Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 10
1.1. Фосфорилирование белков как основная система передачи сигнала 10
1.1.1. Исторические аспекты белкового фосфорилирования. 10
1.1.2. Протеинкиназы 12
1.1.3. Протеинфосфатазы 18
1.1.4. Кальцинейрин (РР2В) 21
1.2. Обнаружение фосфобелков в митохондриях мозга и регуляция их функции 26
1.2.1. Попытка идентификации белков из различных типов тканей 26
1.2.2. Фосфобелки, обнаруженные в митохондриях мозга 30
1.2.3. Permeab ility tram Шоп роге (Р ТР) 32
1.3. Периферический бензодиазепиновый рецептор 39
1.3.1. Локализация и структура PBR; белки, связанные с PBR. 39
1.3.2. Предполагаемые функции PBR 42
2 Материалы и методы 46
3. Результаты и обсуждение 52
3.1. Фосфорилирование белков в митохондриях мозга крысы в различных функциональных состояниях. 52
3.1.1. Спектр фосфобелкое и относительные уровни включения 32Р 52
3.1.2. Фосфорилирование белков в митхондриях в условиях индукции РТР 54
3.1.3. Влияние физиологических концентраций Са2+ на фосфорилирование белков в митохондриях мозга. 57
3.2. Действие ингибиторов протеинкиназ и протеинфосфатаз на фосфорилирование белков в митохондриях. 60
3.2.1. Влияние кальмидазолия и Н-8 на фосфорилирование белков в митохондриях. 60
3.2.2. Идентификация протеинфосфатазы РР2В в митохондриях мозга. 62
3.2.3. Идентификация протеинкиназ, участвуюгцих в фосфорилировании. 64
3.3. Влияние высокоаффинных лигандов периферического бензодиазепинового рецептора на фосфорилирование белков в митохондриях мозга. 69
3.3.1. Влияние РКП 195 и Ко 5-4864 на фосфорилирование белков в митохондриях мозга и функции митохондрий. 69
3.3.2. Действие РКП 195 в условиях открывания поры. 76
3.3.3. Совместное действие РКП 195, стауроспорина и кальмидазолия в митохондриях мозга. 79
Заключение 82
Выводы 86
- Обнаружение фосфобелков в митохондриях мозга и регуляция их функции
- Периферический бензодиазепиновый рецептор
- Действие ингибиторов протеинкиназ и протеинфосфатаз на фосфорилирование белков в митохондриях.
- Влияние высокоаффинных лигандов периферического бензодиазепинового рецептора на фосфорилирование белков в митохондриях мозга.
Введение к работе
Осуществляемое посредством киназ фосфорилирование мембранных рецепторов, ионных каналов и других факторов является ключевым событием во внутриклеточной сигнализации, ответственной за регуляцию различных ферментных систем и многих клеточных функций. Из многих типов посттрансляционных ковалентных модификаций белков, которые происходят в клетках, относительно немногие обратимы в физиологических условиях. Одним из таких типов обратной модификации является фосфорилирование/дефосфорилирование, которое в большинстве случаев осуществляется по аминокислотным остаткам серина, треонина и тирозина.
Фосфорилирование/дефосфорилирование является почти универсальным механизмом для регулирования функций белков, которые проявляют ферментативную активность, но также и белков, вовлечённых во многие другие биологические процессы. В настоящее время общепринято, что обратимое фосфорилирование белков, наблюдаемое как в клетках прокариот, так и эукариот, контролирует механизмы, регулирующие ряд таких биохимических функций, как распад гликогена и преобразование, веществ в цикле Кребса, транскрипция гена, трансляция белка, мембранный транспорт, передача сигналов в клетке и др. Обратимое фосфорилирование катализируют протеинкиназы и протеинфосфатазы.
Известно, что регуляция функций митохондрий может осуществляться путём фосфорилирования/дефосфорилирования белков, участвующих в процессах преобразования энергии. За последние 20 лет обнаружены и детально изучено фосфорилирование нескольких дегидрогеназ цикла Кребса, локализованных в митохондриальном матриксе, и соответствующая регуляция активности дегидрогеназ ионами Са как вторичными мессенджерами посредством зависимого от протеинкиназ фосфорилирования (Yeaman and Bradford, 1988; Denton and McCormack, 1990; Hansford, 1994; Nichols and Denton, 1995). В митохондриях животных клеток обнаружены и идентифицированы различные сАМР-зависимые и -независимые протеинкиназы. Эндогенные протеинкиназы могут фосфорилировать ряд мембрано- связанных белков в матриксе митохондрий. За исключением хорошо изученной роли протеинкиназ в регуляции функций митохондрий на уровне пируватдегидрогеназы и дегидрогеназы 2-кетокислот с разветвлённой цепью, роль фосфорилирования белков в митохондриях мало изучена. Тем не менее, показано, что белки, фосфорилируемые протеинкиназами, тесно связаны с комплексами дыхательной цепи. Фосфобелок с молекулярной массой (м.м.) 18 кДа идентифицирован как субъединица комплекса I, фосфобелок с м.м. 17 кДа - как субъединица цитохрома-«с»-оксидазы; показана также ассоциация фосфобелка 42 кДа с митохондриальными ферментными комплексами I, III, IV и V (Sardanelli et а!., 1995; Papa et aL, 1996; Steenaart and Shore, 1997). Однако остаётся неясным, как осуществляется регуляция фосфорилирования/дефосфорилирования мембраносвязанных митохондриальных белков и каким образом эта регуляция влияет на функции митохондрий.
В связи с вышеизложенным, представляется актуальным исследование фосфорилирования митохондриальных белков с целью возможного выявления новых фосфопептидов, выяснения их локализации в митохондриях, транспорта ионов кальция и выяснения, каким образом регулируются функции митохондрий.
Целью данного исследования было выявление новых мембраносвязанных фосфопептидов в митохондриях мозга и факторов, регулирующих их фосфорилирование/дефосфорилирование, а также выяснение возможности регуляции функций митохондрий путём фосфорилирования/дефосфорилирования вновь обнаруженных белков. В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
Вывление спектра фосфорилированных полипептидов в митохондриях мозга.
Демонстрация возможности регуляции фосфорилирования/ дефосфорилирования белков в митохондриях ионами Са"+ как вторичным мессенджером.
Исследование корреляции открывания/закрывания Са" индуцированной поры (РТР) с фосфорилированием/ дефосфорилированием найденных белков.
Выявление вида протеинкиназ, фосфорилирующих белки в митохондриях мозга, с помощью ингибиторного анализа. Доказательство участия протеинкиназы А и протеинкиназы С в фосфорилировании белков митохондрий.
Идентификация Са, кальмодулин-зависимой протеинфосфатазы РР2В (кальцинейрина) как протеинфосфатазы, участвующей в дефосфорилировании белков в митохондриях.
Исследование возможной регуляции функционирования РТР посредством периферического бензодиазепинового рецептора (PBR) и фосфорилирования белков в митохондриях мозга.
Научная новизна
Впервые в митохондриях мозга обнаружены фосфорилированные полипептиды с м.м. 17 и 21 кДа, РТР-селективный белок с м.м 43 кДа, а также низкомолекулярный фосфопептид, молекулярная масса которого определена равной 3.5 кДа по элекотофоретической подвижности в полиакриламидном геле. Показано, что фосфорилирование полипептидов модулируется ионами кальция в области физиологических концентраций. Была установлена корреляция между процессами открывания неспецифической Са-зависимой, циклоспорин А-чувствительной поры в митохондриальной мембране и фосфорилированием вновь обнаруженных белков.
Научно-практическая ценность.
Выявление фосфорилированных белков митохондрий мозга и изменение уровня фосфорилирования во время функционирования неселективной митохондриальной поры позволяет предположить существование нового механизма регуляции РТР, открывание которой считается одним из начальных стадий апоптоза и других нейрональных патологий, связанных с дисфункцией митохондрий. Обнаружение PBR-модулиро ванно го фосфорилирования открывает новые возможности в понимании таких процессов как транспорт холестерина и протопорфирина в митохондрии, что является важным для понимания развития патологий, связанных с нарушением этих процессов.
Обнаружение фосфобелков в митохондриях мозга и регуляция их функции
Исследования возможности фосфорилирования белков в митохондриях начались в 50-х - начале 60-х годов XX века. Было показано, что такие белки, как казеин (Burnett and Kennedy, 1954), фосвитин (Rose and Heald, 1961) и некоторые другие цитоплазматические белки (Ливанова, 1962), фосфорилируются при инкубации их с митохондриями печени крыс в присутствии Р. Было сделано предположение, что данные экзогенные белки являются модельным субстратом для митохондриальных протеинкиназ (РК), способных присоединять Р по сериновым остаткам. Позже в митохондриях клеток млекопитающих были обнаружены и идентифицированы различные с АМР-зависимые и сАМР-независимые протеинкиназы, в том числе и особое семейство РК, подобных гистидиновым РК прокариот (Vardanis, 1977; Henrikson and Jergil, 1979; Kitagawa and Racker, 1982; Burgess and Yamada, 1987; Schwoch et ah, 1990; Sarrouilhe and Baudry, 1996). Протеинкиназы были найдены в межмембранном пространстве (Henrikson and Jergil, 1979; Sarrouilhe and Baudry, 1996), во внутренней мембране и матриксе митохондрий (Vardanis, 1977; Henrikson and Jergil, 1979; Kitagawa and Racker, 1982; Schwoch et al., 1990). Было установлено, в частности, что протеинкиназа А (РКА) и ее специфические изоформы локализованы в разных частях митохондрий, включая внутреннюю мембрану. Особые якорные белки связывают цитоплазматическую РКА и доставляют ее в различные мембранные компартменты; таким образом достигается и локализация РКА во внешней митохондриальной мембране (Huang et al., 1999). Следует отметить накапливающиеся данные о существовании таких якорных белков (АКАР) и в самих митохондриях. Кроме того, обнаружена сперминзависимая транслокация казеинкиназы II (CKII) из межмембранного пространства во внутреннюю мембрану митохондрии (Sarrouilhe and Baudry, 1996). Было обнаружено, что эндогенные протеинкиназы митохондрий могут фосфорилировать как мембраносвязанные белки, так и «растворимые» белки, локализованные в матриксе митохондрии (Henrikson and Jergil, 1979; Kitagawa and Racker, 1982; Backer et al.t 1986; Ferrari et al.t 1990; Kitagawa et al, 1997). Показано, что фосфорилирование белков митохондрий могут осуществлять экзогенные протеинкиназы, в частности, каталитическая субъединица цитозольной РК (Technikova-Dobrova et aL, 1994; Bera et at, 1995) и Са-фосфолипид-зависимая PKC (Hashimoto and Yamamura, 1990). В одной из первых работ, посвященных фосфорилированию белков митохондрий эндогенными РК (Linn et al., 1969а; Linn et a/., 1969b), было показано включение радиоактивного фосфора в «растворимый» белок, который был идентифицирован как а-субъединица пируватдегидрогеназы (PDG).
Фосфорилирование а-субъединицы PDG было затем подтверждено в лаборатории Дентона (Denton et aL, 1972; Hughes and Denton, 1976). Также было продемонстрировано фосфорилирование дегидрогеназы 2-оксикислот с разветвленной цепью (Odessey, 1980). В дальнейшем Хенрикссон и Джергил (Henriksson and Jergil, 1979) обнаружили включение 32Р в белок с м.м. 47.5 к Да, локализованный в митопластах митохондрий печени крыс, и в относительно низ комол екулярный материал, представляющий собой, по-видимому гетерогенную фракцию, из наружной мембраны митохондрии. В митохондриях мозга крыс были обнаружены два белка с м.м. 32 кДа и 42_кДа, фосфорилирующиеся при инкубации митохондрий в присутствии [у-32Р]АТР, причем фосфопротеин 32 кДа был предположительно идентифицирован как автофосфорилирующаяся субъединица сукцинил-КоА-синтетазы (Steiner and Smith, 1981). Большое количество фосфобелков (м.м. 66, 57, 48, 40-41, 38.5, 29, 23-22, 17.5, 16, 13, 12.5 кДа) было обнаружено в различных фракциях митохондрий (внешняя, внутренняя мембраны, митохондриальный матрикс) дрожжей (Saccharomyces cerevisae) при инкубации с [32Р]Р; как целых клеток, так и изолированных митохондрий (Muller and Bandlow, 1987; Da Silva et aL, 1991). Однако природа данных фосфопептидов, за исключением белка 41 кДа, являющегося субъединицей пируватдегидрогеназного комплекса, осталась неясной. Бэкер с соавторами (Backer et aL, 1986) показали преимущественное фосфорилирование полипептидов 41 и 36 кДа из митохондрий печени крыс и очень слабое фосфорилирование белков с м.м. 107, 70, 53 и 17 к Да, а в присутствии Са2+-фосфолипид-зависимой протеинкиназы С (РКС) наблюдали дополнительное фосфорилирование белков с м.м. 69, 37 и 17 кДа. Авторы определили белок 47 к Да как а-субъединицу пируватдегидрогеназы, исходя из сходства молекулярных масс и внутримитохондриальной локализации данного белка, а остальные фосфопротеины были неидентифицированы. Более подробное исследование фосфорилирования митохондриальных белков было проведено Феррари и сотр. (Ferrari et al, 1990). Авторы наблюдали фосфорилирование четырех митохондриальных белков (м.м. 50, 47, 44 и 36 кДа) при инкубации интактных митохондрий печени крыс в присутствии [32P]Pj или [у-32Р]АТР. Белок с м.м. 36 кДа фосфорилировался быстрее остальных, и его фосфорилирование проходило в условиях ингибирования синтеза АТР карбоксиатрактилозидом. Этот белок, как считают авторы, является одной из субъединиц сукцинил-КоА-синтетазы ввиду сходности молекулярной массы данного белка с м.м. одной из субъединиц сукцинил-КоА-синтетазы (32 или 38.5 кДа в зависимости от ткани) и неустойчивости включения Р в данный белок при низких значениях рН, подобно соединению Р-фермент, которое образуется как промежуточное соединение в результате реакции: сукцинил-КоА + GDP + Ps о сукцинат + GTP + КоА. Белок с м.м. 44 кДа, по мнению авторов, соответствует а-субъединице пируватдегидрогеназного комплекса. Возможно, полипетид 47 к Да является ct-субъединицей дегидрогеназы 2-оксикислот с разветвленной цепью, а 50 к Да - цитохромом Р-450.
Таким образом, к началу 90х годов усилиями многих исследователей было определено с достаточной степенью достоверности, что РК зависимому фосфорилированию подвержены 3 митохондриальных белка: субъединица 32-36 кДа сукцинил-КоА-синтетазы, субъединица 42 кДа пируватдегидрогеназы и субъединица 48 кДа дегидрогеназы оксикислот с разветвленной цепью. В течение 90х годов в серии работ группы, возглавляемой С. Папа, было показано, что в митохондриях бычьего сердца, кроме вышеуказанных фосфопептидов, еще 4 белка с м.м. 42, 29, 18 и 6.5 кДа подвергаются фосфорилированию, зависимому от cAMP (Technikova- Dobrova et aL, 1993; Technikova-Dobrova et aL, 1994). Ими было показано, что все найденные белки, как и протеинкиназы, катализирующие их фосфорилирование, локализованы во внутренней митохондриальной мембране и обращены в сторону матрикса. Фосфопротеин с м.м. 42 кДа непрочно ассоциирован с несколькими комплексами во внутренней мембране: с NADH-убихинон оксидоредуктазой (комплекс I), убихинон-цитохром-с- зо оксидоредуктазой (III), цитохром-с-оксидазой (IV) и F0F,-ATPa30H (V). Фосфопротеин с м.м. 18 кДа связан с комплексом I и, как было показано в результате определения аминокислотной последовательности, соответствует кодирующейся ядерной DNA субъединице (IP)AQDQ в 18 кДа этого комплекса (Sardanelli et aL, 1995; Sardanelli et aL, 1996; Papa et aL, 1996; Papa et aL, 1999). Одновременно с этими исследованиями было обнаружено, что наиболее интенсивно метится белок мембранных фракций митохондрий, выделенных из тканей крыс, является полипептид 17 кДа, фосфорилирующийся эндогенными протеинкиназами и идентифицированный как кодирующаяся в ядре субъединица IV цитохром-с-оксидазного комплекса (Steenaart and Shore, 1997). Следует отметить работы, проводившиеся одновременно в нашей лаборатории и лаборатории Университета Лунд (Швеция), по изучению фосфорилирования субъединиц АТРазного комплекса. Так, Страгликс и др. выделили из внутренней мембраны митохондрии клубней картофеля фосфопептиды 22 и 28 кДа, которые были затем идентифицированы как фосфорилированные субъединицы F0Fi-ATPa3bi (Struglics et а}., 1998; Struglics et aL, 2000). Фосфопептид 22 кДа является Р5 -субъединицей растительной АТРазы, соответствующей FjS- и FjS-субъединицам АТРазы из животных и бактериальных клеток, соответственно (Moricami et aL, 1992). Фосфопротеин 28 кДа эквивалентен F0b-субъединице АТРазы бактерий и млекопитающих (Hamasur and Glaser, 1992).
Периферический бензодиазепиновый рецептор
Существует два биологически и фармакологически определённых класса бензодиазепшюв: центральный бензодиазепиновый рецептор (CBR), который локализуется в синаптосомальных фракциях, полученных из нейрональных тканей и периферический бензодиазепиновый рецептор (PBR), который широко распространён в периферических тканях центральной нервной системы. Лиганды PBR Ro 5-4864 и РК1П95 связываются с PBR высоким сродством, в то время как для CBR они проявляют низкое сродство. Периферический бензодиазепиновый рецептор является гидрофобным трансмембранным белком (Bernassau et al., 1993) локализованным, главным образом, во внешней мембране митохондрий (Anholt et al., 1986), где он частично ассоциирован с потенциалзависимым анионным каналом и адениннуклеотидным транслокатором, являясь компонентом РТР (McEnery et al., 1992). В центральной нервной системе, астроцитах и микроглие рассматриваются предоминантные клеточные популяции, экспрессирующие PBR (Itzhak et al.y 1993; Park et al, 1996; Vovvinckel et al., 1997). Обычно PBR обнаруживается в ЦНС в низких концентрациях (Doble et al, 1987; Verma and Snyder 1987). Однако, его уровень изменяется в ряде нейропатологических условий (Gavish et ai, 1999), включая припадки и эпилепсию (Basile et al., 1986), гипераммонемию (Ducis et al, 1989), глиому (Black et al., 1990), тиаминовую недостаточность (Leong et al., 1994), болезнь Хантингтона (Messmer and Reynolds, 1998), болезнь АльцгеЙмера (McGeer et al., 1988), обширный склероз (Benavides et al., 1988). Исследования аминокислотной последовательности PBR показали, что он является чрезвычайно гидрофобным белком, содержащим повышенное содержание остатков триптофана и имеющим катионный характер (изоэлектрическая точка около 9.6). Компьютерный анализ показал наличие пяти гидрофобных доменов в составе PBR, которые потенциально способны пронизывать липидный бислой мембраны. Радиоактивные методы анализа показали неравномерное распределение PBR в анализируемых тканях. Железистые и секреторные ткани, такие как шишковидная железа, надпочечники, обонятельный эпителий, эпидерма, богаты PBR, в тканях почек и в области миокарда сердца наблюдается средний уровень PBR (Anholt et al, 1985), а в тканях печени и мозга уровни содержания PBR относительно низки. Распределение белка в тканях неравномерно в пределах данного органа. Так, в надпочечниках мозговой слой фактически лишён PBR, а в корковом слое содержание его высоко (Anholt et al., 1986). PBR экспрессирован в периферических лейкоцитах крови человека, в основном в моноцитах и полиморфноядерных клетках (Canat et al., 1992). Фармакологические исследования продемонстрировали, что PBR локализован во внешней мембране митохондрии (Basile and Skolnick, 1986; Anholt et al., 1986). Несмотря на установленную локализацию PBR в митохондриальной внешней мембране, существует доказательство того, что он присутствует в других отделах клетки.
Он обнаружен в плазматических мембранах некоторых клеток, главным образом в эритроцитах и ПМЯЛ, которые не имеют митохондрий (Olson et al., 1988, O Berine et ah, 1990). PBR также локализуется в ядре и вокруг ядра в биоптатах раковых клеток молочной железы человека (Hardwick et al., 1999). PBR является гидрофобным белком с м.м, 18 кДа, состоит из 169 аминокислот и богат триптофаном. Он также имеет положительный заряд и pi 9.6. cDNA, кодирующая PBR, клонирована из различных видов, включая грызунов (Sprengel et я/., 1989; Gamier et aL, 1994), крупный рогатый скот (Parola et ah, 1991) и человека (Riond et ai, 1991), и показывает 80% гомологии в последовательности оснований. PBR может образовывать комплексы с потенциал- зависимым анионным каналом в 32 к Да (VDAC) и адениннуклеотидтранслоказой 30 кДа (МсЕпегу et al., 1992) во внешней митохондриальной мембране (Anholt et al., 1986). Обнаружены два дополнительных белка, которые связываются с PBR. Белок с м.м. 10 кДа был совместно иммунопреципитирован с PBR и локализован в митохондриальных фракциях, но пока не идентифицирован (Blahos et al., 1995). Другой предполагаемый белок является PBR-связанным белком-1 (PRAX-1), который был открыт в дрожжах (Galiegue et al., 2003). PRAX-1 является белком (240 кДа), который локализуется в цитоплазме и связан с PBR в митохондриях. PRAX-1 связан с PBR стехиометрически в соотношении 1:2. Его роль не определена, но считается, что он участвует в подборе дополнительных мишеней для PBR с целью модулировать его функции. Некоторые предполагаемые функции для PBR охарактеризованы, но его физиологическая роль остаётся не определенной. Лучше всего охарактеризованы функции PBR в биосинтезе стероидов (Papandopoulos, 1993; Krueger 1995). Он может также участвовать в митохондриальном дыхательном контроле и апоптозе (Hirsch et al., 1989), ингибировании пролиферации (Wang et al., 1984), моноцитарной хемотаксии (Ruffe/ al, 1985), увеличении прото-онкогенной экспрессии, липидном метаболизме, кальциевом гомеостазе и промежуточном метаболизме (Anholt 1986; Krueger 1995; Gavish et al, 1999). За последние годы было установлено, что очищенный PBR колокализован с VDAC и ANT и может быть компонентом РТР (McEnery et al., 1992; Kinnally et al., 1996; Zorov 1996). Существует доказательство того, что PBR участвует в транспорте холестерина в митохондриях и в тканях печени при стероидогенезе (Krueger et ah, 1990). Также была показана роль PBR в митохондриальной защите от свободно-радикального повреждения (Carayon et al,, 1995) и в транспорте белков (Wright et al,, 1995). Одной из наиболее охарактеризованных функций PBR является его роль в биосинтезе стероидов. В ряде исследований было установлено, что клетки, принимающие участие в стероидогенезе, характеризовались наиболее высокими плотностями участков связывания лигандов PBR. Относительное сродство ряда бензодиазепиновых лигандов к PBR коррелировали с их потентностью в стимуляции стероидного биосинтеза (Anholt et al., 1986, DeSouza et al., 1985). Механизм стимуляции стероид ore неза под действием лигандов PBR представляет собой значительный интерес. Одна из начальных стадий биосинтеза стероидов - превращение холестерина в прегненолон. Эта реакция происходит на внутренней митохондриальной мембране, и катализируется цитохромом P-450sec. Эта реакция не является скоро сть- лимитирующей в биосинтезе стероидов. С другой стороны, скорость транспорта холестерина на внутреннюю мембрану митохондрий, по- видимому, определяет скорость синтеза адренодоксина и адренодоксинредуктазы, являющихся частью электрон-транспортной цепи. Анализ процесса превращения холестерина в прегненолон с использованием бензодиазепиновых и изохинолин-карбоксамидных соединений показал, что лиганды PBR ускоряли внутримитохондриальну транслокацию холестерина с внешней на внутреннюю мембрану (Krueger, Papadopoulos, 1990). Эти результаты позволили предположить, что PBR участвует в транспорте холестерина внутри митохондрии, и этот транспорт, вероятно, происходит в месте соприкосновения двух мембран (как и в случае многих других митохондриальных транспортных процессов). Основной функцией митохондрий является обеспечение клетки энергией. Несколько лабораторий пытались определить, насколько лиганды PBR влияют на окислительное фосфорилирование. Было показано, что РКП 195 и Ro 5-4864 в наномолярных концентрациях обладали сходным ингибирующим действием на дыхание митохондрий (Hirsh et aL, 1989). Эти исследователи установили, что активность соединений, воздействующих на митохондриальное дыхание, коррелировала с их сродством к PBR, В частности было установлено, что эффект проявляется в основном в результате снижения скорости потребления кислорода в состоянии дыхания III и возрастании скорости потребления кислорода в состоянии дыхания IV. Величина этого эффекта в митохондриях, выделенных из различных тканей, варьировала в зависимости от уровней PBR, характеризрванных для той или иной ткани. Эти результаты указывают на то, что биологический эффект PBR может проявляться на стадии образования АТР в митохондрии.
Действие ингибиторов протеинкиназ и протеинфосфатаз на фосфорилирование белков в митохондриях.
Кальмидозолий (CmZ) — липофильный антагонист по отношению к кальмодулин-подобным белкам, обратимо связывается с кальмодулином (СаМ). Главным его свойством является то, что его можно использовать как антикальмодулиновый реагент. CmZ имеет два центра связывания на СаМ и тропонине С (ТпС). Было показано, что циклоспорин А ингибирует как открывание РТР, так и дефосфорилирование некоторых фосфопептидов в митохондриях мозга, что указывает на возможное участие в процессе протеинфосфатазы (РР2В), являющейся кальмодулин-связывающим белком. Поэтому в своих исследованиях мы проверили, как CmZ влияет на функции митохондрий и на фосфорилирование белков в митохондриях мозга. . Мы проверили действие CmZ и ингибитора сАМР-зависимой протеинкиназы Н-8 в присутствии Са на мембранный потенциал и на включение Р в пептиды 3.5 и 17 кДа. Аликвоты суспензии митохондрий были взяты для фосфорилирования [у-32Р]АТР в точках 1-4, как отмечено на рисунке 4. Добавление CmZ к митохондриям, нагруженным С а , вызвало быструю деполяризацию внутренней мембраны. В этих условиях наблюдалось 2-3-кратное усиление включения 32Р в пептиды 3.5 и 17 кДа. При добавлении Н-8 имело место сильное ингибирование фосфорилирования пептида 17 кДа, показывающее возможное участие сАМР-зависимой протеинкиназы в фосфорилировании белка 17 к Да. На рисунке 5 отображены субъединицы кальцинейрина (каталитическая 60 кДа и регуляторная 19 кДа). Аликвоты митохондрий, внешней и внутренней мембран подвергались разделению в SDS-ПААГ с последующим переносом белков на мембрану. Анализ проводился методом Вестерн-блоттинга с использованием антител к обеим субъединицам кальцинейрина. Как уже было сказано, CysA в комплексе с циклофилином (CysA-связывающий иммунофилин) является специфическим ингибитором протеинфосфатазы РР2В (кальцинейрина) и вследствие устойчивого связывания с циклофилином блокирует РТР. Для проведения иммунохимического анализа использовали поликлональные коммерческие антитела как к каталитической субъединице (субъединица А с м.м. 60 кДа), так и к регуляторной субъединице (субъединица Б с м.м. 19 кДа). Обе субъединицы кальцинеирина имеются во внешней и во внутренней мембранах митохондрий. Обнаруженные в препарате внутренней мембраны полосы в области м.м. 43-45 кДа, по-видимому, принадлежат каталитической субъединице кальцинеирина, поскольку среда солюбилизации митохондрий после электрофореза содержала недостаточные концентрации ингибиторов протеолиза.
В литературе описаны возможность ограниченного протеолиза кальцинеирина и продукты такого протеолиза с м.м. 40-45 кДа. (Manalan and Klee, 1983). Полученные результаты показывают присутствие кальцинеирина в митохондриях мозга, и можно предположить, что эта протеинфосфатаза принимает участие в регуляции функций митохондрий, в частности в феномене возникновения РТР. 3.2,3. Идентификация протеинкиназ, участвующих в фосфорилировании. Поскольку нами была обнаружена взаимосвязь индукции РТР с изменением уровней фосфорилирования/дефосфорилирования исследуемых белков и локализацией пула кальцинеирина в митохондриях, было логичным проведения экспериментов по изучению эффекта ингибиторов протеинкиназы (РК) на фосфорилирование белков митохондрий в условиях индукции РТР. На рисунке 6 представлена авторадиограмма белков после разделения методом электрофореза в ПААГ меченых митохондрий в условиях индукции РТР в присутствии специфического ингибитора протеинкиназы А Н-89. Из рисунка видно, что в присутствии ингибитора РКА Н-89 (100 нМ) происходит сильное снижение уровней фосфорилирования в полипептидах с молекулярными массами 17 и 43 кДа и незначительное снижение фосфорилирования в 3.5 кДа пептиде. Существуют литературные данные по выявлению белков митохондрий фосфорилированных посредством РКА. Известно, что во внутренней мембране митохондрий, выделенных из бычьего сердца имеются 42 и 29 кДа фосфобелки, фосфорилирование которых регулируется сАМР-зависимой РКА (Technikova-Dobrova et al., 1993). 18 к Да пептид, обнаруженный в митохондриях надпочечников, выделенных из крупного рогатого скота и крысы и названный митохондриальным бензодиазепиновым рецепторным (MBR) белком также подвержен фосфорилированию посредством РКА (Whalin et al., 1994). Данные представленные авторами показали, что MBR является субстратом РКА. На основе данных полученных в нашей лаборатории ряд белков подвержены фосфорилированию и в зависимости от изменения уровней включения 32Р можно предположить, что ряд белков являются мишенями для РКА. На основе полученных результатов мы сделали заключение о том, что в фосфорилировании пептидов с м.м, 3.5, 17, 43 кДа принимает участие РКА. РКС является Са + и фосфолипид — зависимой протеинкиназой. Из литературных данных известно, что митохондриальные мембраны содержат белки, которые являются мишенями РКС (Nishizuka, 1984). Чтобы выявить принимает ли участие в фосфорилировании митохондриальных белков в условиях индукции РТР Са2+-зависимая РКС мы использовали ингибиторы этой РКС стауроспорин, Go 6976 и GF 109203 X. Для этого суспензию митохондрий инкубировали в присутствии [у-32Р]АТР, затем разделяли в SDS-ПААГ и экспонировали на рентгеновской пленке. На рисунке 7 показано изменение уровней фосфорилирования исследуемых полипептидов в присутствии 1 цМ стауроспорина. В присутствии этого ингибитора при микромолярной (1 цМ) концентрации наблюдается заметное уменьшение включения меченого фосфата в полипептиды с м.м. 43 кДа и 3.5 кДа и очень сильное уменьшение включения в полипептид с м.м. 17 кДа, что указывает на возможное участие РКС в процессе фосфорилирования. Беккер и сотр.
Обнаружили, что фосфорилирование некоторых пептидов в митохондриях печени крыс с м.м. 67, 37 и 17 кДа в присутствии РКС было Са2+-зависимым и повышалось при увеличении концентрации Са2+ до 100 цМ (Backer et al., 1986). Эти результаты показали возможность существования специфических митохондриальных белков, которые могут быть МИШЄЕІЯМИ для фосфорилирования посредством РКС. В наших экспериментах наблюдается фосфорилирования исследуемых пептидов. Для выявление вида РКС, участвующих в фосфорилировании исследуемых нами белков, мы проверили влияние специфических ингибиторов РКС Go 6976 (ингибитора Са-зависимой РКС) и GF 109203 X (ингибитор РКС смешанного типа) при той же концентрации. На рисунке 8 представлена авторадиограмма меченых белков после разделения в ПААГ в условиях индукции РТР (1) и в присутствии специфических ингибиторов РКС (2-Go 6976, 3- GF 109203 X). Как видно из рисунка, наблюдается аналогичный эффект ингибиторов как и в случае со стауроспорином. Полученные данные позволяют предположить, что в фосфорилировании обнаруженных белков принимает участие РКС. Как следует из литературных данных периферический бензодиазепиновый рецептор (PBR) локализован в митохондриях во внешней мембране. Имеются данные, полученные методом patch clamp по исследованию действия лигандов PBR на проводимость и активность каналов внутренней мембраны митопластов, указывающие на возможное присутствие PBR во внутренней мембране митохондрий. При очистке рецептора с целью выяснения компонента, связывающего высокоаффинные лиганды PBR, было обнаружено, что он кол окал изуется с адениннуклеотидтранслоказой (ANT) и потенциал-зависимым анионным каналом (VDAC) — компонентами, формирующими РТР комплекс. Известно, что белки вышеупомянутого комплекса VDAC-PBR есть белки, которые могут фосфор илироваться протеинкиназой А. Эффект лигандов PBR (РКШ95, Ro 5-4864, PPIX и холестерина) на фосфорилирование этих белков или других белков в митохондриях до настоящего времени не изучался, поэтому рассмотрение этой проблемы мы посчитали целесообразным. В нашей работе мы исследовали два высокоаффинных ли ганда PBR: РКП 195, который считается антагонистом PBR, и Ro 5-4864 — агонист рецептора.
Влияние высокоаффинных лигандов периферического бензодиазепинового рецептора на фосфорилирование белков в митохондриях мозга.
Как следует из литературных данных периферический бензодиазепиновый рецептор (PBR) локализован в митохондриях во внешней мембране. Имеются данные, полученные методом patch clamp по исследованию действия лигандов PBR на проводимость и активность каналов внутренней мембраны митопластов, указывающие на возможное присутствие PBR во внутренней мембране митохондрий. При очистке рецептора с целью выяснения компонента, связывающего высокоаффинные лиганды PBR, было обнаружено, что он кол окал изуется с адениннуклеотидтранслоказой (ANT) и потенциал-зависимым анионным каналом (VDAC) — компонентами, формирующими РТР комплекс. Известно, что белки вышеупомянутого комплекса VDAC-PBR есть белки, которые могут фосфор илироваться протеинкиназой А. Эффект лигандов PBR (РКШ95, Ro 5-4864, PPIX и холестерина) на фосфорилирование этих белков или других белков в митохондриях до настоящего времени не изучался, поэтому рассмотрение этой проблемы мы посчитали целесообразным. В нашей работе мы исследовали два высокоаффинных ли ганда PBR: РКП 195, который считается антагонистом PBR, и Ro 5-4864 — агонист рецептора. Схема постановки эксперимента была следующей. Митохондрии мозга, преинкубированные в присутствии лигандов в течение 3 минут при комнатной температуре, подвергались фосфорилированию в присутствии [у- Р]АТР. На рисунке 9А представлена авторадиограмма фосфорилированных белков контрольных митохондрий мозга и митохондрий, преинкубированных с РКП 195. Диаграмма 9Б отражает изменение уровней фосфорилирования белков при различных концентрациях РК11195. На авторадиограмме видно, что РКП 195 обладает способностью увеличивать уровень фосфорилирования полипептидов с м.м. 17 и 3.5 кДа. Рассматривая влияние различных концентраций данного лиганда, можно сказать, что уровень фосфорилирования изучаемых белков повышается при увеличении концентрации РКП 195 от 10 нМ до 100 нМ, а дальнейшее повышение концентрации лиганда приводит к ослаблению включения Р в полипептиды, которое, возможно, является следствием неспецифического действия РК11195 или стимуляции открывания РТР. Тем не менее, уровни фосфорилирования отмеченных полипептидов под действием микромолярных концентраций РК 11195 были выше, чем в контрольном образце.
Кроме этого, мы исследовали влияние РК1П95 на функции митохондрий мозга, такие как дыхание и транспорт кальция, и на мембранный потенциал. На Рис. 11 представлены изменения митохондриальной трансмембранной разности потенциалов при добавлении кальция к суспензии изолированных митохондрий мозга в присутствии РКП 195. Как видно из Рис. 11 (кривая 2-А), скорость входа Са" в митохондрии (первое добавление) в отсутствие лиганда PBR составляла 0,54 нмоль с" (мг белка)" . На кривой 2-Б показана скорость входа Са в присутствии 25 нМ РК11195. Скорость входа в этом случае определена как 0,78 нмоль с_1 (мг белка)"1. Полученные данные демонстрируют, что антагонист PBR РКП 195 увеличивает скорость входа Са2+ в митохондрии мозга. Полученные данные показывают, что Ro 5-4864 в наномолярных концентрациях (0.01 цМ и 0.1 цМ) не оказывает влияния на уровень фосфорилирования, как это наблюдается в случае с РКП 195. Однако 1дМ-50цМ концентрации Ro 5-4864 стимулируют фосфорилирование пептидов с м.м. 17 и 3.5 кДа. Суммируя результаты, можно заключить, что как РК11195, так и Ro 5-4864 усиливают фосфорилирование 17 и 3.5 кДа пептидов, хотя их действие наблюдается в различных концентрационных пределах. РКП 195 более эффективен в наномолярных концентрациях, в то время как Ro 5-4864 проявляет своё действие в области микромолярных концентраций. Действие лигандов PBR на фосфорилирование белков в изолированных митохондриях до сих пор не изучалось, и в литературе данные по этому вопросу отсутствуют. Однако существуют другие литературные данные, указывающие на взаимодействие PBR с протеинкиназами. Так, было показано, что PBR-связывающий белок (РАР-7), который сильно экспрессируется в различных типах клеток, включая нейрональные и глиальные клетки, связан с митохондриями. Обнаружено, что РАР-7 взаимодействует с PBR и PKA-RIa, локализованным в цитозоле. Когда РАР-7 ассоциирован с митохондриями, он может функционировать как мишень для РКА в митохондриях, богатых PBR, работая как PKA-RIa якорный белок (Li Н et al., 2001; Lui et ai, 2003). Кроме того, была обнаружена взаимосвязь PBR с РКВ (протеинкиназа В) и то, что лиганды PBR в наномолярных концентрациях индуцируют апоптоз в звездчатых клетках печени; сообщалось о дефосфорилировании BAD и протеинкиназы B/AKt при апоптозе (Fischer et аІ.„ 2001). Более того, РКП 195, как было обнаружено, фосфорилирование р38 МАРК, которое зависело от времени и от дозы инкубации и, следовательно, активация р38 МАРК пути являлось необходимой для индукции апоптоза. Действительно, клеточный цикл тормозится РК11195 в пищеварительных клетках (Sutter et al, 2003). На Рис. 13 представлены данные, полученные в аналогичных условиях, по исследованию влияние лиганда Ro 5-4864. Как видно из кривых 2-А и 2-В, скорость транспорта Са2+ в митохондриях, инкубируемых в среде с лигандом Ro 5-4864, существенно ниже скорости, наблюдаемой в контрольном образце (примерно на 45 %). На основании анализа данных по изменению скорости транспорта Са2+ и величины А\/м можно сделать вывод о том, что Ro 5-4864 в высоких концентрациях (50 иМ) ингибирует процесс аккумуляции ионов кальция. Оценивая количество Са , которое поглощается митохондриями до момента необратимого изменения проницаемости внутренней мембраны, можно определить критическое количество Са2+, вызывающее открывание РТР. Как видно из Рис. 13-В, индукция выброса ионов кальция и падение мембранного потенциала в митохондриях имели место уже после добавления 100 пМ Са2+, что говорит об уменьшении лигандом Ro 5-4864 пороговой концентрации кальция, приводящего к открыванию неселективной поры. 3.3.2 Действие РКП 195 в условиях открывания поры. PBR связан с VDAC и ANT, и поэтому считается, что он является компонентом комплекса РТР в митохондриях (Gavish et а/.,1999; Casellas et ah, 2002; McEnery et al., 1992). Поэтому мы выясняли, может ли РКП 195 воздействовать на фосфорилирование белков в митохондриях мозга в условиях возникновения РТР.
Открывание РТР индуцируется добавлением порогового количества Са , как мы описывали ранее. На рисунке 14А показана авторадиограмма фосфорилированных белков митохондрий мозга после их нагрузки кальцием и митохондрий, обработанных 100 нМ РК11195. Как показано на рисунке, после пороговой нагрузки Са степень фосфорилирования пептида 3.5 кДа уменьшалось, подобно тому, как это наблюдали при изучении низкомолекулярного пептида в митохондриях печени (Azarashvily et al., 2000). Однако, в митохондриях мозга был обнаружен высокий уровень фосфорилирования пептида с м.м. 43 кДа. Было выявлено, что в присутствии 100 нМ РКП 195 стимулируется фосфорилирование пептидов с м.м. 17 и 3.5 кДа в условиях РТР, как это наблюдали при фосфорилировании белка в интактных митохондриях в присутствии РК11195. Вместе с тем, в условиях открытой поры наномолярные концентрации РКП 195 значительно уменьшают уровень фосфорилирования РТР-специфичного пептида 43 кДа. Количественное влияние различных концентраций РКП 195 отражено на рисунке 14Б. Обе концентрации РК11195 (10 нМ и 100 нМ) незначительно воздействуют на фосфорилирование полипептидов 17 и 3.5 кДа, но уровень фосфорилирования полипептида 43 кДа снижается значительно — приблизительно в 2-3 раза. Недавно мы показали, что фосфорилирование/дефосфорилирование некоторых белков в митохондриях мозга изменялось при различных функциональных состояниях митохондрий, и предположили, что открывание РТР регулируется протеинкиназной и фосфатазной активностью. Каким образом PBR способствует фосфорилированию митохондриальных белков, ещё не ясно.
