Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ 1 Митохондрии в регуляции внутриклеточного кальция
1.1 Общие принципы и особенности транспорта Са2+в митохондриях 31
1.1.1 Колебания ионных потоков в митохондриях 31
1.1.2 Математическая модель колебаний ионных потоков в митохондриях 32
1.2 Возбудимость внутренней мембраны митохондрий ионами Са2 36
1.2.1 Возбудимость внутренней мембраны митохондрий ионами Са2+ 36
1.2.2 Волны сокращения-набухания в неперемешиваемом слое митохондрий 39
1.3 Участие митохондрий во внутриклеточной СА2+ сигнализации 45
1.3.1 Участие митохондрий в регуляции концентрации Са2+ в клетках 45
1.3.2 Участие митохондрии в синхронизации Са2+ волн в клетке. 47
13.3 Зависимость амплитуды Са2+ волны от состояния митохондрий 49
13.4 Восстановление амплитуды и синхронности Са2* волн 49
Заключение 51
ЧАСТЬ 2 Митохондрии в механизме ишемического повреждения
2.1 Влияние диазоксида и пинацидила на функции митохондрий 52
2..1.1 Деполяризующее действие активаторов КАТФ каналов на митохондрии 52
2.1.2 Действие диазоксида и пинацидила на дыхание митохондрий 54
2.1.3 Действие диазоксида и пинацидила на синтез АТФ в митохондриях 56
2.2 Влияние диазоксида и пинацидила на транспорт Са2 " в митохондриях 57
2.2.1 Диазоксид и пинацидил подавляют накопления Са2+ в митохондриях 57
2.2.2 Диазоксид и пинацидил усиливают выход ионов Са2+ из митохондрий 59
2.2.3 Действие диазоксида и пинацидила на Са2"-зависимое открывание поры 61
2.2.4 Зависимость действия диазоксида и пинацидила от ионов hCe среде 62
2.2.5 АТФ и/или АДФ ингибируют эффект диазоксида и пинацидила 64
2.3 Влияние диазоксида и пинацидила на митохондриальныймембранный потенциал и содержание Са2+ в кардиомиоцитах 65
2.3.1 Диазоксид и пинацидил деполяризуют митохондрии в кардиомиоцитах
2.3.2 Диазоксид и пинацидил снижают митохондриальный Са2+ в клетках 67
2.4 Протонофорный механизм действия активаторов КАТФ каналов 68
2.4.1 Общие закономерности действия диазоксида, пинацидила и 2,4-ДНФ на митохондриальные дыхание, мембранный потенциал и синтез АТФ 69
2.4.2 Диазоксид, пинацидил и ДНФ переносят f-Ґ через гидрофобную фазу 72
2.4.3 Разобщение митохондрий уменьшает ишемическое повреждение 74
Заключение 77
ЧАСТЬ 3 Роль пориновых каналов в физиологии митохондрий
3.1 Окисление этанола закрывает пориновые каналы в внешней мембране митохондрий печени
3.1.1 Действие этанола и продуктов его окисления на основные функции митохондрий
3.1.2 "Пермеабилизация" клеточной и внешней митохондриальной мембран
3.1.3 Дигитонин обращает эффект ингибирования пориновых каналов
3.1.4 Окисление этанола закрывает пориновые каналы
3.1.5 Оценка пориновых каналов с помощью конфокальной микроскопии
3.1.6 Прохождение флуоресцентных молекул 3 кДа декстрана в межмембранное пространство
3.2 Окисление этанола подавляет синтез мочевины в первичной культуре гепатоцитов крысы 95
3.2.1 Участие митохондрий в реакциях цикла мочевины 95
3.2.2 Окисление этанола подавляет синтез мочевины в гепатоцитах 96
3.2.3 Действие ингибиторов окисления этанола на синтез мочевины 98
3.2.4 Действие ингибиторов PI3 киназы и аденозин-А1 рецепторов на синтез мочевины 99
3.3 Этанол подавляет обмен метильных групп в гепатоцитах крысы 100
3.3.7 Митохондриальная система метаболизма глицина 100
3.3.2 Ядерная магнитная спектроскопия 13С изотопомеров серина 104
3.3.3 Окисление этанола подавляет митохондриальный синтез серина 106
Заключение 107
ЧАСТЬ 4 Роль пориновых каналов в физиологии клеток
4.1 Закрывание пориновых каналов увеличивает чувствительность клеток к программируемой клеточной гибели (апоптозу) 108
4.1.1 Закрывание пориновых каналов активирует МРТ пору 109
4.1.2 Закрывание пориновых каналов индуцирует окислительный стресс 111
4.1.3 Генетический нокаут белков-поринов увеличивает чувствительность клеток к адафостину 112
Заключение 114
Приложение
- Волны сокращения-набухания в неперемешиваемом слое митохондрий
- Влияние диазоксида и пинацидила на митохондриальныймембранный потенциал и содержание Са2+ в кардиомиоцитах
- Действие ингибиторов PI3 киназы и аденозин-А1 рецепторов на синтез мочевины
- Генетический нокаут белков-поринов увеличивает чувствительность клеток к адафостину
Введение к работе
Митохондрии активно изучаются во многих лабораториях мира на протяжении 60 с лишним лет после их открытия в 1949 году. Несмотря на десятки тысяч работ, посвященных исследованию митохондриальных функций, роль митохондрий в жизнедеятельности клетки и их участие в регуляции внутриклеточных процессов все еще остаются не выясненными. Митохондрии являются важнейшими внутриклеточными структурами, выполняющими значительную роль не только в функционировании клеток млекопитающих в нормальных условиях, но и в различных патологических процессах. Развитие большинства патологических процессов, в частности, аноксии, ишемии, геморрагического шока и окисления этанола сопровождается нарушениями нормального функционирования митохондрий и глобальной потерей митохондриальных функций. Митохондрий теряют способность поддерживать электрохимический градиент ионов водорода на внутренней мембране, эффективно осуществлять окислительное фосфорилирование, производство АТФ и сбалансированный митохондриальный Са2+ ионный гомеостаз, несмотря на наличие кислорода и субстратов окисления [1-11]. Получено множество экспериментальных данных, указывающих на то, что митохондрии являются первичными мишенями различных патологических воздействий [9; 12-17]. В большинстве случаев эти воздействия обусловлены нарушениями внутриклеточного Са2+ гомеостаза [16-23]. Изучение роли митохондрий в жизнедеятельности клеток млекопитающих осложнено множественностью выполняемых митохондриями функций и переплетением внутриклеточных и внешних факторов, определяющих взаимодействие между митохондриями и остальными внутриклеточными структурами. Кроме хорошо известной роли митохондрий, как основного производителя АТФ, универсальной внутриклеточной энергетической "валюты", митохондрии принимают непосредственное участие в регуляции концентрации свободного Са2+ в цитоплазме клеток в качестве кальциевого депо с низким сродством, которое, однако, по своей ёмкости намного превосходит ёмкости эндо - и/или саркоплазматического ретикулумов. В покоящейся клетке митохондрии окружены цитоплазмой с низкой концентрацией ионов Са2+ (10"7-10"8 М) и находятся в стационарном состоянии покоя, так как концентрация свободного Са2+ существенно ниже сродства Са2+-транспортирующей системы митохондрий (10"5-10"3 М), [16-18; 20, 21, 24-35].
Однако, в переходных процессах, когда концентрация ионов Са2+ в цитоплазме значительно возрастает, (особенно в областях между эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями) высокие концентрации свободных ионов Са2+ способствуют накоплению некоторых количеств Са2+ в матриксе митохондрий (10" 3-10"2 М) [25; 32; 35; 36]. В этих условиях небольших нагрузок концентрация ионов Са2+ в матриксе митохондрий достигает значений достаточных для воздействия на состояния митохондрий, в частности, способствует увеличению производства АТФ [20; 21; 33; 34]. Однако, дальнейшее увеличение концентрации ионов Са2+ в матриксе митохондрий приводит к увеличению генерации кислородных радикалов, к активации неспецифической поры в мембране митохондрий, набуханию и разрыву внешней мембраны митохондрий с потерей митохондриальных функций [6; 10; 15-17; 19; 25; 34; 37-39]. Таким образом, митохондриальный транспорт Са2+ в зависимости от количества накопленного Са2+ определяет судьбу клеток млекопитающих от нормального функционирования до программируемой или некротической клеточной гибели. При ишемическом повреждении сердечной мышцы эта способность митохондрий накапливать и освобождать ионы Са2+ определяет степень пост-ишемического повреждения сердечной мышцы. В период ишемии, когда из-за закупорки коронарных сосудов подача кислорода и метаболитов к клеткам сердечной мышцы ограничена, активность митохондриальной дыхательной цепи снижена и митохондриальная мембрана в значительной мере деполяризована. При этом накопления ионов Са2+ в митохондриях не происходит, и никаких внешних проявлений повреждений тканей не наблюдается. Наиболее значительные нарушения структуры и функции митохондрий наблюдаются при восстановлении потока свежей крови через закупоренные коронарные сосуды, которое приводит к подаче кислорода и метаболитов к ишемической ткани и удалению продуктов метаболизма [3; 6; 15-17; 20; 25; 33; 34; 36]. По-видимому, поступление кислорода к анаэробным митохондриям с высоким уровнем восстановленности комплексов дыхательной цепи, сопровождающееся быстрым восстановлением митохондриального мембранного потенциала, является причиной интенсивного накопления значительного количества ионов Са2+ в матриксе митохондрий [40-44]. Повреждающее действие избыточного накопления ионов Са2+ усиливается в условиях повышенного окислительного стресса, например, при окислении многих ксенобиотиков, включая окисление этанола в клетках печени. Различные патологические условия, приводящие к повреждению митохондриальных функций, таким образом, обусловлены избыточным накоплением ионов Са в митохондриях, которое приводит к открыванию неспецифической поры и потере важнейших митохондриальных функций [2-4; 6; 14-17; 45]. Однако, механизмы, с помощью которых ионы Са2+ приводят к нарушению митохондриальных функций, до конца не выяснены. Для их понимания необходимо исследовать динамику взаимодействия этих ионов с митохондриями на различных уровнях - в изолированных митохондриях, клеточных культурах и в целом органе.
При развитии патологических состояний, в том числе и при алкогольной интоксикации, проницаемость внешней митохондриальной мембраны может меняться, приводя к нарушениям нормального функционирования митохондрий. Существенную роль в поддержании нормального обмена метаболитов между цитоплазмой и митохондриями выполняют каналы во внешней мембране митохондрий, образованные пориновыми белками. Любые нарушения этого обмена приведут к существенным нарушениям метаболизма клеток, особенно в тех процессах, которые невозможны без участия митохондрий. Однако, роль пориновых каналов в индукции и развитии алкогольной интоксикации до сих пор остается не выясненной. Таким образом, целями настоящей работы являются:
Определение участия и роли митохондриального транспорта ионов Са2+ в поддержании нормальной жизнедеятельности клеток млекопитающих.
Исследование степени участия митохондрий в регуляции концентрации свободных ионов Са2+ в цитоплазме.
Изучение роли митохондриальной компоненты в механизмах ишемического повреждения и противоишемического защитного действия диазоксида и пинацидила, активаторов плазматических АТФ-зависимых калиевых каналов.
Определение необходимости «умеренной» деполяризации митохондрий в постишемическом периоде для восстановления механической активности сердечной мышцы.
Определение механизма токсического действия этанола на метаболизм митохондрий в интактных клетках.
Исследование последствий закрывания пориновых каналов на жизнедеятельность и жизнеспособность клеток млекопитающих.
В связи с этими целями в настоящей работе будут решаться следующие задачи: 1. Выяснить последствия взаимодействия ионов Са2+ с основными митохондриальными функциями и определить факторы, активирующие неспецифическую Са -зависимую МРТ пору во внутренней мембране митохондрий.
Используя теоретический подход и математическую модель митохондриального ионного транспорта, основанную на регуляции проницаемости внутренней мембраны митохондрий Са2+-зависимой порой, получить количественное описание энергозависимых потоков ионов в митохондриях.
Получить экспериментальные доказательства участия энергозависимого митохондриального транспорта Са2+ в определении внутриклеточной динамики свободных ионов Са2+, включая генерацию, распространение и синхронизацию Са2+ волн в цитоплазме.
Выявить митохондриальный механизм защитного действия противоишемических фармакологических агентов, таких как диазоксид и пинацидил, известных фармакологических активаторов АТФ-зависимых К+ каналов (Катф) плазматической мембраны. На ишемической модели изолированного сердца крысы, определить роль транспорта Са2+ в митохондрии в механизме ишемического повреждения сердечной мышцы.
На модели изолированных гепатоцитов крыс, проверить нашу гипотезу о том, что возможной причиной глобальной потери митохондриальных функций при отравлении печени алкоголем является закрывание пориновых каналов во внешней митохондриальной мембране.
Разработать подходы к экспериментальному измерению проницаемости пориновых каналов во внешней мембране митохондрий внутри интактных клеток без их выделения из гепатоцитов. Определить какой из продуктов окисления этанола (NADH, кислородные радикалы, ацетальдегид и/или ацетат) играет существенную роль в механизме закрывания и способствует закрыванию митохондриальных пориновых каналов.
Исследовать роль закрывания пориновых каналов внешней митохондриальной мембраны в гепатоцитах, окисляющих этанол на основные функции печени - синтез мочевины, а также производство и обмен метильных групп в гепатоцитах.
Исследовать эффект закрытия пориновых каналов и уменьшения проницаемости внешней мембраны митохондрий на Са2+-индуцированное открывание неспецифической поры и высокоамплитудного набухания и определить механизм повреждающего действия закрытых пориновых каналов на функции интактных митохондрий. 9. Определить влияние закрывания пориновых каналов внешней митохондриальной мембраны на цитотоксичность лекарственных препаратов на примере противоопухолевого агента адафостина.
Проведенное в настоящей работе изучение особенностей транспорта ионов Са2+ в митохондриях тканей сердца и печени позволит выявить факторы, которые являются определяющими в нарушениях митохондриальных функций при развитии различных патологических процессов, и использовать полученные данные для разработки методологических и терапевтических подходов для защиты этих органов. Полученные в работе данные могут быть использованы для разработки методологических и терапевтических подходов, направленных на уменьшение последствий ишемического и/или алкогольного повреждения тканей сердца и печени, а также для разработки и изготовления, новых более эффективных фармакологических препаратов для лечения ишемического и/или алкогольного повреждения тканей сердца и печени.
Настоящая работа разделена на четыре Части, в каждой из которых рассмариваются экспериментальные данные по одной теме. Часть 1 посвящена описанию особенностей транспорта ионов Са2+ в митохондриях и их определяющей роли в регуляции динамики внутриклеточных Са2+ волн. В Части 2 представлены данные о повреждении митохондриальных функций в ишемическом сердце, о способах защиты миокарда от ишемического повреждения и о роли митохондрий в восстановлении сократительной активности сердца после длительной ишемии. Часть 3 посвящена обсуждению регуляторной роли пориновых каналов во внешней мембране митохондрий в нормальной жизнедеятельности митохондрий и клеток, а также их значению в токсическом действии этанола. В Части 4 представлены данные об ускорении программируемой клеточной гибели индуцированной адафостином, препаратом с противоопухолевым действием, при генетическом удалении (нокауте) белков поринов в митохондриях клеток эмбриональных фибробластов мышей.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Волны сокращения-набухания в неперемешиваемом слое митохондрий
Модуль # 5: Этот модуль описывает зависимость состояния МРТ поры от концентрации катионов Са2+, К+, Н+, анионов субстрата окисления и неорганического фосфата в матриксе и электрического потенциала на внутренней мембране митохондрий.
Полученная модель имеет множество решений. Анализ модели показал, что каждое конкретное решение зависит от количества ионов Са2+, добавленного в систему [224; 225]. Было установлено, что заданные начальные условия (исходная концентрация митохондрий, проницаемость переносчиков, свободная концентрация Са2+, К+, Н+, анионов неорганического фосфата и субстратов окисления в среде инкубации) определяют области значений основных переменных, при которых в нашей модели осуществляются различные режимы транспорта ионов и изменения объема митохондрий. Изменение начальных условий приводит к переключению одного режима в другой. Разнообразие режимов определяется тем, как быстро активируется и открывается Са2+-зависимая неспецифическая пора (РТР) во внутренней мембране митохондрий, и как долго она остается открытой [224]. Анализ модели показал, что все возможные режимы, реализуемые в представленной на Рис. 1 схеме, можно разделить на три наиболее характерные режима транспорта ионов, которые могут непрерывно переходить друг в друга при изменении начальных условий. Эти три наиболее характерные режимы, определенные в нашей модели, показаны на Рисунках 2, 3 и 4. Расчеты показали, что режим #1 осуществляется при добавлении к митохондриям малых количеств ионов Са2+, которых недостаточно для активации РТР поры. В этих условиях пора остается закрытой, и весь добавленный Са2+ накапливается в матриксе митохондрий (Рис. 2). При этом эквивалентное количество ионов Н+ «откачивается» помпой из матрикса, а затем возвращается обратно в матрикс. При этом ионы К+ и А2" выходят из митохондрий, и объем слегка уменьшается, мембранный потенциал при этом временно падает, а затем восстанавливается (Рис. 2). Наиболее интригующим режимом транспорта ионов в митохондриях является режим #2, который реализуется при нагрузке митохондрий промежуточными под пороговыми количествами ионов Са2+ при тех же начальных условиях, что и в режиме #1. В этих условиях Са2+-зависимая пора будет циклически открываться - закрываться, приводя к колебаниям ионов Са2+, Н+, К+, мембранного потенциала и объема митохондрий (Рис. 3). Режим #3 осуществляется при нагрузке митохондрий большими количествами ионов Са2+ (Рис. 4). Эти количества ионов Са2+ вызывают постоянную активацию поры. В этих условиях пора остается постоянно открытой, и все малые ионы, для которых пора проницаема, распределяются по своим градиентам между средой инкубации и матриксом (Рис. 4).
Таким образом. наша математическая модель потоков ионов в митохондриях, построенная на регуляции состояния поры ионами Са2+, Н+ и мембранным потенциалом, продемонстрировала все экспериментально наблюдаемые режимы транспорта ионов Са2+, Н+, К+ в митохондриях. В хорошем соответствии с нашими экспериментальными данными [84; 102; 103; 214; 224; 225] эта математическая модель также описывает явление митохондриального Са2+-индуцированного выброса накопленного Са2+ из матрикса, которое в дальнейшем будет использовано в настоящей работе для объяснения синхронизирующей роли митохондриального транспорта Са2+в целых клетках.
Возбудимость внутренней мембраны митохондрий ионами Са2 Накопление ионов Са2+ в матриксе митохондрий является необходимым условием изменения проницаемости внутренней мембраны митохондрий к водорастворимым молекулам, которое приводит к высвобождению из матрикса не только накопленных ионов кальция, но также и всех малых ионов (калия, водорода). Обнаружение Са2+-зависимого увеличения проницаемости внутренней мембраны митохондрий, сопровождавшегося высокоамплитудным набуханием и освобождением факторов, определяющих судьбы клеток, послужило толчком к тысячам новых работ по исследованию молекулярной структуры этой неспецифической поры и механизма ее открывания - закрывания [86]. Существенным для понимания роли митохондриального транспорта ионов Са2+ в регуляции динамики Са2+ в цитоплазме является выяснение синхронизующей роли митохондрий. В представленной работе будут рассмотрены динамика транспорта ионов Са2+ в митохондриях, наиболее характерные особенности МРТ, и условия открывания поры. Будет продемонстрировано, что самопроизвольное закрывание поры при выходе ионов Са2+ из митохондрий, определяет новое свойство митохондрий, названное "mitochondrial Ca2+-induced Са2 release" (митохондриальный Са2+ индуцированный выброс Са2 ), по аналогии с известным явлением увеличения концентрации ионов Са2+ в цитоплазме, наблюдаемом при освобождением предварительно накопленных ионов Са2+ из эндо- и/или саркоплазматического ретикулума, что приводит к резкому увеличению концентрации ионов Са2+ в цитоплазме [102; 104; 214; 227-230]. В настоящей работе представлены экспериментальные доказательства участия энергозависимого митохондриального транспорта Са2+ в определении внутриклеточной концентрации и динамики ионов Са2+, включая генерацию, распространение, а также синхронизацию Са2+ волн в цитоплазме. Возбудимость внутренней мембраны митохондрий ионами Са2 . Как уже отмечалось выше, существенной особенностью митохондриального транспорта Са2+ является то, что ионы Са2+, после накопления в матриксе, могут индуцировать обратимое открывание МРТ поры, приводящее к освобождению эндогенных и накопленных ионов кальция из матрикса в среду инкубации [214]. Как показано на рисунке 5, энергизованные митохондрии, окисляющие сукцинат в присутствии кислорода, способны аккумулировать и удерживать в матриксе весь добавленный Са2+ (первая фаза изменений концентрации ионов Са2+ во внешней среде непосредственно после добавки). В зависимости от количества ионов Са2+, добавленного в виде «скачка» МРТ пора в митохондриях будет активироваться быстро или медленно (определяется соотношением белок:добавленный Са2+). Открывание поры приводит к тому, что весь накопленный кальций (включая эндогенный) быстро освобождается из матрикса во внешнюю среду. При исследовании этого явления было обнаружено, что активация МРТ поры и выход накопленных ионов Са2+ из матрикса зависит от кинетики транспорта ионов в митохондрии и от способа нагрузки митохондрий ионами Са2+, т. е. от того насколько быстро или медленно изменяется концентрация Са2+ во внешней среде. От этого будет зависеть откроется МРТ пора, или не откроется. Так, при "импульсном" введении Са2+.
Влияние диазоксида и пинацидила на митохондриальныймембранный потенциал и содержание Са2+ в кардиомиоцитах
Таким образом, данная установка обеспечивает выполнение всех необходимые условий для наблюдения и регистрации оптических неоднородностей светорассеяния в суспензии митохондрий, возникающих в неперемешиваемом тонком слое суспензии. Объем суспензии, вносимый в ячейку, подбирался таким образом, чтобы толщина неперемешиваемого слоя суспензии митохондрий не превышала 1 мм, что обеспечивало свободную диффузию кислорода и поддержание дыхания митохондрий. Такая конструкция источников света и освещения ячейки позволяет фотографировать картину светорассеяния, образующуюся при прохождении света (4) через тонкий слой суспензии изолированных митохондрий (2, стекло). Фотокамера (1) настраивалась на картину светорассеяния однородного света от стабилизированных источников (4) и позволяла получать изображения оптических неоднородностей света, образующиеся в этом тонком ( 1 мм) слое митохондрий (2). Исходная суспензия митохондрий помещалась в открытую ячейку и интенсивно перемешивалась с помощью магнитной мешалки. В этой суспензии путем импульсного добавления ионов Si-2"1" (или Са2+) к митохондриям, обработанным валиномицином, запускались колебания ионных потоков. Затем, в заданный момент времени (Рис. 7, момент времени То) определенная аликвота суспензии переносилась на стекло (2) ячейки, формировался неперемешиваемый тонкий слой, и последовательные изменения светорассеяния фотографировались. Фотографии тонкого слоя митохондриальной суспензии получали с интервалом в 60 секунд сразу же после создания тонкого слоя суспензии митохондрий. Серия фотографий непрерывно изменяющихся во времени светлых и темных пятен, проходящего через суспензию света, показана на рисунке 9. Как видно на рисунке, сразу после переноса суспензии и формирования тонкого неперемешиваемого слоя никаких неоднородностей светорассеяния в этом слое не наблюдается (Рис. 9, 0 сек). Однако к 60 секунде однородная картина разбивается на ряд полей с различной интенсивностью светорассеяния, циклические изменения которой совпадают с периодом колебаний ионных потоков (Рис. 9, 60 сей). После 120 сек, на всех последующих изображениях наблюдаются циклические изменения интенсивностей «пятен» сильно и слабо рассеивающией суспензии, которые имеют точно такой же период изменения, что и период колебаний ионных потоков и обьема в интенсивно перемешиваемой суспензии (Рис. 7). При этом, исходно образовавшаяся картина неоднородностей оптической плотности суспензии сохраняется, но "светлые" пятна становятся "темными", а зоны, которые в предыдущем цикле были «темными» становятся «светлыми», т.е. в течение каждого цикла колебаний, картина меняется с "позитива" на "негатив" и наоборот (Рис. 9). Такая смена интенсивностей начиналась в центре пятна и распространялась на периферию, демонстрируя характерное волнообразное поведение этих пятен. Появление неоднородностей в виде светлых и темных областей в неперемешиваемой суспензии митохондрий не зависило от градиента температуры. Характерной особенностью этих структур является их зависимость от состояния системы транспорта ионов кальция. Для генерации колебаний ионных потоков в митохондриях требуется участие ионов кальция и увеличение проницаемости внутренней мембраны митохондрий для одновалентных катионов [77-79; 85]. Генерация колебаниий в условиях наших экспериментов осуществлялась в митохондриях, обработанных валиномицином, специфическим К+ ионофором. В отсутствии валиномицина индукция колебаний митохондрий ионами Са сопровождается единичным циклом набухания - сокращения, который обусловлен обратимым открыванием Са2+-зависимой поры. Было обнаружено, что в этих условиях, импульсное добавление ионов Са2+ также приводило к единичному изменению пространственной картины светорассеяния в распределенной суспензии митохондрий, как показано на серии фотографий, приведенных на Рис. 10. В этом эксперименте перемешиваемая суспензия митохондрий обрабатывалась ионами Са2+ и аликвота суспензии переносилась в оптическую ячейку для наблюдения пространственных структур в момент времени Т0 как показано на Рис. 7. В самый первый момент после переноса суспензии на стекло, никаких неоднородностей в тонком слое суспензии не наблюдается (Рис. 10, 20 сек). В исходной перемешиваемой суспензии в этот же момент времени кальций оказывается накопленным в матриксе митохондрий. Однако дальнейшая инкубация митохондрий в тонком слое сопровождается распадом однородной картины светорассеяния на ряд неоднородных областей с различной оптической плотностью (Рис. 10, 840 сек). В перемешиваемой суспензии в этот же момент времени наблюдается начало спонтанного выхода ионов кальция из матрикса митохондрий, что свидетельствует об индукции МРТ и лавинообразном переходе всех митохондрий в состояние с открытой порой. Следовательно, в распределенной в тонком слое суспензии митохондрий можно ожидать появления пространственных волн сокращения-набухания митохондрий и генерации высоких локальных концентраций свободного Са2+. Мы предполагаем, что зоны оптических неоднородности возникают вокруг митохондрий, которые обладают повышенной чувствительностью к ионам Са2+. В этих митохондриях МРТ пора открывается раньше, и они первыми «набухают» и возбуждают соседние, образуя зоны с набухшими митохондриями. Набухание митохондрий, приводящее к распрямлению складок внутренней мембраны, уменьшает светорассеяние и образует мало рассеивающие, светлые зоны суспензии. В этих зонах локальная концентрация ионов кальция будет выше той, которая нужна для «возбуждения» соседних митохондрий. Таким образом, последовательное возбуждение митохондрий будет передаваться по цепочке и двигаться от центра к периферии, приводя к расширению светлой зоны с набухшими митохондриями, как это видно из данных, приведенных на Рис. 9 и 10. В отличие от динамичной картины пространственного распространения волн сокращения-набухания, полученных в суспензии колеблющихся митохондрий, суспензия митохондрий, нагруженная единичным импульсом кальция, образовывала статичные структуры (Рис. 10). При этом наблюдается однонаправленное, необратимое структурообразование, и исходно однородная суспензии митохондрий с течением времени распадается на ряд неоднородных зон.
Действие ингибиторов PI3 киназы и аденозин-А1 рецепторов на синтез мочевины
Как было показано выше (Рис. 17-20), оба активатора АТФ-зависимых калиевых каналов в изолированных митохондриях сердца деполяризуют митохондриальнуюмембрану, ускоряют дыхание и подавляют транспорт ионов Са2+ и синтез АТФ. На основании этих данных можно предположить, что все эти эффекты диазоксида и/или пинацидила на изолированные митохондрии могут быть объяснены снижением электрохимического градиента ионов водорода, независимо от причин, это снижение вызывающих. Наблюдаемое в изолированных митохондриях подавление транспорта ионов Са2+ может быть следствием деполяризующего действия этих агентов и снижения электродвижущей силы для энергозависимого транспорта ионов Са2+, что приведет к уменьшению количества накопленного кальция. Следовательно, можно предположить, что защитное действие диазоксида (или пинацидила) против ишемии может быть обусловлено снижением мембранного потенциала и количества ионов Са2+, накапливаемых в митохондриях, из-за деполяризации митохондрий, а также активацией МРТ поры, открывание которой стимулирует освобождение Са2 из митохондрий. В связи с этим мы исследовали влияние диазоксида и пинацидила, активаторов плазматических КДТФ каналов, на митохондриальный мембранный потенциал и содержание ионов Са2+ в матриксе митохондрий в культуре интактных кардиомиоцитов. Для оценки величины изменения мембранного потенциала митохондрий внутри интактных клеток, культура кардиомиоцитов, выращенная на стекле, была окрашена тетраметилродамином (ТМРМ), зондом с потенциал зависимой флуоресценцией, который накапливается в матриксе митохондрий, и отражает величину митохондриального мембранного потенциала. Подробное описание деталей экспериментов представлено в наших опубликованных работах [171; 172]. Интенсивность флуоресценции этой краски в митохондриях интактных клеток пропорциональна мембранному потенциалу митохондрий, возрастает при увеличении потенциала и уменьшается при деполяризации митохондриальной мембраны[172; 250; 251]. Влияние диазоксида и пинацидила на мембранный потенциал митохондрий в культуре кардиомиоцитов изучалось по изменению флуоресценции ТМРМ. Для этого культура кардиомиоцитов, выращенная на стекле,инкубировалась в стандартной среде, содержащей ТМРМ (100 нМ) в течение 30 мин при 37С. После этого клетки переносились в среду, содержащую (мМ): NaCI 116; KCI 4; MgCI2 1.9; NaH2P04 1.7; NaHCQ3 4.3; CaCI2 1; HEPES 16.8, 50 нМ TMPM (pH 7.4), и флуоресцентные изображения клеток регистрировались с помощью конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM 510-МЕТА [172], снабженного аргоновым лазером (с длинами волн возбуждения 543 нм и флуоресценции 585 нм). Для исключения возможных артефактов из за сокращения и движения фокальной плоскости изображения спонтанное сокращение кардиомиоцитов подавлялось обработкой 2,3-бутандион моноксимом (20 мМ) [172]. Полученные изображения анализировались с помощью программы анализа изображений ANALYZE (Mayo Foundation, Rochester, MN, USA). Как показано на рисунке 24, ТМРМ специфически накапливается исключительно в митохондриях клетки, ярко окрашивая их в красный цвет (Рис. 24, А). Обработка клеток диазоксидом (100 цМ) приводила к заметному уменьшению интенсивности флуоресценции, указывая на деполяризующее действие диазоксида, аналогично данным, полученным на изолированных митохондриях. Блокатор КДТФ каналов 5-HD (5- гидрооксидеканоевая кислота, 100 рМ), не влияя на уровень флуоресценции ТМРМ в контроле, частично подавляла деполяризацию, вызванную диазоксидом, a FCCP, разобщитель митохондрий протонного типа, полностью деполяризовал мембранный потенциал митохондрий в кардиомиоцитах (Рис. 24, FCCP). Таким образом, приведенные данные указывают на то, что диазоксид и пинацидил, деполяризуют внутриклеточные митохондрии, и что этот эффект частично предотвращается 5-HD, блокатором плазматических КДТФ каналов.
Диазоксид и пинацидил снижают митохондриальный Са2+ в клетках. Тот факт, что циклоспорин А, специфический ингибитор МРТ, ингибирует выход ионов Са2+ из изолированных митохондрий, индуцированный диазоксидом (или пинацидилом), и это ингибирование не связано с транспортом калия в митохондриях, указывает на то, что диазоксид и/или пинацидил на самом деле могут изменять митохондриальный Са2 гомеостаз и значительно снижать количество накопленного Са2 как в норме, так и при патологии, например, при выходе из ишемии и реперфузии. В связи с этим мы исследовали влияние активаторов калиевых каналов диазоксида и пинацидила, на уровень кальция в митохондриях интактных кардиомиоцитов. Для этого клетки, выделенные из сердечной мышцы новорожденных крысят, были посеяны на поверхности покровных стекол и после 18-20 часов инкубации при 37С, в атмосфере 95%02/5%С02 нагружены Rhod-2/AM (10 рМ), Са2+-чувствительным флуоресцентным красителем, который накапливается специфически в матриксе митохондрий и отражает уровень кальция в них [172; 251]. Изображение клеток неонатальных кардиомиоцитов, нагруженных Rhod-2, демонстрирует «точечную» структуру, которая отражает митохондриальную локализацию флуоресцентного красителя внутри клеток. Обработка кардиомиоцитов диазоксидом (300 рМ), приводила к уменьшению интенсивности флуоресценции Rhod-2 в митохондриях этих клеток, что свидетельствовало о снижении в митохондриях количества Са2+. В среднем, интенсивность флуоресценции уменьшалась от184 ± 32 условных единиц в контроле, до 115 ± 13 условных единиц в присутствии диазоксида (Рис. 25, А). На этом рисунке приведена типичная картина изменения флуоресценции в кардиоцитах, полученная в трех независимых экспериментах. Так же как и при регистрации мембранного потенциала в суспензии изолированных при регистрации мембранного потенциала в суспензии изолированных митохондрий флуоресцентным красителем ТМРМ,
Генетический нокаут белков-поринов увеличивает чувствительность клеток к адафостину
Для оценки состояния пориновых каналов внешней митохондриальной мембраны нами был разработан новый флуоресцентный зонд, способный транспортироваться непосредственно в межмембранное пространство митохондрий и накапливаться там. Многие белки, которые локализуются в межмембранном пространстве митохондрий, такие как аденилаткиназа, цитохром с, SMAC/DIABLO и другие, имеют в своей структуре последовательности, которые способствуют их целенаправленному транспорту и доставке в межмембранное пространство митохондрий [176; 331-336]. Основная идея заключалась в том, чтобы осуществить решение сразу нескольких задач: 1) прохождение зонда через плазматическую мембрану и попадание в цитоплазму клеток; 2) селективное накопление зонда в межмембранном пространстве митохондрий; 3) отщепление и освобождение водорастворимой флуоресцентной метки в межмембранном пространстве внутриклеточных митохондрий. Для обеспечения прохождения флуоресцентной метки в клетку без ее повреждения, мы выбрали так называемую ТАТ-последовательность, которая присутствует во всех известных лентивирусах и является на сегодняшний день наиболее популярным молекулярным инструментом доставки больших макромолекул внутрь клетки [337-339]. Эта последовательность обладает уникальным свойством облегчать прохождение через биологические мембраны больших молекул, которые в норме не проходят через плазматическую мембрану клеток. Такие химеры проходят сквозь плазматическую мембрану, не повреждая клеток, и накапливаются в цитоплазме [337-339]. Наша флуоресцентная метка была образована путем ковалентной сшивки последовательности белка SMAC/DIABLO, с последовательностью 11 аминокислот ТАТ белка, известной как «проводящий» домен [340; 341]. К полученной последовательности мы пришили также карбокситетраметилродамин (КТМР), флуоресцентный зонд который и служил флуоресцентной меткой, позволяющей регистрировать состояние пориновых каналов в живых клетках. Для доставки белка в межмембранное пространство мы использовали олигопептид, содержащий последовательность, состоящую из 25 первых аминокислот белка SMAC/DIABLO, [342; 343]. Мы ожидали, что эта химера пройдет через плазматическую мембрану и войдет в клетку с помощью ТАТ-последовательности. После отщепления ТАТ последовательности в цитозоле остаток с помощью белкового переносчика ТОМ пересечет внешнюю мембрану митохондрий и окажется в межмембранном пространстве. После доставки в межмембранное пространство, последовательность SMAC/DIABLO будет отщеплена протеазами, и освободившийся флуоресцентный зонд окажется в межмембранном пространстве. Если пориновые каналы будут закрыты, то флуоресцентная метка будет накапливаться в межмембранном пространстве и ее концентрация там (а соответственно и интенсивность флуоресценции) будет выше, чем в цитоплазме. Однако, если пориновые каналы во внешней мембране митохондрий окажутся открытым, то зонд свободно выйдет из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму, и его концентрация будет одинаковой в цитоплазме и митохондриях, и интенсивность флуоресценции, ассоциированная с митохондриями, уменьшится. Таким образом, наша флуоресцентная метка будет являться индикатором открытого или закрытого состояния пориновых каналов внешней мембраны митохондрий в интактных живых клетках.
Использование флуоресцентной пробы для оценки состояния пориновых каналов во внутриклеточных митохондриях. Изолированные гепатоциты, которые культивировались на стекле 16-18 часов, были нагружены флуоресцентным красителем MitoTrackerGreen FM (МТГ, 300 пМ, Molecular Probes, USA) специфически накапливающимся в митохондриях, и позволяющим осуществлять визуальное наблюдение за внутриклеточными митохондриями (Рис. 55, верхняя левая панель). Эти клетки затем инкубировались с нашей флуоресцентной меткой (1 рМ) в течение 30 мин в инкубаторе при 37С. Зеленая флуоресценция МТГ, отражает локализацию митохондрий внутри клетки, что существенно для определения локализации нашей метки, имеющей красную флуоресценцию. Анализ изображений окрашенных клеток показал, что после добавления нашего зонда, красная флуоресценция в клетках была локализована исключительно в местах расположения митохондрий (зеленая флуоресценция) (Рис. 55, верхняя панель). Для дополнительного уточнения места локализации нашей метки, клетки были обработаны дигитонином, детергентом, который образует поры в биологических мембранах, содержащих холестерин [86]. Как было установлено нами ранее, дигитонин в концентрации 8 рМ образует поры только в плазматической мембране клеток, но не нарушает проницаемости внешней мембраны митохондрий [199; 201]. После обработки клеток, нагруженных красной флуоресцентной меткой, дигитонином в концентрации 8 рМ никаких заметных изменений флуоресценции на конфокальных изображениях клеток не наблюдалось (Рис. 55, средняя панель). Красная флуоресценция нашей метки оставалась в тех же местах, где были локализованы митохондрии, флуоресцирующие зеленым цветом, показывая тем самым, что дигитонин в этих концентрациях не достигает внешней мембраны митохондрий. Однако, высокие концентрации дигитонина (80 рМ и выше) способны проникнуть в клетки и достигнуть вмешнюю мембрану митохондрий и освободить красную флуоресценцию, которая при этом полностью исчезает (Рис. 55, нижняя панель). В этих условиях на конфокальных изображениях клеток регистрировалась только зеленая флуоресценция МТГ, красителя, ассоциированного исключительно с белками митохондриального матрикса и не может выйти из митохондрий, указывая на принципиальную правильность экспериментального подхода, разработанного в настоящей работе.
