Введение к работе
Прошло уже более 30 лет с тех пор , как были разработаны методы выделения интактных митохондрий. Все эти годы митохон-рии были и остаются одним, из самых популярных объектов исследования. Едва ли ситуация изменится в ближайшие годы. Актуальность исследований на уровне митохондрий определяется целым рядом причин, фудно переоценить важность такой функции митохондрий как окислительное фосфорилирование. Поэтому вполне естественно,что исследование молекулярного механизма окислительного фосфорилирования оказалось одной из самых важных проблем современной биологии. Впоследствии оказалось, что окислительное фосфорилирование не является единственной функцией митохондрий в клетке. Митохондрии участвуют в регуляции концентрации кальция в цитоплазме, осуществляя активный транспорт кальция с использованием энергии ATI или окисления субстратов / I - 7 /.
В клетках с интенсивным глюконеогенезом ( Гепатоциты и клетки коркового слоя почки ) в митохондриях осуществляются начальные этапы глюконеогенеза, а в клетках, осуществляющих синтез жирных кислот,функцией митохондрий является синтез цитрата, необходимого для синтеза СІК в цитоплазме. В буром жире, основной функцией которого является генерация тепла, такой же важной функцией митохондрий как окислительное фосфорилирование является прямая трансформация энергии окисления в тепло / 8 -13 /. Этот далеко не полный перечень функции митохондрий в клетке указывает на то, что митохондрии являются полифункциональными органеллами, причем четко проявляются тканеспецифи-ческие различия в свойствах митохондрий, выделенных из различ - 7 ных органов, например, из печени, бурого жира, сердца, надпочечников и т.д.
Чрезвычайно сложной оказалась организация транспорта катионов и метаболитов из цитозоля в митохондрии, который опре-деляется функционированием нескольких десятков переносчиков в мембране митохондрий / 13-30 /, перечень которых увеличивается в последние годы и, по-видимому, далеко не полон. Очень важно, что отмеченная выше тканеспецифичность митохондрий определяется в основном тканеепецифичностью набора переносчиков в мембране. Так, например, в митохондриях печени, где происходит синтез СЖ, имеется переносчик цитрата, а в митохондриях сердца, в котором синтез цитрата не происходит, этого переносчика нет / 13 /. В буром жире в мембране митохондрий имеется канал проницаемости для анионов, регулируемый пуриновими нуклеотидами, которого нет в митохондриях печени и сердца / 10 /. В митохондриях почки имеется переносчик глютамина, которого нет в митохондриях печени и сердца / 31 /. В последние годы получены прямые указания на то, что одним из способов регуляции метаболизма гормонами является изменение проницаемости митохондриальной мембраны для метаболитов, которое приводит к изменению интенсивности транспорта метаболитов из цитозоля в митохондрии / 13-15, 32-34 /.
Все это позволяет, во-первых, сделать вывод о том, что для понимания физиологической регуляции функции митохондрий особенно важным является исследование регуляции транспорта метаболитов через мембрану митохондрий, а, во-вторых, поставить вопрос об идентификации эффекторов, регулирующих активность переносчиков метаболитов в мембране митохондрий. В достаточной степени этот вопрос разрешен только в отношении переносчиков адениннуклеотидов, активность которого регулируется длинноцепочечными ацил КоА, и в отношении канала проводимости для анионов в митохондриях бурого жира, эффекторами активности которого являются адениннуклеотиды, СЖК и длинноцепо-чечные ацил коА / 11,14,34,35-37 /.
В настоящее время очевидно, что действие гормонов на транспорт метаболитов через мембрану митохондрий не определяется прямым взаимодействием гормонов с митохондриями и, следовательно, в данном случае проблема идентификации эффекторов активности переносчиков метаболитов сводится к проблеме идентификации посредников действия гормонов, непосредственно действующих на транспорт субстратов в митохондриях.
Каковы же пути решения этой проблемы? Если учесть, что этими эффекторами могут быть метаболиты цитозоля, такие как СЖК, длинноцепочечные ацил КоА, нуклеотиды и т.д., то самым простым подходом к решению проблемы является исследование действия этих метаболитов на транспорт субстратов в митохондриях. Этот подход в настоящее время является основным и привел к определенным достижениям при исследовании регуляции транспорта анионов в митохондриях бурого жира и регуляции транспорта адениннуклеотидов в митохондриях из большинства тканей / 10,13,15 /, но очевидна ограниченность этого подхода. Дело в том, что при использовании только этого подхода, заведомо исключается возможность выявления в цитозоле неидентифициро-ванных специализированных регуляторов функционального состояния митохондрий. Напротив, что же позволяет постулировать возможность существование таких регуляторов? В конце пятидесятых годов стало очевидным, что митохондрии являются чрезвычайно перспективным объектом исследования для специалистов в области биохимии, физиологии и биофизики клетки. Относительная простота экспериментов с изолированными митохондриями, казалось, открывает возможность быстрого выяснения регуляторних механизмов, контролирующих энергетические процессы в клетке. Более того, долгое время сохранялась иллюзия, что именно этот подход даст ключ к решению проблемы механизма действия таких гормонов как тироксин, ПТГ и т.д. /116, 192 /. К сожалению оказалось, что эксперименты с изолированными митохондриями дают обширную информацию о мембранной организации самих митохондрий, о транспортных механизмах в мембране митохондрий, но эта информация становится ограниченной и противоречивой, когда результаты экспериментов с митохондриями in vitro интерпретируются на\ уровне целой клетки. При выяснении вопросов о том, каким образом изменяется функция митохондрий при изменении физиологического оостояния клетки,какие эффекторы изменяют активность митохондрий, за редким исключением четкого ответа на них эксперименты с изолированными митохондриями не дают. И если до сих пор; часто приходится ставить вопрос примерно таким образом: "Соотношение физиологической и мито-хондриальной регуляции" / 38 /, то это свидетельствует о том, что существует некоторый разрыв между современной физиологией клетки и митохондриологией. В чем же причина этого разрыва Прежде всего в том, что исследователи, работающие на клеточном уровне, и митохондриологи имеют дело с объектами, которые по сложности мембранной организации качественно находятся на одном уровне. Имеется в виду то, что, работая о целой клеткой, исследователь фактически имеет дело с мембранными процессами в плазматической мембране, а внутренняя митохондриальная мембрана по своей организации, набору переносчиков и т.д. совсем не проще мембраны бактерии. Сложность транспортных процессов в митохондриях и является одной из причин, которая заставляет часть митохондриологов абстрагироваться от физиологии клетки. В самом деле, по-видимому, еще достаточно долгое время можно будет заниматься идентификацией транспортных механизмов в митохондриях, выделенных из различных объектов. Вместе с тем эксперименты с изолированными митохондриями по сравнению с экспериментами на клеточном уровне в физиологическом отношении выхолощены. В какой-то степени это обусловлено переходом с клеточного на субклеточный уровень. Известно, что сами среды выращивания клеточных культур в большинстве своем содержат плазму, и поэтому исследование действия гормонов и других физиологически-активных компонентов плазмы с самого начала составляют основу работ на клеточном уровне. По аналогии среды инкубации митохондрий должны включать в себя компоненты ци-тозоля и именно в цитозоле могут находится регуляторы функционального состояния митохондрий. Тем не менее, как известно, эксперименты с добавлением к митохондриям цитоплазмы не являются достаточно разработанным экспериментальным подходом. Общепринятые методы выделения, хранения и инкубации митохондрий имеют целью получение как можно более чистого препарата митохондрий, хотя очевидно, что при этом происходит отмывание от цитоплазматических регуляторов функции митохондрий. Этим, по-видимому, и объясняется то, что в целом ряде случаев различия в функциональных характеристиках препаратов митохондрий, выделенных из животных с различным физиологическим статусом, не коррелируют с результатами, полученными обычными методами на клеточном уровне. Но даже в тех случаях, когда изменения в функциональном состоянии митохондрий достаточно стабильны и сохраняются в процессе выделения и очистки, эксперименты с чистой суспензией митохондрий не могут дать ответа на вопрос о клеточных механизмах, ответственных за эти изменения.
Основной целью представленной работы явилась попытка разработки модельной системы, позволяющей изучение in Vitro гормональной регуляции энергетических реакций митохондрий, опосредованной цитоплазматическими регуляторами митохондриаль-ных процессов. Так как гипотетические неидентифицированные регуляторы митохондриальных процессов должны находиться в цитоплазме, то была использована модельная система, включающая в себя помимо митохондрий цитоплазму, и наши исследования в основном свелись к выяснению влияния гормонального статуса организма на регуляцию функционального состояния митохондрий компонентами питозоля.
Как уже говорилось выше, митохондрии являются чрезвычайно сложными полифункциональными органеллами. В связи с этим нам предстояло решить вопрос о том, какие параметры функционального состояния митохондрий представляют наибольший интерес с точки зрения гормональной регуляции метаболизма клетки? Так как в основном наши исследования проводились с митохондриями печени, то регуляция функции митохондрий интересовала нас в связи с гормональной регуляцией глюконеогенеза в гепатоцитах.
Современные представления о регуляции глюконеогенеза в гепатоцитах гормонами сводятся к тому, что регуляция осуществляется с одной стороны глюкагоном, катехоламинами и глюкокортикои-дами, которые стимулируют глюконеогенез, и с другой стороны, инсулином, который ингибирует глюконеогенез / 39-41 /. Считается, что лимитирующей стадией глюконеогенеза, регулируемой всеми перечисленными гормонами, является превращение пирувата в фосфоэнолпируват, которое осуществляется двумя ферментами, пируваткарбоксилазой и ФЭП-карбоксикиназой / 39-41 /. Пируват-карбоксилаза локализована в митохондриях, а внутриклеточная локализация ФЭП-карбоксикиназы в гепатоцитах видоспецифична / 40 /. Как правило, гормоны, стимулирующие глюконеогенез, параллельно увеличивают интенсивность карбоксидирования пирувата в митохондриях и активность ФЭП-карбоксикиназы / 32,33,41-44 /. Показано, что увеличение интенсивности карбоксилирования пирувата в митохондриях печени в условиях стимуляции глюконеогене-за является следствием не увеличения активности пируваткарбок-силазы, а стимуляции транспорта пирувата из цитозоля в митохондрии печени, так как карбоксилирование пирувата лимитируется транспортом пирувата из цитозоля в митохондрии гепатоцитов / 14,32 /. В связи с этим возникло представление о том, что одним из механизмов стимуляции глюконеогенеза в гепатоцитах гормонами является стимуляция транспорта пирувата из цитозоля в митохондрии / 14,32 /.
Основываясь на вышеизложенном, основное внимание в наших исследованиях было уделено гормональной регуляции транспорта и метаболизма пирувата в митохондриях печени цитоплазматически-ми регуляторами. Помимо исследования участия цитоплазматичес-ких регуляторов в гормональной регуляции транспорта метаболитов из цитозоля в митохондрии нами было проведено и аналогичное исследование регуляции транспорта ионов кальция в митохондриях печени. Поводом к этому исследованию послужило представление о том, что действие ряда гормонов на глюконеогенез опосредовано изменением концентрации ионизированного кальция в цитоплазме, причем цри действии гормонов изменяется распределение ионов кальция между митохондриями и цитоплазмой / 1,45-48 /.
По целому ряду причин в первую очередь нас интересовал вопрос о влиянии инсулина на регуляторные взаимоотношения цитоплазмы и митохондрий. Во-первых, потому, что вопрос о действии инсулина на метаболизм митохондрий в литературе почти не освещен, хотя в последние годы появился целый ряд работ о регуляции функционального состояния в митохондриях печени глюкагоном и катехоламинами / 32,33,49-60 /. Объясняется это тем, что для глюкагона и катехоламинов (_/ -адренергическая регуляция) известен второй посредник - ц-й $ АШ, и проблема во многом сводится к вопросу о том, каким образом ц-3 б АМФ изменяет функциональное состояние митохондрий in r±v . Для инсулина посредники его действия на метаболические процессы в гепатоцитах не известны / 39 / и это, конечно же, затрудняет выяснение вопроса о клеточном механизме, опосредующем действие инсулина на митохондрии печени.
Во-вторых, как раз в отношении действия инсулина на транспорт пирувата и окислительное фосфорилирование в митохондриях печени общепринятые подходы изучения гормональной регуляции функции митохондрий оказались неэффективными. Оказалось, что при выделении митохондрий из печени крыс, которым вводили инсулин, не удается обнаружить функциональные изменения, противоположные тем, которые в аналогичных условиях имеют место при введении глюкагона и катехоламинов / 33,56 /. Те же функциональные изменения, которые сохраняются в процессе выделения митохондрий, обусловлены не действием инсулина на гепатоциты, а эффектами контргормонов инсулина (глюкагона и катехоламинов), секретируемых в плазму в условиях инсулиновой гипогликемии. На наш взгляд эти негативные результаты объясняются отмыванием митохондрий от инсулинзависимых цитоплазматических регуляторов в процессе их выделения.
Поэтому следующей задачей нашего исследования явилась проверка предположения о наличии в цитоплазме инсулинзависимого регулятора функции митохондрий с использованием модельной системы, содержащей помимо митохондрий цитоплазму. В дальнейшем, когда инсулинзависимый цитоплазматический регулятор (ИЗР) был нами обнаружен, выделен и идентифицирован как гликолипо-пептид, встал вопрос о том, не является ли ИЗР посредником действия инсулина на метаболические процессы в таких органах-мишенях инсулина как печень, сердце, диафрагма. Для выяснения этого вопроса была исследована возможность проявления инсулин-подобного действия ИЗР на клеточном уровне и in vivo Обнаружение целого ряда инсулинподобных эффектов ИЗР и наличие корреляции между концентрацией инсулина в плазме и активностью ИЗР в печени, сердце и диафрагме крыс позволило нам сделать вывод о том, что, по крайней мере частично, действие инсулина на метаболические процессы в этих органах опосредовано увеличением активности ИЗР.
Исходя из представления о том, что ИЗР является посредником действия инсулина на метаболизм, нами была сделана попытка выяснить роль ИЗР во взаимоотношениях инсулина и гормонов-антагонистов инсулина, таких как глюкокортикоиды и адреналин. При этом нами рассматривались взаимоотношения ИЗР и таких посредников действия гормонов на метаболизм как ц-ё АМФ и ионы кальция.
Участие ИЗР в регуляции метаболических процессов рассматривалось не только при введении крысам инсулина, глюкокорти-коидов и адреналина, но и при голодании, тиреоидэктомии, мышечной нагрузке и действии стресса.
Хорошо известно,что необратимость повреждения клетки при патологии в ряде случаев обусловлена повреждением митохондрий / 36 /. В связи с этим большое значение имеет выяснение клеточных механизмов, обуславливающих повреждение митохондрий, стабилизацию митохондрий к повреждающим воздействиям и обратимость повреждения митохондрий. Одним из экспериментальных подходов к решению этой проблемы является проведение модельных экспериментов с суспензией митохондрий in vitro в которых исследуется влияние на митохондрии клеточных факторов, которые повреждают митохондрии при патологии (ионы Са , (Ж, длинноцепочечные ацил КоА, перекиси липи-дов, лизофосфолипиды, логические ферменты и т.д.) и цитоплазмати-ческих регуляторов, стабилизирующих митохондрии к повреждающим воздействиям.
По современным представлениям особенно важную роль в повреждении митохондрий печени in vivo играют ионы кальция / 57 /. Поэтому, в представленной работе были рассмотрены взаимоотношения ионов Са и ИЗР при повреждении митохондрий печени in vivo и in vitro обратимость повреждения митохондрий ионами Са + и взаимодействие интактных и поврежденных митохондрий при усилении гетерогенности популяции митохондрий при патологии.
Основные положения, которые выносятся на защиту: I. Гормональная регуляция транспорта ионов кальция и метаболитов через мембрану митохондрий печени и сердца крыс опосредовано изменением активности термостабильных гликопептидов цитозоля (Инсулинзависимый цитоплазматический регулятор, который увеличивает кальциевую емкость и ингибирует транспорт метаболитов в митохондриях печени и сердца крыс, и гликопептид-ингибитор электрогеиного транспорта ионов кальция в митохондриях сердца крысы.
2. ИЗР является одним из посредников действия инсулина на метаболизм, так как активность ИЗР в органах-мишенях инсулина коррелирует с концентрацией инсулина в плазме, а очищенные препараты ИЗР обладают инсулинподобным действием в экспериментах с митохондриями на клеточном уровне и in vivo.
3. йнгибирование глюконеогенеза при добавлении ИЗР происходит вследствие ингибирования транспорта пирувата из цитозоля в митохондрии.
При стрессе и введении глюкокортикоидов транспорт пирувата и ионов кальция в митохондриях печени крыс регулируется изменением чувствительности митохондрий к действию ИЗР,
Похожие диссертации на Цитоплазматические регуляторы транспорта катионов и метаболитов через мембрану митохондрий
