Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время накоплено большое количество информации как об этапах филогенеза эритропоэза, так и о становлении эритропоэза в онтогенезе человека и животных. Кроме того, широкий спекр исследований протекания эритропоэза в составе эритробластических островков (ЭО) был проведён различными учёными (Захаров Ю.М., Рассохин А.Г.,2002; Захаров Ю.М. и др. 1988; Bessis М, Breton-Gorius J., 1956; Yoffey J., Yaffe P, 1980; Рассохин А.Г., 1997).
Большое количество работ посвящено выявлению молекул мембран эритроидных клеток и макрофагов, участвующих в формировании эритробластических островков и регуляции эритропоэза (Lee S.H., 1991; Sadahira Y., et al., 1988; Sadahira Y. et al., 1995; Rosemblatt M. et al., 1991). Однако в настоящее время нет доступной и простой в выполнении методики, позволяющей оценить изменения адгезивных свойств ЭО как целостных образований, остаются не изученными адгезивные свойства ЭО различных классов зрелости.
Многочисленные работы посвящены исследованию широкого диапазона показателей эритрона при стимулированном и подавленном эритропоэзе (Пушкарев В.П. с соавт.. 1991; Крестьянинова О.Г., 1994; Рассохин А.Г., 1997; Тишевская Н.В. с соавт.. 1998), но до сих пор не было изучено изменение адгезивных свойств ЭО при ингибиции и стимуляции эритропоэза. Кроме того, в литературе не представлены данные об изменениях адгезивных свойств эритроидных клеток и резидентных макрофагов костного мозга при различных состояниях эритропоэза. Отсутствуют сведения также о характере ответа островков различных классов зрелости на факторы, приводящие к стимуляции эритропоэза и его ингибированию.
В настоящее время интенсивно изучается роль и механизмы адгезивных взаимодействий клеток друг с другом и с молекулами экстрацеллюлярного матрикса (Земсков В.И, Субботин СМ., 1990: Пальцев М.А , Иванов А.А., 1995; Коо L.Y et al.'. 2002; Koblinski J.E. et al., 2005). Несмотря на широкое и всестороннее исследование в мире механизмов адгезии и факторов, влияющих на адгезивные свойства клеток, до сих пор не проводилось изучение влияния таких
ключевых факторов, как свойства поверхности субстрата, наличие в среде, из которой происходит адгезия Са"+ и альбумина на адгезивные свойства эритробластических островков. Кроме того, не изучались адгезивные свойства ЭО различных классов зрелости при воздействии вышеперечисленных факторов
В работах ряда исследователей (Коо L.Y. el al, 2002; Арефьева ТИ., 1998; Elliot M.J. el al.,1991; Spagnuolo P.J. et al., 1988; Galbraith C.G., M.P. Sheetz, 1997; Fleit, S. A. et al.,1984; Francis, G.W. el al., 1987) были предложены методы изучения адгезивных свойств клеток и приспособления для оценки силы адгезионного взаимодействия клеток с субстратом. Однако эти методики либо не обладают достаточной точностью, либо сложны в использовании, либо для деадгезирования клеток от субстрата прикладываются воздействия, не являющиеся естественными для клеток, либо основаны на применении оригинальных и дорогостоящих приборов. Поэтому представляется актуальным внедрение в практику метода, обладающего оптимальным соотношением между простотой его применения и точностью производимой им оценки адгезивных свойств клеток и эритробластических островков. Кроме того, воздействия, прикладываемые к клеткам, должны в данной методике быть приближены к тем воздействиям, которые испытывают клетки в организме.
Таким образом, отсутствие методики, позволяющей оценить адгезивные свойства ЭО, а также отсутствие информации об адгезивных свойствах эритробластических островков различных классов зрелости, об изменении способности их адгезироваться к субстрату при различных состояниях эритропоэза, о факторах, влияющих на адгезивные свойства ЭО составляют актуальность настоящего исследования.
Цель исследования
Изучение адгезивных свойств эритробластических островков при нормальном, стимулированном и угнетённом эритропоэзе.
Задачи исследования :
оценить адгезию к стеклу эритробластических островков различных классов зрелости иитактных самцов и самок крыс;
оценить изменения адгезивных свойств эритробластических островков различных классов зрелости при стимуляции и угнетении эритропоэза;
оценить временные параметры проявления адгезивных свойств эритробластических островков различных классов зрелости и их устойчивость к гидродинамическому воздействию;
оценить влияние свойств субстрата и некоторых компонентов сред инкубации на адгезивные свойства эритробластических островков;
выявить влияние блокатора Са + " каналов L-типа (верапамила) на адгезивные свойства ЭО различных классов зрелости.
Научная новизна работы
В данной работе впервые предложена методика оценки адгезивных свойств ЭО различных классов зрелости, основанная на влиянии гидродинамического давления на ЭО костного мозга. Результаты проведенного исследования позволили впервые оценить адгезивные свойства ЭО различных классов зрелости у интактных животных, а также выявить наличие более низкой адгезионной способности ЭО самок по сравнению с ЭО самцов. Кроме того, впервые были оценены временные параметры проявления адгезивных свойств эригробластических островков различных классов зрелости. Так, в работе было показано, что эритробластические островки пролиферирующих классов зрелости адгезируются к стеклу быстрее, чем островки созревающих классов зрелости.
Впервые было показано, что как при угнетении эритропоэза, так и при его стимуляции происходит понижение адгезионной способности ЭО. Кроме того, результаты исследования свидетельствуют о более выраженном снижении адгезионной способности островков созревающих классов зрелости по сравнению с островками пролиферирующих классов.
Научную новизну работы также определяют результаты, свидетельствующие о влиянии различной концентрации альбумина в
среде инкубации ЭО на их адгезивные свойства. Так, содержание в среде инкубации ЗЗг/л альбумина человека сопровождается максимальным количеством адгезированных ЭО на 1 см" препаратов, в то время как повышение концентрации альбумина приводит к понижению адгезионной способности островков. Кроме того, в работе было выявлено, что островки лучше адгезируются к поверхности полистирола культуральных чашек Петри, чем к поверхности стекла.
Впервые была оценена адгезия ЭО к стеклу в присутствии в среде инкубации ЭО различных доз блокаторов Са2+ -каналов L-типа (верапамила), а также впервые выявлено влияние различных доз верапамила на адгезию островков различных классов зрелости к стеклу. В работе было выявлено, что верапамил снижает адгезионную способность островков.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработанная методика, основывающаяся на гидродинамическом воздействии жидкости на клетки и ЭО, адгезированные к поверхности препарата, позволит оценивать в экспериментальной практике адгезивные свойства клеток. Данная методика может быть использована для оценки адгезивных свойств различных клеток не только в экспериментальной, но и в клинической практике.
Результаты исследования адгезивных свойств ЭО различных классов зрелости вносят вклад в понимание функциональной гетерогенности островков, находящихся на различных стадиях созревания, которые определяются функциональными особенностями как центрального макрофага эритробластических островков, так и окружающими его эритроидными клетками.
Выявленные особенности адгезивных свойств ЭО различных классов зрелости расширяют наши представления о протекании эритропоэза в составе ЭО. Кроме того, выявленные изменения в адгезивных свойствах ЭО при различных состояниях эритропоэза вносят вклад в понимание адаптационных механизмов, которые запускаются в ответ на стимуляцию или подавление эритропоэза.
Выявленное влияние верапамила на адгезивные свойства ЭО расширяет представление о механизмах действия этого препарата и свидетельствует, таким образом, о возможном влиянии его на
эритропоэз, протекающий в островках. Исследования, связанные с влиянием различного состава сред инкубации и субстрата на адгезивные свойства ЭО, вносят вклад в понимание тех оптимальных условий, которые необходимо создавать для культивирования клеток in vitro в эксперименте.
Таким образом, данные о выявленных особенностях адгезивных свойств различных классов зрелости интактных животных, самцов и самок крыс, а также выявленных изменениях адгезивных свойств ЭО при различных воздействиях in vitro и различных состояниях эритропоэза определяют направление дальнейшего исследования.
Основные положения, выносимые на защиту
Эритробластические островки пролиферирующих классов зрелости обладают более высокой адгезионной способностью к субстрату по сравнению с эритробластическими островками созревающих классов зрелости в условиях угнетённого и стимулированного эритропоэза.
Адгезия эритробластических островков является Сач -зависимым процессом, на который влияют свойства субстрата, к которому адгезируются островки, и наличие в среде инкубации альбумина.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты исследования используются на практических занятиях и лекционном курсе на кафедрах нормальной физиологии ЧелГМА, Разработанный метод определения адгезивных свойств ЭО и клеток, основанный на влиянии гидродинамического давления жидкости на адгезивные препараты, используется в экспериментальной практике работы ОГУЗ ЦОСМП «Челябинский государственный институт лазерной хирургии/).
Апробация работы и публикации
Основные материалы диссертационной работы представлены на Второй итоговой научно-практической конференции молодых ученых, посвященной шестидесятилетию образования Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2004);
Юбилейной научной общероссийской конференции, посвященной десятилетию Российской академии естествознания, с международным участием (Москва, 2005); Шестой Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» в Российском университете Дружбы народов (Москва, 2005); заочной электронной конференции РАЕ (v.ww ) «Фундаментальные исследования», 15-20 февраля 2006г.; Четвёртой итоговой конференции молодых учёных (Челябинск, 2006).
По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них одна работа опубликована в издании, входящем в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.
Объём и структура работы
Работа изложена на 193 страницах текста, включает 30 таблиц, 9 иллюстраций, состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы, практических рекомендаций. Список литературы включает 366 источников (отечественных-82, иностранных-284).
