Содержание к диссертации
СПИСОК НАИБОЛЕЕ УПОТРЕБИТЕЛЬНЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1 ЭНЕРГОЗАВИСИМЫЙ ТРАНСПОРТ ИОНОВ СА2+ В МИТОХОНДРИЯХ 11
ГЛАВА 2 МИТОХОНДРИАЛЬНЫИ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ДИАЗОКСИДА И ПИНАЦИДИЛА 17
ГЛАВА 3 Роль ПОРИНОВЫХ КАНАЛОВ В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ МИТОХОНДРИЙ 23
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение препарата изолированных митохондрий 28
Измерение характеристик изолированных митохондрий 28
Измерение переноса меченых протонов (3Н) через хлороформ 28
Характеристики ишемического повреждения сердечной мышцы 28
Культивирование клеток 29
«Пермеабилизация» плазматической мембраны гепатоцитов 29
Измерение ферментативных активностей 29
Измерение проницаемости внешней мембраны митохондрий 30
Статистический анализ 30
РЕЗУЛЬТАТЫ ЧАСТЬ 1 МИТОХОНДРИИ В РЕГУЛЯЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ
1.1 ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ И ОСОБЕННОСТИ ТРАНСПОРТА СА2 В МИТОХОНДРИЯХ 31
1.1.1 Колебания ионных потоков в митохондриях 31
1.1.2 Математическая модель колебаний ионных потоков в митохондриях 32
1.2 ВОЗБУДИМОСТЬ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ ИОНАМИ СА2 36
1.2.1 Возбудимость внутренней мембраны митохондрий ионами Са2+ 36
1.2.2 Волны сокращения-набухания в не перемешиваемом слое митохондрий 39
1.3 УЧАСТИЕ МИТОХОНДРИЙ ВО ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ СА2+ СИГНАЛИЗАЦИИ 45
1.3.1 Участие митохондрий в регуляции концентрации Са2+ в клетках 45
1.3.2 Участие митохондрии в синхронизации Са2+ волн в клетке.
13.3 Зависимость амплитуды Са2+ волны от состояния митохондрий 49
13.4 Восстановление амплитуды и синхронности Са2 волн 49 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 51 ЧАСТЬ 2 МИТОХОНДРИИ В МЕХАНИЗМЕ ИШЕМИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ
2.1 ВЛИЯНИЕ ДИАЗОКСИДА И ПИНАЦИДИЛА НА ФУНКЦИИ МИТОХОНДРИЙ 52
2..1.1 Деполяризующее действие активаторов КАТФ каналов на митохондрии 52
2.1.2 Действие диазоксида и пинацидила на дыхание митохондрий 54
2.1.3 Действие диазоксида и пинацидила на синтез АТФ в митохондриях 56
2.2 ВЛИЯНИЕ ДИАЗОКСИДА И ПИНАЦИДИЛА НА ТРАНСПОРТ СА24" В МИТОХОНДРИЯХ 57
2.2.1 Диазоксид и пинацидил подавляют накопления Са2+ в митохондриях 57
2.2.2 Диазоксид и пинацидил усиливают выход ионов Са2+ из митохондрий 59
2.2.3 Действие диазоксида и пинацидила на Са2"-зависимое открывание поры 61
2.2.4 Зависимость действия диазоксида и пинацидила от ионов hCe среде 62
2.2.5 АТФ и/или АДФ ингибируют эффект диазоксида и пинацидила 64
2.3 ВЛИЯНИЕ ДИАЗОКСИДА И ПИНАЦИДИЛА НА МИТОХОНДРИАЛЬНЫЙМЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ И СОДЕРЖАНИЕ СА2+ В КАРДИОМИОЦИТАХ 65
2.3.1 Диазоксид и пинацидил деполяризуют митохондрии в кардиомиоцитах 65
2.3.2 Диазоксид и пинацидил снижают митохондриальный Са2+ в клетках 67
2.4 ПРОТОНОФОРНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ АКТИВАТОРОВ КАТФ КАНАЛОВ 68
2.4.1 Общие закономерности действия диазоксида, пинацидила и 2,4-ДНФ на митохондриальные дыхание, мембранный потенциал и синтез АТФ 69
2.4.2 Диазоксид, пинацидил и ДНФ переносят f-Ґ через гидрофобную фазу 72
2.4.3 Разобщение митохондрий уменьшает ишемическое повреждение 74
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 77
ЧАСТЬ 3 РОЛЬ ПОРИНОВЫХ КАНАЛОВ В ФИЗИОЛОГИИ МИТОХОНДРИЙ
3.1 ОКИСЛЕНИЕ ЭТАНОЛА ЗАКРЫВАЕТ ПОРИНОВЫЕ КАНАЛЫ В ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЕ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ
3.1.1 Действие этанола и продуктов его окисления на основные функции митохондрий
3.1.2 "Пермеабилизация" клеточной и внешней митохондриальной мембран
3.1.3 Дигитонин обращает эффект ингибирования пориновых каналов
3.1.4 Окисление этанола закрывает пориновые каналы
3.1.5 Оценка пориновых каналов с помощью конфокальной микроскопии
3.1.6 Прохождение флуоресцентных молекул 3 кДа декстрана в межмембранное пространство
3.2 ОКИСЛЕНИЕ ЭТАНОЛА ПОДАВЛЯЕТ СИНТЕЗ МОЧЕВИНЫ В ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЕ ГЕПАТОЦИТОВ КРЫСЫ 95
3.2.1 Участие митохондрий в реакциях цикла мочевины 95
3.2.2 Окисление этанола подавляет синтез мочевины в гепатоцитах 96
3.2.3 Действие ингибиторов окисления этанола на синтез мочевины 98
3.2.4 Действие ингибиторов PI3 киназы и аденозин-А1 рецепторов на синтез мочевины 99
3.3 ЭТАНОЛ ПОДАВЛЯЕТ ОБМЕН МЕТИЛЬНЫХ ГРУПП В ГЕПАТОЦИТАХ КРЫСЫ 100
3.3.7 Митохондриальная система метаболизма глицина 100
3.3.2 Ядерная магнитная спектроскопия 13С изотопомеров серина 104
3.3.3 Окисление этанола подавляет митохондриальный синтез серина 106
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107
ЧАСТЬ 4 РОЛЬ ПОРИНОВЫХ КАНАЛОВ В ФИЗИОЛОГИИ КЛЕТОК
4.1 ЗАКРЫВАНИЕ ПОРИНОВЫХ КАНАЛОВ УВЕЛИЧИВАЕТ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК К ПРОГРАММИРУЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ (АПОПТОЗУ) 108
4.1.1 Закрывание пориновых каналов активирует МРТ пору 109
4.1.2 Закрывание пориновых каналов индуцирует окислительный стресс 111
4.1.3 Генетический нокаут белков-поринов увеличивает чувствительность клеток к адафостину 112
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 114
ПРИЛОЖЕНИЕ
РАЗРАБОТКА И СИНТЕЗ НОВОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ПРОБЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОНИЦАЕМОСТИ ПОРИНОВЫХ КАНАЛОВ
Принципиальная схема создания пориновой флуоресцентной пробы 115
Использование флуоресцентной пробы для оценки состояния пориновых каналов в митохондриях внутри интактных клеток 116
ОБСУЖДЕНИЕ 119
ВЫВОДЫ 135
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 138
СПИСОК ИЗБРАННЫХ РАБОТ СОИСКАТЕЛЯ 157
Введение к работе
Митохондрии активно изучаются во многих лабораториях мира на протяжении 60 с лишним лет после их открытия в 1949 году. Несмотря на десятки тысяч работ, посвященных исследованию митохондриальных функций, роль митохондрий в жизнедеятельности клетки и их участие в регуляции внутриклеточных процессов все еще остаются не выясненными. Митохондрии являются важнейшими внутриклеточными структурами, выполняющими значительную роль не только в функционировании клеток млекопитающих в нормальных условиях, но и в различных патологических процессах. Развитие большинства патологических процессов, в частности, аноксии, ишемии, геморрагического шока и окисления этанола сопровождается нарушениями нормального функционирования митохондрий и глобальной потерей митохондриальных функций. Митохондрий теряют способность поддерживать электрохимический градиент ионов водорода на внутренней мембране, эффективно осуществлять окислительное фосфорилирование, производство АТФ и сбалансированный митохондриальный Са2+ ионный гомеостаз, несмотря на наличие кислорода и субстратов окисления [1-11]. Получено множество экспериментальных данных, указывающих на то, что митохондрии являются первичными мишенями различных патологических воздействий [9; 12-17]. В большинстве случаев эти воздействия обусловлены нарушениями внутриклеточного Са2+ гомеостаза [16-23]. Изучение роли митохондрий в жизнедеятельности клеток млекопитающих осложнено множественностью выполняемых митохондриями функций и переплетением внутриклеточных и внешних факторов, определяющих взаимодействие между митохондриями и остальными внутриклеточными структурами. Кроме хорошо известной роли митохондрий, как основного производителя АТФ, универсальной внутриклеточной энергетической "валюты", митохондрии принимают непосредственное участие в регуляции концентрации свободного Са2+ в цитоплазме клеток в качестве кальциевого депо с низким сродством, которое, однако, по своей ёмкости намного превосходит ёмкости эндо - и/или саркоплазматического ретикулумов. В покоящейся клетке митохондрии окружены цитоплазмой с низкой концентрацией ионов Са2+ (10"7-10"8 М) и находятся в стационарном состоянии покоя, так как концентрация свободного Са2+ существенно ниже сродства Са2+-транспортирующей системы митохондрий (10"5-10"3 М), [16-18; 20, 21, 24-35].
Однако, в переходных процессах, когда концентрация ионов Са2+ в цитоплазме значительно возрастает, (особенно в областях между эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями) высокие концентрации свободных ионов Са2+ способствуют накоплению некоторых количеств Са2+ в матриксе митохондрий (10" 3-10"2 М) [25; 32; 35; 36]. В этих условиях небольших нагрузок концентрация ионов Са2+ в матриксе митохондрий достигает значений достаточных для воздействия на состояния митохондрий, в частности, способствует увеличению производства АТФ [20; 21; 33; 34]. Однако, дальнейшее увеличение концентрации ионов Са2+ в матриксе митохондрий приводит к увеличению генерации кислородных радикалов, к активации неспецифической поры в мембране митохондрий, набуханию и разрыву внешней мембраны митохондрий с потерей митохондриальных функций [6; 10; 15-17; 19; 25; 34; 37-39]. Таким образом, митохондриальный транспорт Са2+ в зависимости от количества накопленного Са2+ определяет судьбу клеток млекопитающих от нормального функционирования до программируемой или некротической клеточной гибели. При ишемическом повреждении сердечной мышцы эта способность митохондрий накапливать и освобождать ионы Са2+ определяет степень пост-ишемического повреждения сердечной мышцы. В период ишемии, когда из-за закупорки коронарных сосудов подача кислорода и метаболитов к клеткам сердечной мышцы ограничена, активность митохондриальной дыхательной цепи снижена и митохондриальная мембрана в значительной мере деполяризована. При этом накопления ионов Са2+ в митохондриях не происходит, и никаких внешних проявлений повреждений тканей не наблюдается. Наиболее значительные нарушения структуры и функции митохондрий наблюдаются при восстановлении потока свежей крови через закупоренные коронарные сосуды, которое приводит к подаче кислорода и метаболитов к ишемической ткани и удалению продуктов метаболизма [3; 6; 15-17; 20; 25; 33; 34; 36]. По-видимому, поступление кислорода к анаэробным митохондриям с высоким уровнем восстановленности комплексов дыхательной цепи, сопровождающееся быстрым восстановлением митохондриального мембранного потенциала, является причиной интенсивного накопления значительного количества ионов Са2+ в матриксе митохондрий [40-44]. Повреждающее действие избыточного накопления ионов Са2+ усиливается в условиях повышенного окислительного стресса, например, при окислении многих ксенобиотиков, включая окисление этанола в клетках печени. Различные патологические условия, приводящие к повреждению митохондриальных функций, таким образом, обусловлены избыточным накоплением ионов Са в митохондриях, которое приводит к открыванию неспецифической поры и потере важнейших митохондриальных функций [2-4; 6; 14-17; 45]. Однако, механизмы, с помощью которых ионы Са2+ приводят к нарушению митохондриальных функций, до конца не выяснены. Для их понимания необходимо исследовать динамику взаимодействия этих ионов с митохондриями на различных уровнях - в изолированных митохондриях, клеточных культурах и в целом органе.
При развитии патологических состояний, в том числе и при алкогольной интоксикации, проницаемость внешней митохондриальной мембраны может меняться, приводя к нарушениям нормального функционирования митохондрий. Существенную роль в поддержании нормального обмена метаболитов между цитоплазмой и митохондриями выполняют каналы во внешней мембране митохондрий, образованные пориновыми белками. Любые нарушения этого обмена приведут к существенным нарушениям метаболизма клеток, особенно в тех процессах, которые невозможны без участия митохондрий. Однако, роль пориновых каналов в индукции и развитии алкогольной интоксикации до сих пор остается не выясненной. Таким образом, целями настоящей работы являются:
1. Определение участия и роли митохондриального транспорта ионов Са2+ в поддержании нормальной жизнедеятельности клеток млекопитающих.
2. Исследование степени участия митохондрий в регуляции концентрации свободных ионов Са2+ в цитоплазме.
3. Изучение роли митохондриальной компоненты в механизмах ишемического повреждения и противоишемического защитного действия диазоксида и пинацидила, активаторов плазматических АТФ-зависимых калиевых каналов.
4. Определение необходимости «умеренной» деполяризации митохондрий в постишемическом периоде для восстановления механической активности сердечной мышцы.
5. Определение механизма токсического действия этанола на метаболизм митохондрий в интактных клетках.
6. Исследование последствий закрывания пориновых каналов на жизнедеятельность и жизнеспособность клеток млекопитающих.
В связи с этими целями в настоящей работе будут решаться следующие задачи: 1. Выяснить последствия взаимодействия ионов Са2+ с основными митохондриальными функциями и определить факторы, активирующие неспецифическую Са -зависимую МРТ пору во внутренней мембране митохондрий.
2. Используя теоретический подход и математическую модель митохондриального ионного транспорта, основанную на регуляции проницаемости внутренней мембраны митохондрий Са2+-зависимой порой, получить количественное описание энергозависимых потоков ионов в митохондриях.
3. Получить экспериментальные доказательства участия энергозависимого митохондриального транспорта Са2+ в определении внутриклеточной динамики свободных ионов Са2+, включая генерацию, распространение и синхронизацию Са2+ волн в цитоплазме.
4. Выявить митохондриальный механизм защитного действия противоишемических фармакологических агентов, таких как диазоксид и пинацидил, известных фармакологических активаторов АТФ-зависимых К+ каналов (КАТФ) плазматической мембраны. На ишемической модели изолированного сердца крысы, определить роль транспорта Са2+ в митохондрии в механизме ишемического повреждения сердечной мышцы.
5. На модели изолированных гепатоцитов крыс, проверить нашу гипотезу о том, что возможной причиной глобальной потери митохондриальных функций при отравлении печени алкоголем является закрывание пориновых каналов во внешней митохондриальной мембране.
6. Разработать подходы к экспериментальному измерению проницаемости пориновых каналов во внешней мембране митохондрий внутри интактных клеток без их выделения из гепатоцитов. Определить какой из продуктов окисления этанола (NADH, кислородные радикалы, ацетальдегид и/или ацетат) играет существенную роль в механизме закрывания и способствует закрыванию митохондриальных пориновых каналов.
7. Исследовать роль закрывания пориновых каналов внешней митохондриальной мембраны в гепатоцитах, окисляющих этанол на основные функции печени - синтез мочевины, а также производство и обмен метильных групп в гепатоцитах.
8. Исследовать эффект закрытия пориновых каналов и уменьшения проницаемости внешней мембраны митохондрий на Са2+-индуцированное открывание неспецифической поры и высокоамплитудного набухания и определить механизм повреждающего действия закрытых пориновых каналов на функции интактных митохондрий. 9. Определить влияние закрывания пориновых каналов внешней митохондриальной мембраны на цитотоксичность лекарственных препаратов на примере противоопухолевого агента адафостина.
Проведенное в настоящей работе изучение особенностей транспорта ионов Са2+ в митохондриях тканей сердца и печени позволит выявить факторы, которые являются определяющими в нарушениях митохондриальных функций при развитии различных патологических процессов, и использовать полученные данные для разработки методологических и терапевтических подходов для защиты этих органов. Полученные в работе данные могут быть использованы для разработки методологических и терапевтических подходов, направленных на уменьшение последствий ишемического и/или алкогольного повреждения тканей сердца и печени, а также для разработки и изготовления, новых более эффективных фармакологических препаратов для лечения ишемического и/или алкогольного повреждения тканей сердца и печени.
Настоящая работа разделена на четыре Части, в каждой из которых рассмариваются экспериментальные данные по одной теме. Часть 1 посвящена описанию особенностей транспорта ионов Са2+ в митохондриях и их определяющей роли в регуляции динамики внутриклеточных Са2+ волн. В Части 2 представлены данные о повреждении митохондриальных функций в ишемическом сердце, о способах защиты миокарда от ишемического повреждения и о роли митохондрий в восстановлении сократительной активности сердца после длительной ишемии. Часть 3 посвящена обсуждению регуляторной роли пориновых каналов во внешней мембране митохондрий в нормальной жизнедеятельности митохондрий и клеток, а также их значению в токсическом действии этанола. В Части 4 представлены данные об ускорении программируемой клеточной гибели индуцированной адафостином, препаратом с противоопухолевым действием, при генетическом удалении (нокауте) белков поринов в митохондриях клеток эмбриональных фибробластов мышей.
