Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 10
1.1. МтДНК - чувствительная мишень для эндогенных и экзогенных повреждающих агентов. 10
1.2. ДНКсвязывающие белки ядер и их роль в обеспечении защиты ядерного генома от действия повреждающих агентов . 19
1.3. ДНК-связывающие белки митохондрий клеток млекопитающих. 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы. 40
2.1. Животные. 40
2.2. Основные химические реактивы. 40
2.3. Радиационная обработка. 40
2.4. Выделение митохондрий и ядер из тканей крыс и мышей . 41
2.5. Очистка митохондрий в градиенте сахарозы. 42
2.6. Очистка митохондрий с использованием дигитонина. 42
2.7. Получение нуклеоидов митохондрий. 43
2.8. Выделение кислоторастворимых белков митохондрий и гистонов ядер из печени и селезенки. 43
2.9. Очистка белков на ДЭАЭ-целлюлозе. 44
2.10. Получение ДНК-белковых комплексов in vitro. 45
2.11. Обработка ДНК-белковых комплексов перекисью водорода . 45
2.12. Исследование образования ДНК-белковых комплексов с помощью актиномицина Д. 46
2.13. Выделение мтДНК с использованием фенола. 46
2.14. Выделение мтДНК на магнитных сорбентах. 47
2.15. SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле. 47
2.16. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 48
2.17. Определение количества ДНК-белковых сшивок. 49
2.18. Определение АДФ-рибозо-синтетазной активности. 49
2.19. Определение концентрации белка. 5 О
2.20. Определение концентрации ДНК спектрофотометрическим методом. 51
2.21. Определение содержания ДНК флуоресцентным методом. 51
2.22. Статистическая обработка. 51
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение. 52
3.1. Основные кислоторастворимые белки в митохондриях. 52
3.2. Исследование комплексирования основных белков митохондрий с ДНК in vitro. 60
3.3. Выяснение возможной ассоциации белков и мтДНК в митохондриях in vivo . 71
3.3.1. Формирование ДНК-белковых сшивок в митохондриях тканей крыс, подвергнутых радиационному воздействию. 74
3.3.2. Активация поли(АДФ-рибозил)ирования белков в митохондриях тканей крыс, подвергнутых радиационному воздействию. 78
3.4. Участие белков нуклеоидов митохондрий в защите мтДНК при действии повреждающих агентов. 86
Заключение. 94
Выводы. 100
Список литературы.
- ДНКсвязывающие белки ядер и их роль в обеспечении защиты ядерного генома от действия повреждающих агентов
- Выделение митохондрий и ядер из тканей крыс и мышей
- Обработка ДНК-белковых комплексов перекисью водорода
- Выяснение возможной ассоциации белков и мтДНК в митохондриях in vivo
Введение к работе
Клетки млекопитающих содержат не только ядерную ДНК (яДНК), но и митохондриальную ДНК (мтДНК), которая составляет около 1,0% от общей ДНК различных тканей [Shadel and Clayton, 1997]. Несмотря на то, что мтДНК у млекопитающих была открыта более 40 лет назад, в последние 10-15 лет интерес к изучению молекулярных механизмов ее функционирования, мутагенеза, сохранения и стабилизации в клетках значительно повысился в связи с выявлением множества «митохондриальных» заболеваний, с выяснением роли мтДНК в клеточной гибели, канцерогенезе, старении. Известно, что культивируемые in vitro лишенные мтДНК клетки (rho0) и могут жить в определенных условиях, тем не менее, целостность митохондриального генома для жизни многоклеточного организма является критической. В митохондриях в процессе окислительного фосфорилирования образуется значительное количество активных форм кислорода (АФК), способных вызывать повреждения мтДНК и других макромолекул. По-видимому, близость мтДНК к комплексам белков-ферментов дыхательной цепи, генерирующей АФК, делает ее легко доступной мишенью для этих окислителей. Кроме того, мтДНК in vivo более подвержена воздействию экзогенных химических и физических агентов, чем яДНК. В течение более, чем 10 лет в различных статьях и фундаментальных обзорах высказывается точка зрения о том, что повышенная повреждаемость мтДНК в клетках млекопитающих в значительной мере обусловлена отсутствием в митохондриях гистонов, образующих комплексы с мтДНК и обеспечивающих ее защиту от действия АФК, как в случае с яДНК [Kang and Hamasaki, 2005; LeDoux and Wilson 2005; Wallace, 2005].
Известно, что яДНК в клетках высших организмов в значительной мере экранирована гистонами и негистоновыми белками от действия АФК и других повреждающих агентов. Эти белки обеспечивают компактную укладку яДНК в составе хроматина, ее структурную организацию и функционирование.
Значительная часть негистоновых белков в хроматине представлена ферментами и полипептидами, регулирующими функционирование ДНК [Berezney, 2002; Gilbert et al., 2005]. О прочной ассоциации этих белков с ДНК в составе ядерного хроматина свидетельствует то, что при действии окислителей или других агентов на клетки образуются ДНК-белковые сшивки (ДБС). Известно также, что ДНК в клетках бактерий комплексирована с белками, в том числе гистоноподобными, формируя нуклеоид или бактериальный хроматин [Azam and Ishihama, 1999; Travers and Muskhelishvili, 2005]. Топология структуры хроматина клеток высших организмов и нуклеоида бактериальных клеток меняется в зависимости от функционирования процессов репликации, рекомбинации, репарации и транскрипции в клетках. Гистоны и негистоновые белки хроматина, а также белки в составе бактериальных нуклеоидов являются кислоторастворимыми, что дает методическое преимущество для их экстрагирования и анализа [Yu and Bender, 1995]. Что касается мтДНК, то вопросы о ее структурно-функциональной организации в митохондриях и возможности формирования комплексов мтДНК с белками, способными снижать атаки АФК и других повреждающих агентов на митохондриальный геном, к началу наших исследований оставались не достаточно ясными. Развитие исследований в этом направлении важно для понимания путей защиты, сохранения генетического материала в митохондриях, косвенно участвующего в регуляции множества клеточных процессов. Более того, хорошо установлено, что накопление значительного количества повреждений в мтДНК клеток приводит к ухудшению энергозависимого метаболизма в тканях, развитию различных патологий (нейропатии, миопатии, кардиопатии, диабета), дегенеративных процессов, ускорению старения и гибели клеток [LeDoux and Wilson 2005; Wallace, 2005]. Поэтому наше исследование было направлено на изучение основных (ДНК-связывающих) белков в митохондриях клеток
млекопитающих и роли этих белков в сохранении мтДНК в условиях повышенного окислительного стресса.
Цель и задачи исследования.
Цель настоящей работы состояла в исследовании ДНК-связывающих основных белков митохондрий клеток млекопитающих и способности этих белков в составе ДНК-белковых комплексов снижать повреждения мтДНК. В соответствии с выбранной целью были поставлены следующие конкретные задачи:
Выяснить наличие ДНК-связывающих основных белков в митохондриях тканей крыс, определить их состав и способность формировать комплексы с ДНК in vitro.
Исследовать ДНК-белковые комплексы в митохондриях in vivo по формированию ДНК-белковых сшивок и активации поли(АДФ-рибозил)ирования белков, индуцируемых ионизирующим излучением.
Исследовать способность основных белков митохондриальных нуклеоидов снижать уровень повреждений мтДНК, индуцируемых перекисью водорода и ионизирующей радиацией.
Научная новизна работы. Впервые установлено, что митохондрии млекопитающих содержат более 20 основных ДНК-связывающих полипептидов, которые образуют комплексы с ДНК in vitro, аналогично ядерным гистонам. Впервые показано, что ионизирующая радиация вызывает образование ДНК-белковых сшивок и активацию поли(АДФ-рибозил)ирования белков в митохондриях тканей облученных животных, также как и в ядрах, что свидетельствует о существовании in vivo в митохондриях ДНК-белковых комплексов и связи мтДНК с поли(АДФ-рибозил)полимеразой, активируемой при возникновении разрывов цепей мтДНК. Впервые продемонстрировано, что основные белки, образующие
комплексы с мтДНК и формирующие с ней компактные структуры -нуклеоиды, обеспечивают защиту митохондриального генома, как и гистоны яДНК, от повреждающего действия ионизирующего излучения и перекиси водорода.
Практическая ценность работы. Представленные в настоящей работе результаты исследования имеют существенное значение для понимания путей защиты, сохранения генетического материала митохондрий, участвующего в регуляции множества клеточных процессов. Результаты этой работы представляют несомненный практический интерес, поскольку могут быть использованы при разработке способов повышения устойчивости мтДНК, регуляции энергозависимых процессов и метаболической коррекции различных патологий.
ДНКсвязывающие белки ядер и их роль в обеспечении защиты ядерного генома от действия повреждающих агентов
Поскольку наша работа посвящена изучению роли ДНК-связывающих основных белков митохондрий в сохранении и защите мтДНК, рассмотрим в сравнительном плане комплексирование яДНК с белками и роль этих комплексов в обеспечении защиты ядерного генома от действия повреждающих агентов.
В клетках млекопитающих яДНК находится в виде нуклеопротеида и упакована в хроматине с образованием четко упорядоченных структур -хромосом. Организации ДНК в составе хроматина, изучению белков хроматина и механизмов функционирования процессов репликации, репарации и транскрипции ДНК в составе хроматина посвящено огромное количество публикаций. ДНК-связывающие белки хроматина клеток высших организмов играют первостепенную роль в топологии укладки громадных молекул ДНК, их функционировании и защите от действия эндогенных и экзогенных повреждающих факторов. Хорошо известно, что ДНК-связывающие белки хроматина ядер млекопитающих подразделяются на две группы: гистоны и негистоновые хромосомные белки.
Гистоны являются универсальными компонентами хроматина и представляют собой относительно небольшие белки с очень высокой долей положительно заряженных аминокислот (лизина и аргинина). Гистоны образуют семейство высоко консервативных основных белков, которые разделяются на пять классов, названных HI, Н2А, Н2В, НЗ и Н4. Гистон HI сильно обогащен остатками лизина, для гистонов Н2А и Н2В характерно умеренное содержание лизина, полипептидные цепи гистонов НЗ и Н4 богаты аргинином [Marvin et al., 1990]. В дополнение к каноническим гистонам в соматических клетках млекопитающих обнаружены многочисленные варианты гистонов, которые функционально отличаются от канонических.
Так, например, в настоящее время идентифицировано несколько вариантов гистона Н2А (Н2А.Х, H2A.Z, макроН2А1, макроН2А и H2A.Bbd) и гистона НЗ (Н3.1, Н3.2, НЗ.З и CENP-A) [Chakravarthy et al., 2005; Pusarla and Bhargava, 2005; Sarma and Reinberg, 2005; Thambirajah et al., 2006].
Элементарная единица упаковки хроматина - нуклеосома - состоит из двойной спирали ДНК (147 п.о.), обмотанной вокруг октамера гистонов: Н2А, Н2В, НЗ и Н4. Такие структуры являются первым уровнем упаковки ДНК и называются 10 нм филаментами. С межнуклеосомным участком ДНК (линкерный участок) связан гистон НІ, в присутствии которого хроматин конденсируется в 30 нм фибриллу [Wolffe, 1994; Dorigo et al., 2004]. При взаимодействии нуклеосомных структур с негистоновыми белками и белками ядерного матрикса образуются большие петлевые домены хроматина (от нескольких тысяч до 10 миллионов п.о.), позволяющие контактировать удаленным участкам хромосом [Dekker, 2003; Chambeyron and Bickmore, 2004]. Такие структуры могут быть еще более компактизованы до образования интерфазных и митотических хромосом.
Каждый гистон содержит центральный структурированный трехспиральный домен и неструктурированные N- и С- «хвосты», обогащенные положительно заряженными аминокислотными остатками лизина и аргинина [Mersfelder and Parthun, 2006]. N-концевые «хвосты» четырех коровых гистонов являются мишенями для многих пострансляционных модификаций, таких как ацетилирование, метилирование, убиквитинирование, фосфорилирование и поли(АДФ-рибозил)ирование [Wu and Grunstein, 2000; Zlatanova et al., 2000], которые коррелируют с изменениями активности генов [Morales and Richard-Foy, 2000; Mersfelder and Parthun, 2006]. Весь этот набор посттрансляционных модификаций представляет собой так называемый гистоновый код, который добавляет дополнительный уровень информации к геномному [Jenuwein and Allis, 2001; Turner, 2002].
При экспрессии генов на уровне гистонового кода создается регуляторная система, которая переключает домены хроматина при различных функциональных состояниях. Одним из механизмов такой регуляции являются АТФ-зависимые системы, реконструирующие хроматин [Langst and Becker, 2001; Peterson, 2003]. Существуют свидетельства того, что реконструирующие ферменты также вовлечены в разворачивание больших доменов хроматина [Peterson, 2003]. Следует отметить, что линкерные гистоны, которые часто связаны с конденсированным неактивным хроматином, являются потенциальными ингибиторами процесса реконструкции хроматина, что создает функциональную связь между состоянием хроматина и реконструирующими системами [Horn et al., 2002].
О том, каким образом хроматин организуется в клетке, известно немного. Вновь синтезированные цепи ДНК достаточно быстро собираются в хроматин через многоступенчатый процесс, который начинается включением гистонов НЗ и Н4, затем следует включение двух димеров Н2А-Н2В. Родительские нуклеосомы разделяются на НЗ-Н4 тетрамеры и Н2А-Н2В димеры, которые затем распределяются случайным образом между двумя дочерними дуплексами ДНК. Родительский хроматин обеспечивает только половину требующихся гистонов, остальные синтезируются de novo в течение S-фазы клеточного цикла [Osley, 1991].
Выделение митохондрий и ядер из тканей крыс и мышей
Крыс подвергали у-облучению на установке Гупос ( Cs) при мощности дозы 125 сГр/мин. В качестве контроля использовали необлученных животных. Каждая исследуемая группа состояла из 5-6 животных.
Облучение суспензий митохондрий, нуклеоидов и мтДНК проводили при 1-3 С рентгеновскими лучами на установке «РУТ-250-15-1» при мощности дозы 2,05 Гр/мин, напряженности 200 кВ, силе тока 20 мА, фильтры 1мм А1 и 1 мм Си, фокусное расстояние 37 см. Контролем служили необлученные образцы. Сразу же после облучения образцы помещали в лизирующий раствор и проводили выделение мтДНК.
Животных декапитировали под эфирным наркозом, ткани извлекали, промывали в охлажденном буфере А (10 мМ Трис-НС1, 250 мМ сахароза, рН 7,4), осушали фильтровальной бумагой и взвешивали. В дальнейшем все процедуры выделения органелл и белков проводили при 1-2С. Ткани пропускали через металлический пресс и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с вращающимся со скоростью 400 об/мин тефлоновым пестиком в буфере А, содержащем 1 мМ ЭДТА. Получали 30%-гомогенат (вес/объем) и разводили его в два раза тем же буфером.
Митохондрии из печени и селезенки выделяли с использованием стандартного метода дифференциального центрифугирования [Pedersen et al., 1978]. Для этого полученный гомогенат центрифугировали при 680g в течение 10 минут. Осадок (неразрушенные клетки, клеточные обломки и ядра) удаляли, а супернатант переносили в другие пробирки и центрифугировали 10 минут при 8500g. Осажденные митохондрии промывали два раза в буфере А и центрифугировали при 8500g 10 минут. Полученные митохондрии (осадок) дополнительно очищали от примесей в градиенте сахарозы [Ausenda and Chomyn, 1996] или с использованием дигитонина [Lowenstein et al., 1970; Pedersen et al., 1978].
Ядра выделяли с использованием метода [Blobel and Potter, 1966]. Для этого полученный гомогенат ткани центрифугировали при 680g в течение 10 минут. Осадок (ядра) ресуспендировали в буфере А, содержащем 1 мМ ЭДТА, 3 мМ MgCl2, 0,2 мМ PMSF, рН 8,0 и центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Отмывку повторяли еще раз. Затем ядра клеток использовали для выделения гистонов. В экспериментах по определению уровня ДБС и АДФ-рибозо-синтетазной активности при выделении митохондрий и ядер использовали буфер Б (50 мМ Трис-НС1, 250 мМ сахароза, 1 мМ ДДТ; 0,5 мМ PMSF; 50 мМ КС1; 5 мМ MgCl2 рН 7,5).
Митохондрии очищали от примесей в градиенте сахарозы [Ausenda and Chomyn, 1996]. Для этого суспензию митохондрий наслаивали на двухступенчатый градиент сахарозы, состоящий из равных объемов 1,0 М и 1,7 М растворов сахарозы в буфере Б. Затем центрифугировали при 63000xg в течение 30 минут. Митохондрии, расположенные на границе слоев сахарозы, собирали, разводили в 3-4 раза буфером А и центрифугировали 15 минут при 20000g. Очищенные митохондрии замораживали или сразу же использовали для дальнейших экспериментов.
Митохондрии очищали от примесей с использованием дигитонина [Lowenstein et al., 1970; Pedersen et al., 1978]. Для этого суспензию митохондрий разводили в 4 раза буфером А, помещали на ледяную баню и добавляли раствор дигитонина (2 мг/мл) из расчета 2 мг дигитонина на 10 г ткани (для лучшего растворения его прогревали несколько минут при 90С и хранили при 70-80С до момента добавления к суспензии, чтобы он не выпал в осадок). Обработку дигитонином проводили в течение 1,5 минуты при постоянном помешивании на ледяной бане, затем быстро разбавляли большим количеством буфера А (40-50 мл) и центрифугировали 3 минуты при 19400g. Далее промывали осадок митохондрий буфером А еще два раза, центрифугируя: 10 минут при 8500g и 10 минут при 10400g, соответственно. Очищенные митохондрии замораживали или сразу же использовали для дальнейших экспериментов.
Обработка ДНК-белковых комплексов перекисью водорода
МтДНК из митохондрий выделяли с использованием фенола [Gupta, 1984]. Для этого митохондрии ресуспендировали в 10 мл лизирующего раствора (1% SDS, 100 мМ NaCI, 100 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-НС1 рН 8,0) и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. В полученный лизат добавлялась протеиназа К до конечной концентрации 100 мкг/мл. Раствор термостатировался в течение суток при 42С при периодическом перемешивании. Затем к полученному лизату добавляли равный объём фенола, насыщенного 0,1 М трис-ЭДТА (рН 8,0). В течение 20 минут образец тщательно перемешивали с фенолом переворачиванием. Затем центрифугировали 10 минут при 2900g, отбирали верхнюю водную фазу и экстрагировали равным объёмом смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1). Фазы разделяли центрифугированием и отбирали водную. ДНК осаждали добавлением полуторакратного объёма охлаждённого 96% этанола, предварительно добавив 1/40 - 1/50 часть от общего объёма раствора 5 М NaCI. Затем пробы охлаждали до -20С для окончательного формирования осадка и далее хранили при этой температуре.
ДНК из митохондрий и нуклеоидов выделяли с помощью набора реактивов Magnet DNA MegaPrepl, полученных от ООО «Лаборатория Изоген», г.Москва [Nishimura et al., 2002]. Для этого к исследуемой пробе добавили 4 мл лизирующего реагента и 200 мкл суспензии Magnetic-сорбента, перемешали и установили на магнитный штатив на 20 секунд. Затем удалили прозрачный супернатант с помощью пипетки, добавили 2 мл лизирующего реагента, и повторили процедуру еще раз. После чего добавили в пробирку 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешали, и установили на магнитный штатив на 20 секунд. Затем удалили прозрачный супернатант. Повторили процедуру с солевым буфером еще два раза. После чего просушили осадок при 65С в течение 10 минут, добавили к нему 200 мкл ЭкстраГена и суспендировали содержимое пробирки на вортексе до получения гомогенной суспензии, затем термостатировали 5 минут при +65 С. Еще раз суспендировали содержимое пробирки на вортексе и центрифугировали при 7000g в течение 1 минуты. Супернатант перенесли в чистую пробирку, а с осадком еще раз повторили процедуру экстракции. Полученные супернатанты объединяли и использовали для дальнейших экспериментов.
Электрофорез белков в 15%-ном полиакриламидном геле проводили по методу [Laemmli, 1970]. Сила тока соответствовала примерно 30-35 мА в течение 4-5 часов. Гели фиксировали в растворе, содержащем 10% уксусной кислоты, 40% этанола и 45% воды, в течение 30 минут при комнатной температуре. Гели окрашивали 0,05% Кумасси (СВВ R-250) в 10% уксусной кислоте, 10% этаноле и 80% воде в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем отмывали, по крайней мере, в течение 24 часов в растворе 7% уксусной кислоты. Отмытые гели фотографировали с помощью гель-документирующей системы Док-принт («Vilber Lourmat Systems Inc.», Франция). Молекулярные массы полипептидов определяли с помощью программного обеспечения PhotoCaptMw («Vilber Lourmat Systems Inc.», Франция).
Для синтеза длинного фрагмента мтДНК мыши длиной 15983 п.о. использовали две пары праймеров: MSFIFor (5 -ТТТ ATA GGC ТАС GTC СТТ CCA TGA GG-3 ) и MSFIRev (5 -GGC AGG TAG GTC AAT GAA TGA GTG G-3 ) [Melov et al. 1997]. В реакцию отбирали по 5 мкл мтДНК, что составляло приблизительно 1-3 нг ДНК. Каждые 25 мкл реакционной смеси для ПЦР содержали: 200 нМ каждого праймера; 200 мкМ каждого dNTP; 2,5 мМ MgCb; 75 мМ Трис-HCI, рН 8,8; 20 мМ (NH4)2S04; 0,01% твин 20 и 0,5 суммарной единицы смеси Taq-Pfu полимераз в отношении 16:1, которые вносили методом "горячего старта" после первичной денатурации ДНК-матриц при 94С в течение 4 минут. Далее следовали 27 циклов в режиме: денатурация 30 секунд при 94С и отжиг и элонгация 12 минут при 68С, после которых -завершающая инкубация 10 минут при 72С.
Продукты ПЦР-амплификации разделяли в 1%-ном агарозном геле с бромистым этидием, визуализировали на УФ-трансиллюминаторе. Полученные изображения фиксировали с помощью гельдокументирующей системы Док-принт («Vilber Lourmat Systems Inc.», Франция) и оцифровывали с помощью программы Windig-2.5-Microsoft Excel. ПЦР проводилась на программируемом термоциклере «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва).
Выяснение возможной ассоциации белков и мтДНК в митохондриях in vivo
Известно, что в ядрах клеток гистоны и негистоновые белки участвуют в организации компактной структуры яДНК и обеспечивают, таким образом, ее защиту от воздействия повреждающих агентов. В митохондриях значительное количество копий мтДНК организовано в ДНК-белковые комплексы -нуклеоиды [Garrido et al., 2003; Iborra et al., 2004; Legros et al., 2004], которые ассоциированы с внутренней мембраной этих органелл. В составе митохондриальных нуклеоидов идентифицировано несколько ДНК-связывающих белков. Существующие в литературе сведения о полипептидном составе митохондриальных нуклеоидов очень неоднозначны. По данным разных авторов, в составе белков митохондриальных нуклеоидов млекопитающих обнаружен ряд функционально активных белков. Так, в составе митохондриальных нуклеоидов были обнаружены следующие белки: митохондриальный фактор транскрипции (TFAM), белок, связывающийся с однонитевой ДНК (mtSSB), переносчик адениновых нуклеотидов (ANT), цитохромоксидаза II, ДНК-полимераза у, хеликаза Twinkle [Kaukonen et al., 2000; Spelbrink et al., 2001; Takamatsu et al., 2002; Alam et al., 2003; Garrido et al., 2003; Tyynismaa et al., 2004]. Существующие противоречия в данных разных авторов явно обусловлены использованием различных методов получения митохондриальных нуклеоидов. В ряде исследований в процессе выделения ДНК-белковых комплексов из митохондрий эти органеллы подвергались лизису с использованием высоких концентраций солей (0,5-2,0 М NaCl), различных ионных и неионных детергентов [Van Tuyle and McPherson, 1979; Rickwood, 1981; Mignotte, 1983; Garrido et al., 2003]. Как показали описанные выше результаты экспериментов, большая часть ОБМ не формирует комплексы с ДНК при концентрациях NaCl выше 0,6 М. В ДНК-белковых комплексах, полученных при более жестких условиях выделения, могут присутствовать только прочно связанные с мтДНК белки, тогда как белки, лабильно связанные с ДНК (а их, возможно, большинство), в данных комплексах не выявляются. Мы провели сравнительный анализ состава ОБМ, получаемых непосредственно из цельных митохондрий и из нуклеоидов, выделенных из этих же митохондрий. При этом митохондриальные нуклеоиды получали, как описано в разделе «Материалы и методы», применяя метод Гарридо с соавт. [Garrido et al., 2003], при котором используются относительно мягкие условия лизиса митохондрий. А из полученных нуклеоидов затем экстрагировали основные белки, как и из цельных митохондрий.
Типичные электрофореграммы этих белков представлены на рис. 14. Сравнение элетрофореграмм основных белков нуклеоидов и таковых из цельных митохондрий показывает, что некоторые полипептиды, например, полипептид с мол. массой 57 кДа, не выявляются в составе белков нуклеоида. Также в кислотном экстракте нуклеоидов митохондрий не обнаружены полипептиды с мол. массами 28,1 26,8 и 20,8 кДа. Таким образом, состав белков, изолированных из нуклеоидов митохондрий, отличается от состава основных белков, полученных непосредственно из цельных митохондрий. Вероятно, при лизисе митохондрий происходит диссоциация лабильно связанных с ДНК белков. Вместе с тем, с мтДНК в составе нуклеоидов ассоциировано более 10 полипептидов, что указывает на наличие мтДНК-белковых комплексов в митохондриях.
Таким образом, результаты наших исследований показывают наличие в митохондриях основных белков, образующих стабильные комплексы с ДНК in vitro. Несмотря на то, что в митохондриях не обнаруживаются структуры, напоминающие нуклеосомы ядерного хроматина, возможно, in vivo в этих органеллах основные белки также образуют компактные комплексные структуры с мтДНК, участвуя в организации ее упаковки и регуляции функциональной активности.
Одним из подходов выявления прочносвязанных нуклеопротеидных комплексов в ядерном хроматине является демонстрация формирования ДБС под действием химических и физических агентов. Косвенным доказательством прочной ассоциации белков хроматина с ядерной ДНК является также активация поли(АДФ-рибозил)ирования этих белков при индукции разрывов в ДНК, с которой они комплексированы. Возникновение ДБС и активация поли(АДФ-рибозил)ирования белков оказывает существенное влияние на структурную организацию и на эффективность репарации ДНК в составе хроматина клеток. Хорошо изученным агентом, индуцирующим образование ДБС в хроматине и активацию поли(АДФ-рибозил)ирования белков при возникновении разрывов ДНК в составе хроматина, является ИИ. Мы предположили, что получение данных, свидетельствующих об образовании ДБС и активации поли(АДФ-рибозил)ирования в митохондриях клеток при действии ИИ будет указывать на наличие комплексных структур мтДНК с белками in vivo, напоминающих элементы ядерного хроматина.
Похожие диссертации на Основные белки митохондрий и их роль в сохранении митохондриальной ДНК
