Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 13
2.1. Структурно-функциональная организация системы транспорта Na+ в колее лягушки
2.1.1. Строение кожи лягушки 13
2.1.2. Функциональная организация системы транспорта Na+ в колее лягушки 15
2.1.3. Формирование системы транспорта Na+ в коже лягушки 19
2.2. Амилорид-чувствительные эпителиальные ^+-каналы 21
2.2.1. Основные представители суперсемейства Deg/ENaC 21
2.2.2. Структурно-функциональная организация эпителиальных Ма+-каналов 23
2.2.2.1. Функциональная организация и топология в мембране эпителиальных Na"*"- 23 каналов
2.2.2.2. Стехиометрия субъединиц и модель поры эпителиальных На+-каналов 26
2.2.3. Биофизические характеристики эпителиальных Ка+-каналов 28
2.2.4. Регуляция активности эпителиальных Ка+-каналов 32
2.2.4.1. Аденилатциклазная система передачи информации и регуляция активности 32 эпителиальных 1Яа+-каналов антидиуретическим гормоном
2.2.4.2. Фосфоинозитидная система передачи информации 37
2.2.4.3. Каскад метаболизма арахидоновой кислоты 43
2.2.4.4. Тирозинкиназы и тирозинфосфатазы и регуляция активности эпителиальных Ма+-каналов инсулином
2.2.4.5. Элементы цитоскелета 54
2.2.4.5.1. Роль микротубулярного аппарата клетки в регуляции активности эпителиальных Ма+-каналов
2.2.4.5.2. Роль элементов актинового цитоскелета в регуляции активности эпителиальных Ма+-каналов
2.2.4.6. Регуляция активности эпителиальных Ка+-каналов альдостероном 63
2.2.5. Патология эпителиальных ^+-каналов 67
2.2.5.1. Псевдогиперальдостеронизм (Синдром Лиддла) 67
2.2.5.2. Псевдогипоальдостеронизм типа 1 69
2.3. Na+/K+- АТФаза в базолатеральной мембране кожи лягушки 72
2.3.1. Структурно-функциональная организация Na /К -АТФазы 72
2.3.2. Гормональная регуляция активности Na+/K+-ATa3bi 78
2.3.2.1. Регуляция активности Na+/K+-АТФазы альдостероном 78
2.3.2.2. Регуляция активности Na+/K+-АТФазы инсулином 81
2.3.2.3. Регуляция активности NaVK-АТФазы антидиуретическим гормоном 84 2.4. Заключение по обзору литературы и постановка задачи исследования 84
3. Материалы и методы исследования 88
3.1. Объект исследования 88
3.2. Метод короткого замыкания 88
3.3. Автоматизированная установка фиксации потенциала на колее лягушки 93
3.3.1. Установка кожи и электродов 93
3.3.2. Схема фиксации потенциала на коже лягушки 96
3.3.3. Измерение вольт-амперных характеристик кожи лягушки 97
3.4. Растворы 97
3.5. Статистический анализ 98
4. Результаты экспериментов и их обсуждение 99
4.1. Роль цитоскелета в регуляции транспорта Na+ в колее лягушки 99
4.1.1. Влияние агентов, вызывающих реорганизацию микротрубочек, на транспорт Na+ в коже лягушки
4.1.1.1. Влияние агентов, вызывающих деполимеризацию микротрубочек, на 99 транспорт Na+ в коже лягушки
4.1.1.2. Влияние агентов, вызывающих стабилизацию микротрубочек, на транспорт 106 Na+ в коже лягушки
4.1.2. Влияние агентов, вызывающих реорганизацию микрофиламентов, на 110
транспорт Na+ в коже лягушки
4.1.2.1. Влияние агентов, вызывающих деполимеризацию микрофиламентов, на ПО транспорт Na+ в коже лягушки
4.1.2.2. Влияние агентов, вызывающих стабилизацию микрофиламентов, на 118 транспорт Na+ в коже лягушки
4.1.3. Заключение по разделу 4.1. 121
4.2. Роль фосфоинозитидной системы в регуляции транспорта Na+ в коже 122
лягушки
4.2.1. Роль протеинкиназы С в регуляции транспорта Na+ в коже лягушки 122
4.2.1.1. Влияние активатора протеинкиназы С форболового эфира РМА на транспорт
Na в коже лягушки 123
4.2.1.2. Влияние ингибиторов протеинкиназы С на транспорт Na+ в коже лягушки 126
4.2.2. Роль фосфатидилинозитолкиназ в регуляции транспорта Na+ в коже лягушки
4.2.2.1. Влияние ингибитора фосфатидилинозитолкиназ вертманнина на транспорт
Na+в коже лягушки 130
4.2.2.2. Роль актинового цитоскелета в регуляции фосфатидилинозитолкиназами 140
транспорта Na+ в коже лягушки
4.2.2.2.1. Влияние деполимеризатора микрофиламентов латрункулина В на 141 воздействие вертманнина на транспорт Na+ в коже лягушки
4.2.2.2.2. Влияние стабилизатора микрофиламентов фаллоидина на воздействие 144 вертманнина на транспорт Na+ в коже лягушки
4.2.3. Роль фосфоинозитидной системы в регуляции транспорта Na+ в коже головастика 148
4.2.3.1. Влияние активатора протеинкиназы С форболового эфира РМА на транспорт Na+ в коже головастика 149
4.2.3.2. Влияние ингибитора фосфатидилинозитолкиназ вертманнина на транспорт Na+ в коже головастика 152
4.2.4. Заключение по разделу 4.2. 158
4.3. Регуляция гормоном инсулином транспорта Na+ в коже лягушки 160
4.3.1. Влияние инсулина на транспорт Na+ в коже лягушки 160
4.3.2. Роль тирозинкиназ в регуляции инсулином транспорта Na+ в коже лягушки 162
4.3.3. Роль тирозинфосфатаз в регуляции инсулином транспорта Na+ в коже лягушки 166
4.3.4. Роль фосфатидилинозитолкиназ в регуляции инсулином транспорта Na+ в коже лягушки 168
4.3.5. Роль протеинкиназы С в регуляции инсулином транспорта Na+ в коже лягушки 171
4.3.6. Заключение по разделу 4.3. 173
4.4. Общее заключение 174
5. Выводы 180
6. Список литературы
- Функциональная организация системы транспорта Na+ в колее лягушки
- Роль элементов актинового цитоскелета в регуляции активности эпителиальных Ма+-каналов
- Автоматизированная установка фиксации потенциала на колее лягушки
- Влияние агентов, вызывающих реорганизацию микротрубочек, на транспорт Na+ в коже лягушки
Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование механизмов транспорта веществ через биологические мембраны является приоритетным и интенсивно развивающимся направлением современной биофизики, физиологии и медицины. Особый интерес вызывает изучение транспорта ионов в почке, являющейся уникальным органом по разнообразию, интенсивности и избирательности транспортных процессов, а также по многообразию механизмов их селективного регулирования. Ведущую роль в поддержании функциональной способности почки и ряда других эпителиальных тканей (основной составляющей которых является поляризованная клетка, асимметричная по своим структурным и функциональным характеристикам) играют различные транспортные процессы, осуществляемые при участии клеточных мембран. Ряд серьезных технических трудностей, возникающих при проведении экспериментов по исследованию деятельности почек в условиях in vivo, предопределил широкое применение различных модельных объектов для изучения транспорта веществ через эпителиальные клетки.
Классическими модельными объектами для исследования механизмов транспорта ионов через биологические мембраны являются кожа и мочевой пузырь амфибий. По способности к транспорту электролитов и реакции на некоторые гормоны кожа и мочевой пузырь амфибий сходны с почечными канальцами, что позволяет использовать данные, получаемые на этих объектах, для выяснения механизмов трансэпителиального транспорта воды и ионов в клетках почки.
Активный транспорт Na+ против градиента концентрации характерен для многих типов осморегулирующих эпителиальных тканей. В собирательных трубках почки реабсорбция Na+ является важнейшим механизмом поддержания электролитического и водного гомеостаза, и, следовательно, кровяного давления (Garty, Palmer, 1997; Feraille, Doucet, 2001). Клетки эпителия кожи лягушки также способны аккумулировать Na+ из окружающей среды против градиента концентрации.
В настоящее время общепринятой является двухмембранная модель активного транспорта Na+ эпителиальными клетками, предложенная Кефед-Джонсеном и Уссингом (Koefoed-Johnsen, Ussing, 1958). Согласно двухмембранной модели, в эпителиальной клетке пространственно разделены мембраны, определяющие пассивный вход в клетку Na+ (наружная или апикальная мембрана, в которой локализованы Na+-Kai-ianbi), и мембраны, в которых располагаются натриевые насосы (внутренняя или базолатеральная мембрана, в которой локализованы Ыа+Я .+-АТФазы). При этом электродвижущей силой, генерирующей градиент электрохимического потенциала и обеспечивающей активный транспорт Na+ через эпителий, является №+/К+-АТФаза.
Ведущую роль в транспорте Na+ через эпителиальные системы играют амилорид-чувствительные Na+- каналы (ENaC). ENaC принадлежат к суперсемейству, объединяющему особый тип №+-проводящих ионных каналов, нечувствительных к мембранному потенциалу и блокируемых диуретиком амилоридом. Суперсемейство амилорид-чувствительных №+-каналов обозначается также как Deg/ENaC -суперсемейство (дегенерины/эпителиальные №+-каналы). Дегенерины/эпителиальные №+-каналы универсальны для всех многоклеточных животных (Metazoa) и экспрессируются в различных типах возбудимых и невозбудимых тканей, в которых Deg/ENaC принимают участие в осуществлении таких разнообразных процессов, как болевая чувствительность, механочувствительность, направленный перенос Na+ (Benos, Stanton, 1999; Kellenberger, Schild, 2002). Амилорид-чувствительные №+-каналы были обнаружены также и в тканях беспозвоночных животных (Canessa et al., 1994b).
В последние годы достигнут существенный прогресс в исследовании структуры и топологии в мембране ENaC (Canessa et al., 1994a; Garty, Palmer, 1997; Benos, Stanton, 1999) и №+/К+-АТФазы (Forbush et al., 1978; Blanco, Mercer, 1998), тогда как гормональная и внутриклеточная регуляция этих ведущих компонентов системы транспорта Na+ в эпителиальных клетках, по-прежнему, остается мало изученной. Известно, что активность ENaC и №+/К+-АТФазы в эпителиальных клетках модулируется различными системами внутриклеточной сигнализации: арахидоновои кислотой и продуктами ее окисления (Cantiello et al, 1990; Satoh et al., 1993; Els, Helman, 1997; Carattino et al., 2003; Mies et al, 2004), G-белками (Cantiello et al., 1990), внутриклеточным Ca (Palmer, Frindt, 1987), протеинкиназой С (Line, Eaton, 1989; Gertsberg et al., 1997; Крутецкая и др., 2003), циклическим аденозинмонофосфатом (Marunaka, Eaton, 1991; Prat et al, 1992; Brodin et al., 1996), протеинкиназой A (Aceves, 1977; Els, Helman, 1991; Marunaka, Eaton, 1991; Garty, Palmer, 1997), тирозинкиназами (Rodricuez-Commes et al, 1994; Feraille et al., 1997).
Известно, что цитоскелет играет ведущую роль в процессах секреции, абсорбции, межклеточного взаимодействия и деления клеток. В последнее время появляется все больше данных о важной роли элементов цитоскелета в регуляции транспорта Na в различных реабсорбирующих эпителиях (Els, Ghou, 1993; Cantiello, 1995; Berdiev et al., 1996; Manunta et al., 1997; Rehn et al., 1998). Однако, несмотря на интенсивные исследования в этой области, механизмы, посредством которых осуществляется регуляторное действие цитоскелета на транспорт Na+ в эпителиальных клетках, в настоящее время неизвестны. Кроме того, данные об участии элементов цитоскелета в регуляции транспорта Na+ получены, преимущественно, в экспериментах на клеточных культурах, тогда как влияние цитоскелета на транспорт Na+ в нативных эпителиях менее изучено.
Показано, что в различных эпителиальных системах важную роль в регуляции транспорта Na+ многими гормонами и фармакологическими агентами играет фосфоинозитидная система передачи сигнала. Кроме того, во многих эпителиальных тканях, в том числе в эпителии колеи и мочевого пузыря амфибий, при участии фосфоинозитидного пути регулируется не только активность различных компонентов транспорта Na+, но и модулируется регуляторное воздействие на них некоторых других сигнальных систем (Civan et al., 1985, 1989; Mauro et al., 1987). В то лее время, роль ключевых компонентов фосфоинозитидной системы в регуляции транспорта Na+ в колее лягушки изучена недостаточно полно.
В связи с этим, представлялось целесообразным исследовать роль элементов цитоскелета и ключевых компонентов фосфоинозитидного пути передачи сигнала в регуляции транспорта Na+ в колее лягушки, а также определить их возможное участие в регуляции транспорта Na+ инсулином, который (наравне с альдостероном и антидиуретическим гормоном) играет валеную роль в регуляции транспорта Na+ в различных эпителиальных тканях.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании роли валенейших сигнальных систем и элементов цитоскелета в регуляции транспорта Na+ в колее лягушки. Для достилеения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:
1. С использованием широкого спектра фармакологических агентов, изменяющих динамическое состояние филаментов, определить влияние на транспорт Na+ различных систем цитоскелета, таких как микротрубочки и микрофиламенты.
2. С помощью специфических активаторов и ингибиторов протеинкиназы С и фосфатидилинозитолкиназ выяснить роль этих компонентов фосфоинозитидного пути передачи сигнала в регуляции транспорта Na+.
3. Исследовать влияние инсулина на транспорт Na+ и выявить возмоленые механизмы, опосредующие регуляторное действие гормона на различные компоненты системы транспорта Na+ в коже лягушки.
Научная новизна работы. С помощью широкого спектра фармакологических агентов, влияющих на организацию различных систем цитоскелета, выявлена важная роль микротрубочек и микрофиламентов в регуляции транспорта Na+ в коже лягушки. Впервые показано, что агенты, стабилизирующие микротрубочки (таксол) или микрофиламенты (фаллоидин), подавляют трансэпителиальный транспорт Na+. Впервые установлено также, что агенты, индуцирующие деполимеризацию микротрубочек (колхицин, колцемид, винбластин), существенно снижают транспорт Na+ в коже лягушки.
Впервые исследовано возможное участие фосфоинозитид-специфических киназ в регуляции транспорта Na+ в коже лягушки. С применением эффективного ингибитора фосфатидилинозитол 3- и фосфатидилинозитол 4-киназ вертманнина, показана важная роль этих киназ в модуляции транспорта Na+.
Полученные данные о модифицирующем влиянии структурно-функциональной организации цитоскелета на регуляцию фосфатидилинозитолкиназами транспорта Na+ в коже лягушки являются приоритетными для реабсорбирующих эпителиев.
Впервые показано, что в коже лягушки стимулирующее действие инсулина на транспорт Na+ опосредуется фосфатидилинозитолкиназами.
Впервые проведено сравнительное исследование механизмов регуляции транспорта Na+ в коже лягушки и головастика. Показано, что ведущие компоненты фосфоинозитидного пути передачи сигнала протеинкиназа С и фосфатидил-инозитолкиназы играют важную роль в регуляции транспорта Na+ в коже головастика и лягушки.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание механизмов регуляции направленного переноса ионов в реабсорбирующих эпителиальных тканях, а также существенно расширяют имеющиеся представления о механизмах регуляции транспорта Na+ в коже лягушки - классическом модельном объекте для изучения механизмов действия на мембранный транспорт различных гормонов и фармакологических агентов.
Получены новые данные, свидетельствующие в пользу существования в коже лягушки функциональной взаимосвязи между ENaC и структурами цитоскелета, ранее показанной для некоторых других типов эпителиальных тканей. При этом динамические перестройки цитоскелета могут рассматриваться как один из важных механизмов регуляции активности ENaC и транспорта Na+ в коже лягушки.
Результаты о зависимости влияния фосфатидилинозитолкиназ на активность ENaC и транспорт Na+ в коже лягушки от структурно-функциональной организации цитоскелета имеют принципиальную значимость для понимания механизмов регуляции активности ENaC в эпителиальных клетках, а также для выяснения путей взаимодействия и взаимовлияния в этом процессе различных сигнальных систем.
Данные о влиянии протеинкиназы С и фосфатидилинозитолкиназ на транспорт Na+ в коже головастика и лягушки представляют особый интерес, так как впервые исследуется функциональная преемственность системы транспорта Na+ в коже головастиков и взрослых амфибий.
Новые данные о роли фосфатидилинозитолкиназ в регуляции инсулином транспорта Na+ в коже лягушки, существенно дополняют сведения о возможных механизмах регуляции этим гормоном транспорта Na+ в эпителиальных тканях.
Сопоставление данных, полученных в ходе исследования, с результатами экспериментов на клеточных культурах, дает ценную информацию о работе клеток эпителия и механизмах регуляции трансэпителиального транспорта ионов при действии биологически активных веществ.
Данные о влиянии инсулина и фармакологических агентов на транспорт Na+ в осморегулирующих эпителиях имеют не только теоретическое, но и большое практическое значение для медицины и фармакологии, и могут быть использованы для скрининга новых эффективных лекарственных средств.
Результаты исследования используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре биофизики биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на: Междисциплинарной конференции с международным участием "Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека" ("НБИТТ-21"), Петрозаводск, 2002; 5-ой, б-ой и 7-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье", С.-Петербург, 2002, 2003, 2004; XIX съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004; Международных конференциях "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пущино, 2003, 2005; International symposium "Biological Motility", Pushchino, 2004; III съезде биофизиков России, Воронеж, 2004; Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина", С.-Петербург, 2005; V Сибирском физиологическом съезде, Томск, 2005; I съезде физиологов СНГ "Физиология и здоровье человека", Сочи, 2005; а также на заседаниях кафедры биофизики Санкт-Петербургского государственного университета и научных семинарах лаборатории биофизики клетки ФНИИ им. А.А. Ухтомского.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, результатов исследования и их обсуждения, общего заключения и списка литературы, включающего 370 наименований, и приложения. Работа иллюстрирована 70 рисунками и 16 таблицами.
Функциональная организация системы транспорта Na+ в колее лягушки
Существует несколько моделей, описывающих механизм активного транспорта ионов Na+ эпителиальными клетками (Cereijido, Rotunno, 1968; Krogh, 1938; Guo et al., 2003), однако, в настоящее время общепринятой является двухмембранная модель транспорта Na+, предложенная Кефед-Джонсеном и Уссингом (Koefoed-Johnsen, Ussing, 1958), и, в дальнейшем, модифицированная Уссингом и Виндхагером (Ussing, Windhager, 1964). Схема двухмембранной модели Кефед-Джонсена и Уссинга представлена на рис. 2а.
В двухмембранной модели постулирован основополагающий принцип организации транспортирующих эпителиев, согласно которому пространственно разделены клеточные мембраны, определяющие пассивную проницаемость для входа Na+ в клетку, и мембраны, в которых располагаются натриевые насосы, генерирующие градиент электрохимического потенциала и обеспечивающие активный транспорт ионов Na+ через эпителий.
Согласно современным представлениям, ионы Na+ пассивно входят в клетку по каналам, расположенным в наружной (апикальной) мембране и удаляются из клетки при помощи Ыа+/К+-АТФазы, локализованной во внутренней (базолатеральной) мембране а- Схема двухмембранной модели транспорта Na+ в коже лягушки. Outside- внешняя среда; Inside- внутренняя среда; Cell- внутриклеточная среда; О.ст.- апикальная (наружная) клеточная мембрана; I.e.т.- базолатеральная (внутренняя) клеточная мембрана (по Koefoed-Johnsen, Ussing 1958); б- функциональная организация основных клеток, в- функциональная организация БМ клеток у-типа, специализированных для трансэпителиального транспорта ионов СГ. Наклонными стрелками на схемах обозначены пассивные потоки ионов; Р или АТР- активный транспорт при помощи Na /К -АТФазы или -помпы; пустым кружком обозначены электронейтральные анионные обменники (по Larsen, 1991). эпителиальных клеток. Ионы К активно транспортируются Na /К -АТФазой внутрь клетки, и выводятся в межклеточное пространство по К+-селективным каналам, также расположенным в базолатеральной мембране. Такое асимметричное распределение переносчиков обеспечивает активный перенос Na через эпителий и генерирует трансэпителиальный потенциал, который может быть использован для реабсорбции противоположно заряженных ионов, секреции катионов и транспорта воды.
К+-каналы, расположенные в базолатеральной мембране клеток эпителия кожи лягушки относятся к типу К+-каналов входящего выпрямления (Kjr), активность которых зависит от внутриклеточной концентрации АТФ (Nagel, 1985; Urbach et al., 1994, 1996). Проводимость Kjr в физиологических условиях составляет 15 пСм (Urbach et al., 1994). Активность данного типа каналов стимулируется альдостероном и ингибируется ионами Ва2+, ЕҐ, хинидином, толбутамидом (Urbach et al., 1994, 1996).
В апикальной мембране эпителиальных клеток кожи лягушки также локализованы К+-каналы, которые, однако, по своим биофизическим характеристикам отличаются от К+-каналов, расположенных в базолатеральной мембране (Van Driessche, 1984; Van Driessche, Zeiske, 1980). Предполагается, что К+-каналы апикальных мембран служат для выведения ионов К+ и важны для поддержания К+ гомеостаза (Zeiske, Van Driessche, 1980). Однако по своим характеристикам они отличаются также и от К;г1.1 (ROMK1) каналов, обнаруженных во многих типах реабсорбирующих эпителиев, в том числе в клетках CCD крысы (Frindt, Palmer, 1989; Xu et al., 1997) и некоторых сегментах нефрона (Wang et al., 1997), и которым принадлежит важная роль в осуществлении секреции ионов К+.
Апикальная электродиффузия, являющаяся лимитирующим этапом трансэпителиального транспорта Na+, осуществляется через ионные каналы, имеющие очень высокую селективность для ионов Na+ и Li+ по отношению к ионам К+, и чувствительные к диуретику амилориду и его производным. По структурно-функциональной организации и биофизическим свойствам Na+- проводящие каналы в эпителиальных тканях отличаются от потенциал-зависимых Na+ каналов, и объединяются в особый тип Na+ каналов - суперсемейство дегенерины/эпителиальные Na+ каналы (Deg/ENaC). Структура и функции ENaC будут подробно рассмотрены в разделе 2.2.
Несмотря на то, что как основные, так и БМ клетки эпителия кожи лягушки способны активно транспортировать ионы Na", они представляют собой разные транспортные единицы, специализированные для выполнения различных функций (см. рис. 2 б, в), и не сообщающиеся друг с другом посредством щелевых контактов (Larsen, 1991).
Основные клетки специализированы для осуществления трансэпителиального переноса Na+ и выведения ионов К . Вероятно, основные клетки не принимают участие в осуществлении трансэпителиального транспорта ионов СГ, так как апикальные мембраны основных клеток практически непроницаемы для этих ионов (Ussing, 1982; Larsen, 1991). Обмен ионов СГ между основными клетками и межклеточным веществом осуществляется при участии различных переносчиков, расположенных в базолатеральной мембране (см. рис. 2 б), и является важным механизмом поддержания клеточного объема (Ferreira, Ferreira, 1981; Ussing, 1982). В базолатеральных мембранах основных клеток эпителия кожи и мочевого пузыря амфибий располагаются потенциал-зависимые СГ каналы с низкой селективностью для анионов (Ussing, 1988). Ведущую роль в поддержании СГ гомеостаза в основных клетках играет котранспортная система со стехиометрией 1 Na+: 2 СГ: 1 К+, активность которой зависит от градиента концентрации ионов Na+ (Ferreira, Ferreira, 1981; Ussing, 1982).
Богатые митохондриями клетки эпителия кожи и мочевого пузыря амфибий, а также собирательных трубок дочки позвоночных, представлены несколькими типами клеток, выполняющими различные функции. Так, а- и Р-БМ клетки участвуют в поддержании кислотно- щелочного баланса (Levine, Jacobson, 1986; Steinmetz, 1986), тогда как у-БМ клетки осуществляют трансэпителиальный транспорт ионов СГ (Larsen, 1991).
Характерной особенностью у-типа БМ клеток является высокая проницаемость апикальной мембраны для ионов Na+ (3.6 х 10" см/сек), несвойственная для других типов БМ клеток (Larsen, 1991). Ионы СГ транспортируются в клетку пассивно по градиенту электрохимического потенциала, генерируемого системой трансэпителиального транспорта Na+, через потенциал- зависимые СГ-каналы, расположенные в апикальной мембране (Harck, Larsen, 1986) (см. рис. 2в). В нормальных условиях пассивный транспорт является основным механизмом трансэпителиального транспорта ионов СГ в коже лягушки, однако, возможен, также и активный транспорт ионов СГ (Krogh, 1937; Kristensen, 1972).
Роль элементов актинового цитоскелета в регуляции активности эпителиальных Ма+-каналов
Ионный канал типа ENaC образован тремя гомологичными субъединицами, соответственно а-, (3-, и y-ENaC, примерно на 35% совпадающими между собой по составу аминокислот (Canessa et al., 19946). Недавно были клонированы ещё две - 5- и є-субединицы, которые по аминокислотному составу ближе к а-, чем к (3- или у-субъединицам ENaC (Kellenberger, Schild, 2002). Субъединицы ENaC содержат от 632 до 698 аминокислотных остатков, молекулярная масса субединицы составляет 90 кДа (Benos, Staton, 1999).
Все представители суперсемейства Deg/ENaC характеризуются сходным строением субъединиц и топологией в плазматической мембране. Организация и топология в мембране субъединицы ионного канала типа Deg/ENaC показана на рис. 4. Каждая субъедиица образована четырьмя различающимися по структуре и функциям доменами: цитоплазматическим N-концом, двумя короткими гидрофобными трансмембранными сегментами (Ml и М2), крупной экстраклеточной петлей, и цитоплазматическим С-концом (Canessa et al., 19946; Schild et al., 1997; Benos, Stanton,1999). Наличие крупного экстраклеточного фрагмента (50 к Да), на который приходится до 70% аминокислотного состава субъединицы, является характерным структурным отличием ионных каналов типа Deg/ENaC (Canessa et al., 1994a; Benos, Stanton, 1999; Kellenberger, Schild, 2002).
В составе субъединиц Deg/ENaC обнаружены участки, консервативные по аминокислотному составу (рис. 5). Одни фрагменты являются едиными для всех представителей данного суперсемейства, другие консервативны только внутри представителей отдельных его ветвей. Подобные фрагменты являются важными структурными элементами, необходимыми для нормального функционирования канала.
Полностью консервативными для всех представителей Deg/ENaC являются следующие фрагменты: трансмембранные домены Ml и М2; His94-Giy (HG) фрагмент в составе пишплазматического N-тер ми пального домена; пост-М1 (post-Mi) участок аминокислот, следующий непосредственно за первым трансмембранным доменом Ml; богатые цистеином фрагменты (CRD I - III) в составе экстраклеточного домена; пре-М2 (ргс-М2) участок гидрофобных аминокислот, располагающийся непосредственно перед вторым трансмембранным доменом М2. В составе пре-М2 сегмента выделяют "deg -фрагмент, принимающий участие в воротных функциях канала.
Некоторые аминокислотные фрагменты консервативны только среди представителей различных ветвей суперсемейства Deg/ENaC. Для представителей подсемейства ENaC подобным фрагментом является богатый пролином PV—сегмент в составе цитоплазматического С-терминального домена а-, р -, и -субъединиц ENaC. Для представителей подсемейства дегенерипы консервативными являются расположенные в экстраклеточном домене богатый цистеином CRD І фрагменти регуляторний I All) фрагмент (по Kellenberger, Schild. 2002).
Некоторые из них участвуют в формировании проводящего пути канала (пре-М2 и М2 сегменты) (Kellenberger, Schild, 2002), другие определяют воротные функции канала (HG и DEG сегменты) (Kellenberger et al., 2002). Богатые цистеином фрагменты CRD II и CRD III, локализованные в экстраклеточной петле, вовлечены в поддержание третичной структуры этого крупного домена (Firsov et al., 1999).
Для представителей подсемейства ENaC характерно наличие высоко консервативной богатой пролином последовательности аминокислот (PPPXY) или PY-сегмента в составе цитоплазматического С-терминального домена трех (а-, р-, и у-) субъединиц ENaC (Benos, Stanton, 1999; Kellenberger, Schild, 2002). PY-сегмент отвечает за связывание канала с убиквитиновой лигазой Nedd 4 (neuronal precursor cell developmentally downregulated protein 4). Делеция этого фрагмента приводит к ингибированию деградации канала и увеличению макроскопического Na+Oi a (Price, Welsh, 1999).
Наиболее вероятно, что нативный ENaC представляет собой гетеротетрамер, образованный 2а, 13 и 1у гомологичными субъединицами, располагающимися вокруг поры канала, причем две а-субъединицы располагаются напротив друг друга (Canessa et al., 1994а; Firsov et al., 1998; Eskandari et al., 1999). Модель тетрамерной организации ENaC представлена на рис. ба. Описана также нонамерная организация ENaC, со стехиометрией субъединиц За;33;3у (Snyder et al., 1998). Однако в настоящее время не существует модели, описывающей строение поры нонамерного ENaC канала.
Согласно тетрамерной модели организации ENaC, все три субъединицы (а, Р и у) участвуют в формировании поры канала и определяют все важнейшие его характеристики: проводимость, селективность, воротные функции и взаимодействие с блокаторами. Модель поры тетрамерного канала показана на рис. 66.
Наружное устье поры образовано пре-М2 сегментами всех субъединиц ENaC канала. В наиболее широкой части его диаметр равен 5 A0 (Kellenberger, Shild, 2002). По мере сужения устья поры последовательно располагаются DEG-сайт (aSer576, BSer518, ySer530), необходимый для осуществления воротных функций канала, и сайт связывания блокатора канала - амилорида (aSer583, BGly525, yGly537).
а - Стехиометрия и взаимное расположение субъединиц ENaC; показаны три гомологичные субъединицы ENaC - а, р и у, принимающие участие в формировании центральной поры канала (по Kellenberger, Shild, 2002).
б - Гипотетическая модель поры ENaC; показаны пре-М2 сегменты двух а субъединиц (правой и левой) и р субъединица на заднем плане. Четвертая - у-субъединица, расположенная на стороне зрителя, не показана. Наружное устье поры формируют пре-М2 сегменты, в которых располагаются: наружный (экстраклеточный) воротный домен - DEG сайт (S576) и участок связывания амилорида - amiloride binding site (S583). Селективный фильтр канала (аминокислотные остатки G587 и S589), в котором показан ион Na+, образуют С-терминальные сегменты пре-М2 домена и первые аминокислотные остатки N-терминального сегмента трансмембранного М2 домена. Цитоплазматическая часть поры образована С-терминальным сегментом М2 домена. На N-терминальном домене двух а-субъединиц показан внутренний (цитоплазматический) воротный домен - HG. Буквами S, G и Н обозначены остатки серина, глицина и гистидина, соответственно. Номера аминокислотных остатков указаны для а-субъединиц (по Snyder et al., 1999).
Автоматизированная установка фиксации потенциала на колее лягушки
Для регистрации вольт-амперных характеристик кожи лягушки использовали один из наиболее адекватных биофизических методов исследования - метод фиксации потенциала на мембране (voltage - clamp method). Эквивалентная электрическая схема фиксации потенциала на коже лягушки представлена на рис. 30.
В установке фиксации потенциала используется двухэлектродная схема задания потенциала на мембране. Схема содержит два дифференциальных усилителя, охваченных глубокой отрицательной обратной связью. Усиление каждого из усилителей без обратной связи имеет типовое значение 10э - 10б. Напряжение (постоянное или линейноизменяющееся) от задающего источника (управляющая ЭВМ) через преобразователь код - напряжение (ПКН, 16 разрядов) подаётся на неинвертирующий вход операционного усилителя Уг. В точке А схемы это напряжение повторяется с высокой точностью. Это достигается благодаря использованию двух электродов (отводящего Э21 и раздражающего Эгг), что в значительной степени исключает влияние падения напряжения на сопротивлении электрода Эгг- Напряжение в точке В повторяет потенциал общего провода схемы (так как неинвертирующий вход усилителя У/ заземлён). Это также обеспечивается использованием двух электродов (отводящего Эц и раздражающего Эп) Входное сопротивление схемы в точке А и в точке 5-4-0. Усилитель У/ работает в режиме преобразования тока, поступающего в точку В, в выходное напряжение, регистрируемое ЭМВ с помощью преобразователя напряжение-код (ПНК, 16 разрядов). Напряжение на выходе усилителя У/ определяется по формуле: Увых — 1 \I\oc\ -г КЭ\г) з где лос j _ сопротивление обратной связи усилителя VI, В-эп - сопротивление электрода Эп. Ток короткого замыкания - это ток, протекающий через кожу, когда напряжение на коже равно 0. Это достигается посредством выравнивания потенциалов в точках А я В (UA=UB=0).
Для измерения вольт-амперных характеристик на кожу подавали линейноизменяющееся напряжение (ramp) со скоростью 20 мВ/с. В интервалах между измерениями вольт-амперных характеристик трансэпителиальный потенциал (VT) кожи поддерживали при 0 мВ (режим короткого замыкания) или при потенциале открытой цепи, Voc (Voc = VT при трансэпителиальном токе IT = 0). Из вольт-амперных характеристик определяли электрические параметры кожи: ток короткого замыкания Isc (Isc = IT при VT = 0), потенциал открытой цепи (Voc), трансэпителиальную проводимость (gt). gT рассчитывали по наклону вольт-амперной характеристики (Д1т / AVT) (Schoen, Erlij, 1985, 1987). Трансэпителиальный транспорт Na+ оценивали как амилорид-чувствительный ток короткого замыкания Isc (Bently, 1968; Schoen, Erlij, 1985, 1987).
Всю получаемую в ходе опыта информацию (вольт-амперные характеристики, электрические характеристики кожи лягушки) регистрировали с помощью ЭВМ с использованием оригинального программного обеспечения.
С обеих сторон кожи добавляли раствор Рингера для холоднокровных, содержащий (в мМ): 110 NaCl, 2.5 КС1, 3 СаС12, 5 Tris НС1. рН раствора - 7.4.
В экспериментах, использовали реактивы фирмы Sigma (США). Маточные растворы РМА (100 мкг/мл), 1-(5-изохинолин сульфонил)-2-метил-пиперазина (Н-7) (50 мМ), хелеритрина (1,5 мМ), генистейна (100 мМ), фаллоидина (10 мМ), таксола (25 мМ), дигидроцитохалазина В (10 мМ), цитохалазина В (4 мг/мл), латрункулина В (5 мМ) и вертманнина (1 мМ) готовили в диметилсульфоксиде. Маточные растворы колцемида (25 мМ) и колхицина (25 мМ) готовили в спирте. Маточные растворы винбластина (25 мМ), ортованадата Na (10 мМ) и амилорида (10 мМ) готовили на воде. Использовали свиной инсулин (24 ед/мл). Фармакологические агенты добавляли к апикальной или базолатеральной поверхности кожи.
В конце каждого эксперимента в раствор, омывающий апикальную поверхность кожи, добавляли блокатор ENaC амилорид (20 мкМ). Известно, что в концентрациях 20 -100 мкМ амилорид действует избирательно на ENaC (Bentley, 1968; Benos et al., 1995; Rytvedetal., 1995,1996).
На рисунках в главе 4 приведены результаты типичных экспериментов. Статистический анализ проводили с применением t-критерия Стьюдента. Результаты представлены в виде - среднее ± ошибка среднего.
Для исследования возможной роли микротрубочек (МТ) в регуляции транспорта Na в коже лягушки мы использовали два различных типа тубулин-связывающих агентов: агенты, стимулирующие деполимеризацию МТ (колхицин, колцемид, винбластин), и МТ-стабилизирующий агент (таксол).
Известно, что алкалоиды безвременника осеннего (Colchicum autumnale) колхицин и колцемид индуцируют деполимеризацию МТ путем образования эквимолярного комплекса с молекулами свободного (3-тубулина, взаимодействие которого с полярными концами МТ препятствует как росту, так и разборке МТ (Bergen, Borisy, 1983; Mitchison, Kirschner, 1984). Колхицин и колцемид связываются с одним и тем же участком тубулинового димера, отличным от связывающего участка, с которым взаимодействуют алкалоиды Vinca rosea - винбластин и винкристин (Фултон, 1987). Кроме того, винбластин и винкристин способны индуцировать деполимеризацию МТ как путем непосредственного взаимодействия молекул алкалоида с полимерными МТ, так и путем образования промежуточного комплекса со свободным [3-тубулином, вызывая образование паракристаллических агрегатов тубулина (Dumontet, Sikic, 1999).
Влияние агентов, вызывающих реорганизацию микротрубочек, на транспорт Na+ в коже лягушки
Полученные данные свидетельствуют о том, что влияние РМА на Isc в коже лягушки Rana temporaria не является видоспецифичным, а отражает общую тенденцию ответа эпителиальных клеток кожи лягушки на добавление форболовых эфиров. Наиболее вероятно, что влияние РМА на транспорт Na+ связано с его способностью активировать ПКС. Однако имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что не все клеточные эффекты форболовых эфиров опосредуются активацией ПКС. Возможно, что стимулирующий эффект форболовых эфиров на транспорт Na+ связан с их способностью стимулировать метаболизм арахидоновой кислоты с последующим высвобождением простагландинов и увеличением внутриклеточного уровня цАМФ, которое приводит к активации ENaC, как это показано для некоторых гормонов, например альдостерона и вазопрессина (Chalfant et al, 1996; Garty, Palmer, 1997).
Для подтверждения того, что стимулирующее влияние РМА на транспорт Na+ в коже лягушки Rana temporaria действительно связано с активацией ПКС, мы использовали два специфических ингибитора этого фермента - хелеритрин (Herbert et al., 1990) и соединение Н-7 (1-(5-изохинолин сульфонил)-2-метил-пиперазин) (Hidaka et al, 1984; Kawamoto, Hidaka, 1984).
На рис. 45 представлена кинетика изменения Isc в коже лягушки при последовательном добавлении со стороны апикальной поверхности кожи ингибиторов ПКС и РМА. В каждом случае предварительная инкубация кожи лягушки с хелеритрином (10 мкМ) или соединением Н-7 (50 мкМ) в течение 35-40 мин существенно снижает стимулирующее влияние РМА.
В серии из 10 экспериментов для обоих ингибиторов ПКС были получены следующие данные. Возрастание величины Isc после комбинированного воздействия на
Одинарная стрелка соответствует моменту введения в раствор: О — 10 мкМ хелеритрина; # — 50 мкМ Н-7; двойная стрелка соответствует моменту введения в раствор 150 нМ РМА; тройная стрелка соответствует моменту введения в раствор амилорида.
кожу лягушки ингибитора и активатора ПКС составляет 19.4 ± 3.3 % (Р 0.01) для хелеритрина и 35.8 ± б.З % (Р 0.01) для соединения Н-7. Из рис. 45 и данных табл. 10 следует, что хелеритрин в большей степени, чем Н-7 предотвращает стимулирующий эффект РМА. Следует отметить, что в некоторых случаях предварительная инкубация кожи лягушки с хелеритрином (10 мкМ) практически полностью предотвращает стимулирующий эффект РМА на транспорт Na+ в коже лягушки (рис. 45 и табл. 10).
Как видно из рис. 45, добавление ингибиторов ПКС вызывает незначительное увеличение Ics- Учитывая то, что активатор ПКС оказывает стимулирующее действие на транспорт Na+, подобное воздействие ингибиторов ПКС на Isc является достаточно неожиданным, однако оно частично согласуется с имеющимися литературными данными. Временное стимулирующее действие различных ингибиторов ПКС на Isc показано для различных типов эпителиев: клеток А6 (Awayda et al., 2002) и эпителия кожи и мочевого пузыря амфибий (Chalfant et al, 1996). В то же время, для клеток Аб показано также и ингибирующее действие на Isc ингибиторов ПКС (Rokaw et al., 1996). Снижение стимулирующего влияния другого форболового эфира ТРА (12 -О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата) на Isc при действии ингибиторов ПКС (стауроспорна, Н-7 и хелеритрина) было показано также для некоторых других видов лягушек: Rana pipiens, Rana catesbeiana и жабы Bufo marinus (Chalfant et al., 1996).
В пользу того, что стимулирующее влияние форболовых эфиров на транспорт Na+ в коже лягушки опосредуется активацией ПКС, могут также свидетельствовать следующие экспериментальные факты.
1. Две синтетические формы диацилглицерола, физиологического активатора ПКС, также стимулируют Isc через кожу лягушки Rana pipiens (Civan et al., 1987);
2. Константа Михаелиса (Км) для стимулирующего влияния ТРА на Isc в коже лягушки составляет приблизительно 3 нМ; такая высокая чувствительность показывает, что данный феномен не может являться результатом простого неспецифического взаимодействия форболового эфира с плазматической мембраной (Mauro et al., 1987).
3. Эйкозатетраиновая кислота, ингибирующая циклооксигеназный, липоксигеназньш и эпоксигеназныи пути окисления арахидоновои кислоты, а также блокатор циклооксигеназного пути окисления арахидоновои кислоты индометацин, не оказывают влияния на стимулирующий эффект ТРА на транспорт Na+ в коже лягушки (Civan et al., 1985; Mauro et al., 1987; Chalfant et al, 1996); Таким образом, результаты наших экспериментов и перечисленные данные литературы позволяют сделать вывод о том, что эффект РМА на трансэпителиальный транспорт Na в коже лягушки Rana temporaria действительно обусловлен активацией ПКС.
Фосфорилирование ионных каналов различными протеинкиназами является одним из важнейших механизмов регуляции их активности. Известно, что ПКС регулирует активность потенциалзависимых №+-каналов путем прямого фосфорилирования от 2 до 8 различных участков а-субъединицы канала (Numann et al., 1994; Catterall, 1996; Marban et al, 1998). В то же время, механизм, посредством которого ПКС модулирует активность ENaC, остается неясным.
Фосфорилирование белков ENaC протеинкиназой С может изменять вероятность открытого состояния и плотность ENaC. Обнаружено, что все три субъединицы (а, Р и у) ENaC содержат участки, которые фосфорилируются ПКС (Canessa et al., 19946; Benos, Stanton, 1999), однако в различных эпителиальных системах это фосфорилирование по-разному влияет на функциональные характеристики ENaC. Так, для №+-канала из клеток почки, встроенного в бимолекулярные липидные мембраны, показано прямое фосфорилирование ПКС, которое сопровождается уменьшением вероятности открытого состояния канала (Oh et al., 1993). В клетках линии А6 активация ПКС при действии РМА приводит к уменьшению вероятности открытого состояния и плотности ENaC (Ling, Eaton, 1989; Els et al., 1998). В то же время на коже лягушки Rana pipiens pipiens обнаружено, что вызванная РМА стимуляция транспорта Na" сопровождается увеличением плотности ENaC в апикальной мембране, а вероятность открытого состояния каналов при этом практически не меняется (Els et al., 1998).
Можно предположить, что стимулирующее или ингибирующее влияние ПКС на транспорт Na и функциональные характеристики Ш+-каналов связано с существованием разных изоформ ПКС в различных эпителиальных системах. Это согласуется с данными о том, что в мочевом пузыре жабы и клетках линии Аб (для которых показано ингибирование Isc при активации ПКС форболовыми эфирами) присутствует, преимущественно, Са2+ -зависимая кПКСа (Schlondorff, Levine, 1985; Awayda et al., 2002), в то время как в коже лягушки (для которой показано стимулирующее действие форболовых эфиров на Isc) идентифицированы Са2+-независимые изоформы ПКС (Civan etal., 1991).
