливаются между кластерами неподвижных митохондрий. Этот результат указывает на то, что возможно существует градиент молекул, участвующих в метаболизме митохондрий, который и определяет их подвижность. Основными метаболитами митохондрий являются АТФ и Са . Добавление антимицина, вещества, которое приводит к деполяризации мембранного потенциала митохондрий и снижению уровня производства митохондриями АТФ, стимулирует транспорт митохондрий в направлении минус конца микротрубочек в аксонах. Тем не менее, другой химический агент, снижающий потенциал митохондрий, ингибирует транспорт митохондрий в обоих направлениях (Miller and Sheetz, 2004).
Процедура иммунофлуоресцентного окрашивания
Предварительно зафиксированные необходимым для данной покраски фиксатором, клетки отмывали от фиксатора раствором PBS, не допуская подсыхания клеток. Покровные стёкла с клетками помещали клетками вверх на лист парафильма с нанесёнными каплями первых антител, разведённых в буфере А до необходимой концентрации. Лист парафильма содержался в камере с искусственно поддерживаемым высоким уровнем относительной влажности во избежание испарения раствора антител и подсыхания клеток. Инкубацию проводили при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем покровные стёкла с клетками прополаскивали в PBS и отмывали от несвязавшихся антител в PBS при комнатной температуре дважды по 15 мин. Инкубацию клеток со вторыми антителами проводили в аналогичных условиях. После последней отмывки покровные стекла с клетками при помощи эльванола фиксировали на предметных стеклах.
Для выявления системы микротрубочек использовали мышиные моноклональные антитела к сс-тубулину DM-lcc (Sigma) или кроличьи поликлональные антитела anti-Glu против детирозилированного тубулина (предоставленные др. Дж. Булински, Columbia University, Нью-Йорк, США). Результаты покраски наблюдали, используя микроскоп Zeiss Axiophot и CCD камеру Micromax (Princeton Instruments); применяли объективы Planapo 63х и 40х,
Для выявления экспрессии мутантов Rho-киназы (ROCK) с меткой с-Мус ипсользовали антитела 10Е9 против с-Мус (Sigma). В качестве вторых антител использовали козьи антитела к иммуноглобулинам мыши или кролика, конъюгированные с флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) или тетраметил-родамин-изотиоцианатом (TRITC), Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Для окрашивания F-актина после фиксации клеток параформальдегидом проводили их инкубацию с фаллоидином, конъюгированным с тетраметил-родамин-изотиоцианатом (Molecular Probes). Исходный раствор 100 мкг/мл в метаноле разводили в 20 раз в буфере А и добавляли к клеткам на 1 час при комнатной температуре (или добавляли фаллоидин к клеткам с раствором вторых антител). После этого клетки отмывались от излишков фаллоидина в PBS в течение 10-20 минут и заключались в эльванол. В работе использовались следующие конструкции: Плазмиды pCDNA3-EGFP-Racl(Q61L) и pCDNA3-EGFP Cdc42(Q61L), кодирующие конститутивно активированные мутанты белков Racl и Cdc42 (с точечной заменой глутамина на лейцин по 61 позиции); pCDNA3-EGFP-Racl (T17N), pCDNA3-EGFP-Cdc42 (T17N) -доминантно негативные мутанты Racl и Cdc42 (с точечной заменой треонина на аспарагин по 17 позиции); pCDNA3-EGFP-RhoA (Q63L) конститутивно активированный мутант RhoA (с точечной заменой глутамина на лейцин по 63 позиции). Все плазмиды любезно предоставлены др. Клаусом Ханом (Scripps Research Institute, Сан Диего, США). Плазмиды pEGFP-mDial-(AN3) и EGFP-mDial(AN3)-KA3, кодирующие мутанты белка mDial, были предоставлены др. Шу Нарумией (Kyoto University, Киото, Япония).
Плазмида CB6-EGFP-WA, кодирующая С-конец крысиного белка N-WASP была получена от др. Михаэля Уэя (Cancer Research UK, Лондон, В ел икобритания). Плазмиды pEF-BOS-myc-Rho-kinase-RB/РЩТТ) и pEF-BOS-myc-Rho-kinase-CA, кодирующие доминантно негативный и конститутивно активный мутанты Rho-киназы были любезно предоставлены др. Козо Каибучи (Nagoya University, Нагоя, Япония), Клетки, в которых экспрессировались одновременно EYFP-меченые митохондрии и мутантная форма RhoA-(Q63L) с присоединенным EGFP (зеленым флуоресцентным белком), определяли по способности митохондриального маркера (EYFP) излучать одновременно в двух каналах: красном и зеленом.
Трансфекци. культивируемых клеток CV-1 необходимыми конструктами производили с помощью липосомного реагента Unifectin М, предоставленным др. Андреем Суровым (Институт биоорганической химии, Москва). Накануне трансфекции клетки рассаживали по 3x105 клеток на 2 мл культуральной среды в 30 мм чашку Петри.
При 37С в С02-инкубаторе клетки выращивали до плотности субконфлуентного (50-70%) монослоя.
В одной пробирке 1 мкг ДНК растворяли в 100 мкл буфера (10 мМ Hepes, 0.9% NaCl, рН = 7.4). Добавляли 5 мкл энхансерного раствора (прилагаемого изготовителем), размешивали, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. В другой пробирке смешивали 10 мкл раствора Unifectin М с буфером до достижения конечного объёма 100 мкл. Объединяли содержимое обоих пробирок, бережно перемешивали и оставляли на 15-20 минут при комнатной температуре для образования в растворе липосом.
Лизофосфатидная кислота ингибирует подвижность митохондрий через белок RhoA
Лизофосфатидная кислота представляет собой фосфолипид, обладающий активностью ростовых факторов в нормальных и опухолевых клеточных культурах. Связываваясь с LPA-рецепторами на поверхности клетки, лизофосфатидная кислота запускает ряд сигнальных каскадов, вызывающих различные клеточные ответы. Один из наиболее изученных каскадов, стимулируемых LPA, включает активацию малой ГТФ-азы RhoA (Ridley and Hall, 1992; Cook et at, 1998). Мы предположили, что этот белок может быть также вовлечен и в регуляцию подвижности митохондрий. Чтобы проверить данное предположение, мы экспрессировали в клетках конститутивно активный мутант белка RhoA, EGFP-RhoA-(Q63L). Количественный анализ движения митохондрий в таких клетках показал, что, как и при добавлении LPA, относительная подвижность митохондрий в данных клетках сильно уменьшается (рис. 5). В результате экспрессии активного мутанта белка RhoA также изменялась форма митохондрий (рис. 6 А). Митохондрии сливались, принимая форму длинных разветвленных органелл, и иногда образовывали протяженные сети, заполняющие всю клетку. рибозилирует и тем самым инактивирует белок RhoA (Paterson et al., 1990; Ridley and Hall, 1992). Такое воздействие приводило к тому, что митохондрии фрагментировались, приобретая форму небольших округлых органелл, и, кроме того, почти все митохондрии коллапсировали в околоядерную область (рис. 6 Б). То есть нарушалось их заякоренное состояние на периферии. Таким образом, наши результаты показывают, что белок RhoA участвует в регуляции подвижности, распределения и формы митохондрий.
Поскольку активация RhoA оказалась необходимым и достаточным условием для удеоживания митохондрий в стационарном сотоянии на периферии, мы решили проверить, участвуют ли, активируемые им белки, mDial и Rho киназа, в регуляции подвижности митохондрий. Если переход митохондрий в неподвижное состояние, вызываемый LPA или белком RhoA, происходит вследствие активации Rho киназы, то при ее ингибировании, подвижность митохондрий должна возрастать. Чтобы изменить активность Rho киназы мы экспрессировали в клетках конститутивно активный (ROCK-CAT) и доминантно негативный (ROCK-RB/PH) мутанты этой киназы. Как и следовало ожидать, экспрессия ROCK-CAT индуцировала в клетках образование развитых стресс-фибрилл (рис. 7 В), a ROCK-RB/PH - приводила к их полному исчезновению (рис. 7 Е).
Поскольку оказалось, что Rho киназа непосредственно не участвует в регуляции движения митохондрий, мы решили изучить роль в этом процессе другого возможного участника — белка mDial. Чтобы активировать mDial, мы трансфецировали клетки плазмидой, кодирующей конститутивно активный мутант белка mDial, содержащий оба форминовых домена FH1 и FH2, но с удаленным RhoA-ГТФ-связывающим регуляторным доменом (RBD). Оказалось, что при экспрессии EGFP-mDial(AN3) быстрое движение митохондрий полностью подавлялось. Относительная подвижность митохондрий была почти в десять раз меньше, чем в контроле, и составляла менее 1% (рис. 8; таблица 3),
Помимо того, что в клетках, экспрессирующих конститутвно активный мутант белка mDial, все митохондрии были неподвижными, сами клетки изменяли свою форму, становились сильно вытянутыми (рис. 9 А). Митохондрии в таких клетках выстраивались вдоль длинной оси клетки (рис. 9 Б).
Поскольку инактивация белка RhoA СЗ-трансферазой приводила к нарушению заякоривания митохондрий на периферии клеток, важно было выяснить, будет ли она нарушать подвижность и картину распределения стационарных митохондрий в клетках, экспрессирующих активный мутант белка mDial. Численный анализ движения митохондрий показал, что инъекция СЗ-трансферазы в клекти, экспрессирующие mDial(AN3), не вызывала увеличения подвижности митохондрий (таблица 3). Кроме того, в таких клетках не изменялось характерное распределение и форма митохондрий (рис. 10), свидетельствуя о том, что роль белка RhoA в регуляции этих процессов сводится к активации белка mDial.
