Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Жтературбый обзор 8
1. Процессы электронного транспорта в хлоропластах 8
2. Сопряжение электронного транспорта и фотофосгоорилирования 18
3. Постановка задачи 25
Глава 2. Настройка эксперимента. 27
1. Объект исследования 27
2. Измерение фотоиндуцированных изменении рН и поглощения кислорода хлоропластами 29
3. Измерение окислительно-восстановительных превращений реакционных центров Р700 33
4. Применение спиновых зондов 38
Глава 3. Влияние шшрагуры на кинетику электронного транспорта, перенос протонов и фотазосфошироваше в хлоропластах 47
1. Введение 47
2. Влияние температуры на фотоиндуцируемое поглощение протонов хлоропластами и кинетику выхода протонов из хлоропластов 50
3. Влияние температуры на скорость фотофосфорилирования. 61
4. Влияние температуры на скорость нециклического электронного транспорта и эффективность сопряжения электронного транспорта и фотофосфорилирования в хлоропластах. 69
Глава 4. Влияние интенсивности света на кгшешу электрон-ного транспорта, перенос протонов и йотшос(юишроваше в хлоропластах 74
1. Введение 74
2. Влияние интенсивности света на кинетику переноса электронов между фотосистемами 74
3. Влияние интенсивности света на эффективность сопряжения электронного транспорта с фотофосфорилнрованием 89
4. Влияние интенсивности света на фотоиндуцированное поглощение протонов хлоропластами и фотофосфорилирование 93
Глава 5. Спинового зонда тешоамин в качестве индикатора поглощения протонов хлоропластами 98
1. Введение .98
2. Распределение ТА между внешним и внутренним объема ми тилакоида 100
3. Фотоиндуцированное поглощение тешоамина хлоропластами 107
Глава 6. Влияние nh4ci на кинетику электронного транспорта, перенос протонов и фотшосбюрилирование в хлоропластах .121
1. Введение 121
2. Влияние NH^CI на кинетику электронного транспорта, перенос протонов и фотоиндуцированные изменения потенциала внешней поверхности тилакоидной мембраны 123 3. Влияние NH^CI на скорость фотофосфорилирования .134
Заключение 137
Выводы 139
Литература 142
- Сопряжение электронного транспорта и фотофосгоорилирования
- Измерение фотоиндуцированных изменении рН и поглощения кислорода хлоропластами
- Влияние температуры на фотоиндуцируемое поглощение протонов хлоропластами и кинетику выхода протонов из хлоропластов
- Влияние интенсивности света на кинетику переноса электронов между фотосистемами
Введение к работе
Постановка проблемы, ее актуальность. Одной из важнейших задач современной биофизики является выяснение механизмов преобразования энергии в растительной клетке. В ряду наиболее актуальных проблем биоэнергетики, решение которых имеет первостепенное значение для понимания молекулярных механизмов трансформации энергии в биомембранах, стоит задача выяснения механизмов регуляции процессов сопряжения между энергодонорными и энергоакцепторными реакциями в хлоропластах - энергопреобразующих органеллах растительной клетки. Решение данной задачи имеет непосредственное отношение к выявлению фундаментальных принципов и закономерностей преобразования энергии в растительной клетке, а также представляет определенный интерес для практики.
Процессы преобразования энергии в растительной клетке связаны с фотоиндуцированньш электронным и протонным транспортом, компоненты цепи которого локализованы в мембранах хлоропластов. Механизмы сопряжения электронного, протонного транспорта и фотофос-форилирования изучены в настоящее время еще недостаточно. Изучение таких механизмов позволяет получить дополнительную информацию о процессах запасания энергии в фотосинтезирующих клетках и о природе первичного макроэрга при запасании энергии, который является источником энергии для синтеза АЇ9?.
Цель и задачи работы. Целью диссертационной работы являлось экспериментальное исследование механизмов регуляции энергетического сопряжения в изолированных хлоропластах бобов. В работе исследовано влияние различных факторов (температура, интенсивность света и т.д.) на эффективность сопряжения энергодонорной реакции (электронный транспорт, перенос протонов) и энергоакцепторной реакции (синтез АТШ). Для этого было необходимо в различных экспериментальных условиях изучить взаимосвязь между скоростью синтеза АТШ и процессами фотоиндуцированного электронного и протонного транспорта, оценить роль фотоиндуцированных изменений поверхностного потенциала тилакоидной мембраны и трансмембранной разности рН ( дрН) в процессах энергетического сопряжения. В связи с этим возникла также проблема адекватности различных методов измерения ДрН.
Научная новизна работы. Основные результаты диссертации являются новыми и оригинальными. Впервые в одних и тех же экспериментальных условиях, на одних и тех же образцах хлоропластов проведено измерение скорости синтеза АТ и кинетических параметров ряда других процессов в широком интервале условий эксперимента. Это позволило выявить вклад различных факторов, влияющих на скорость синтеза АТФ. В частности, показано, что скорость фосфорили-рования в широком интервале условий эксперимента определяется, главным образом, скоростью фотоиндуцированного электронного транспорта и состоянием ATS-синтетазы, при этом фосфорилирование может происходить при незначительной величине трансмембранной разности рН ( дрН). Доказано, что измерение дрН различными методами (по скорости электронного транспорта и по распределению рН-инди-катора) может приводить к различным значениям дрН. Получены данные, свидетельствующие о том, что это может быть обусловлено морфологической и функциональной гетерогенностью системы хлоропластов.
Практическое значение "работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание природы энергизованного состояния хлоропластов л - 7 - и могут использоваться в исследованиях проблем биоэнергетики, электронного транспорта и структуры энергопреобразующих мембран. Знание молекулярных механизмов регуляции энергетических процессов в растительной клетке несомненно должно играть важную роль в решении проблемы повышения эффективности фотосинтеза при сравнительном исследовании продуктивности различных сортов сельскохозяйственных культур.
Апробация -работы. Основные результаты диссертации были доложены на Всесоюзной конференции по нитроксилъным радикалам (Черноголовка, 1982), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Ш Советско-Швейцарском симпозиуме (Ташкент, 1983) и на Ломоносовских чтениях МГУ (Москва, 1983).
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в шести публикациях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав с изложением литературных данных и собственного экспериментального материала, заключения и выводов. Диссертация содержит 156 страниц, включая 35 рисунков. Список литературы включает 120 ссылок на работы советских и зарубежных авторов.
ГЖВА І. ЖТЕРА'ІУРНЬЬІ ОБЗОР. І. Процессы электронного транспорта в хлоропластах.
Процессы фотосинтеза модно представить себе как совокупность реаіщий, иншщируемых фотохимическими процессами, в результате которых происходит преобразование энергии света в энергию макро-эргпческих связей. При этом происходит синтез АЖ>, выделение 02 и восстановление НАДФ4", которые используются в реакциях цикла Кальвина, где происходит фиксация С02 "и синтез углеводов /8/. Весь фотосинтетический аппарат растении локализован в хлоропяастах -органеллах растительной клетки. Процессы фотосинтеза можно разделить на две стадии - световую и темновую. Под световой стадией понимают совокупность процессов в хлоропластах, итпщируемых поглощением квантов света /2/ на стадии от поглощения света пигментной матрицей до синтеза АТЄ? и восстановления НАДФ+. В реакциях темновой стадии фотосинтеза происходит синтез углеводов и фиксация СОр.
Характерная структура хлоропластов схематически представлена на рис.1, известно, что светособирающий пигментный комплекс и молекулы-переносчики цепи фотоипдуцированного электронного транспорта находятся в мембранах тилакоидов. Различают тилакоиды гран (образующие стопки тилакоидов - граны) и тилакоиды стромы (которые выходят за пределы гран и являются продолжением тилакоидов гран, см.рис.І). При юизиологических условиях тилакоиды имеют форму дис- ка с характерными размерами: диаметр~5000 А, толщина^ІОО-і-200 А. Внутри одного хлоропласта находится обычно ^ 10 тилакоидов /65/. Реакции цикла Кальвина протекают в матриксе хлоропластов
мембрана матрикс тилакоида гран тилакоида стромы
АДЕм-Р, 5?
Н20 1/2 02+ 2Б+ 2Н+ NADP
Рис.1. Схематическое изображение структурном организации хлоропластов (А) и расположения электронных переносчиков в мембране тилакоида (Б) (согласно /3,55,114/). (см.рис.І). Весь аппарат светособирающего комплекса локализован в мембране тилакоида. На один тилакоид приходится в среднем ~10 молекул пигментов и ~200 электрон-транспортных цепей, так что на каждую цепь приходится ~300-400 молекул пигментов (хлорофилл а , 6, каротиноиды). Каждый реакционный центр снабжен антенными (светособирающими) пигментами /8/.
При поглощении кванта света молекула пигментного комплекса (хлорофилл или вспомогательный пигмент) переходит в возбужденное состояние. В результате їлиграции энергии по пигментному комплексу происходит возбуждение фотохимического реакционного центра, причем вероятность миграции энергии на открытый реакционный центр выше, чем других процессов (флуоресценция, переход в метастабиль-ное триплетное состояние, безызлучательные переходы в тепло и т.д.) /65/. Соединение большой группы молекул хлорофилла (^300* 400) с одним реакционным центром обеспечивает частое его срабатывание даже при слабой интенсивности действующего света. Первичные процессы фотосинтеза в настоящее время интенсивно исследуются /II, 39,119/.
При попадании энергии возбуждения на реакционный центр может произойти первичное разделение зарядов: возбужденный реакционный центр передаст электрон акцептору, и сам перейдет в окисленное состояние /65/. Таким образом происходит образование первичного окислителя и первичного восстановителя. В хлоропластах: имеются реакционные центры двух типов - Р680 и Р700, которые входят в состав различных пигмент-белковых комплексов. Эти комплексы отличаются по структуре, их локализации в хлоропластах, а также тем, что их реакционные центры могут возбуждаться светом с различной длиной волны /ИЗ/. - II -
Электрон-транспортная цепь в хлоропластах представляет собой совокупность молекул-переносчиков различной природы, объединенных в комплексы, перенос электронов между ними осуществляется, как правило, по туннельному механизму либо за счет диффузии подвижных переносчиков (ішастогидрохинон, пластоцианин), либо самих комплексов /42 /. Последовательность переноса электронов от НрО к HAJP4* изображена на рис. I .
Перенос электронов в хлоропластах инициируется двумя фотохимическими реакциями, которые под действием света осуществляют разделение зарядов в реакционных центрах, при этом происходит перенос электрона против градиента окислительно-восстановительного потенциала. Эти реакции осуществляются двумя относительно изолированными фотохимическими системами - фотосистемой І (реаіщионннй центр Р700, пигментная матрица поглощает свет с /\^730 нм) и фотосистемой 2 (реакционный центр Р680, пигментная матрица поглощает свет с А<690 нм) /65/. Известно /65/, что реакционные центры входят в состав пигмент-белковых комплексов и включают в себя систему первичных доноров и акцепторов электрона. Фотосистема I локализована в основном в мембранах тилакоидов стромы, а фотосистема 2 - в мембранах тилакоидов гран /48/.
Рассмотрим основные переносчики в электрон-транспортной цепи хлоропластов.
Система разложения воды локализована внутри мембраны ближе к ее внутренней стороне. Известно, что в процессе разложения вода используются ионы марганца, а также необходимы ионы хлора /3,100/. При разложении двух молекул Н^О в электрон-транспортную цепь выделяются 4 электрона, а во внутритилакоидное пространство - 4Е1" и 0о. Известно, что для разложения двух молекул НрО в системе раз- ложения воды необходимо последовательное накопление четырех окислительных эквивалентов. Компоненты, связывающие систему разложения воды с реакционным центром Р680 в настоящее время полностью не идентксощітрованн. Возможно, что такую йункцшо выполняьэт хиноны /5,83/.
Реакционный центр Р680 имеет окислительно-восстановительный потенциал пары Р680-Р680+, равный +0,81 В, и представляет собой, по-видимому, димер хлорофилла Q /3,65/. Восстанавливается электронами, поступающими из системы разложения воды. Первичным акцептором для Р680, как предполагают, является молекула феофитина (окислительно-восстановительный потенциал -610 мВ). Вторичным акцептором для Р680 (акцептор Q) является молекула связанного плас-тосемихинона. Далее перенос электронов от фотосистемы 2 к фотосистеме I осуществляется с помощью пластохинона /29,83,124/.
Пластохинон выполняет роль трансмембранного переносчика электронов и протонов между фотосистемами. Пластохинон - нейтральный, подвижный переносчик, способный диффундировать внутри мембраны. На каждую электрон-транспортную цепь приходится^7 молекул пластохинона. Каждая молекула пластогидрохинона (полностью восстановленная форма молекулы пластохинона) переносит сразу два восстановительных эквивалента /5,8,29,105/. Восстановление пластохинона до пластогидрохинона фотосистемой 2 сопровождается связыванием с ним двух протонов из внешней среды, а окисление его фотосистемой I происходит на внутренней стороне тилакоидной мембраны при его взаимодействии с (ё-f) комплексом (хинон-цитохром -пластоцианин оксидоредуктаза) /ЕЕ7/. Окисление пластогидрохинона сопровождается выделением двух протонов внутрь тилакоида. Стадия окисления пластогидрохинона с выделением протонов внутрь ти- лакоида - самая медленная реакция в цепи электронного транспорта ( 20 мо).
Цепь электронного переноса в (-/) комплексе включает в себя железосерный белок типа Риске /117/, цитохром и два цитохрома ^563* Ыедьсодар^ащий водорастворимый белок пластощіанин (окислительно-восстановительный потенциал +0,35 В) является связующим звеном между (-Я комплексом и фотосистемой I /117/.
Окончательно работа пластохинонового участка цепи переноса электронов не выяснена. Имеется, в частности, предположение о функції онггровании так называемого Q-цикла Митчелла /42,108/. При этом предполагается, что пластогидрохиион восстанавливает Ге-5 центр типа Риске. Образующийся пластосемихинон служит донором электронов для цитохрома #563' К0Т0РЫ^ является донором при восстановлении пластохинона. Такая гипотеза позволяет объяснить перенос двух протонов внутрь тилакоида на один электрон, переносимый от фотосистемы 2 к фотосистеме I /42/.
Пластоцианин сравнительно слабо связан с мембраной, предполагают /68/, что за счет его диффузии внутри тилакоида он может осуществлять быстрый перенос электронов не только между близлежащими, но и между удаленными друг от друга электрон-первносящими комплексами.
Реакционный центр фотосистемы I - Р700 так же, как и реакционный центр фотосистемы 2 - Р680, по-видимому, представляет собой дпмер хлорофилла /ИЗ/. Он имеет окислительно-восстановительный потенциал пары Р700-Р700+ +0,48 В /3,65/.
От возбужденного реакционного центра Р700 электрон попадает на акцептор X Діб/» Далее через систему мембраносвязанных пере- носчиков электрон попадает на ферредоксин, а затем на ферредок-сіш-НАДФ-редуктазу и восстанавливает НАД /12 /. Через ферредоксин (окислительно-восстановительный потенциал -0,42 В) может замыкаться цепь циклического транспорта электронов. Циклический перенос электронов происходит, затрагивая только фотосистему І. В этом случае через ферредоксин электрон попадает на цитохром й^бЗ» далее на цитохром /, пластоцианин и на Р700+ /65/. При переносе электронов по такому пути восстановления Н№ не происходит. Поскольку циклический электронный транспорт сопряжен с синтезом ATS>, то можно думать, что переключение электронного потока с нециклического на циклический путь переноса электрона позволяет оптимальным образом сбалансировать число синтезируемых молекул АТФ и HAJQs&H, используемых в цикле Кальвина.
В результате фотоиндуцированного электронного транспорта происходит перенос протонов внутрь тилакоида. При этом связывание протонов из внешней среды происходит на стадии восстановления пластохинона фотосистемой 2 и при восстановлении НАДщ+, а выделение их внутри тилакоида - в системе разложения воды (фотосистема 2) и на стадии окисления пластогидрохинона фотосистемой I.
Известно, что более, чем 99,9$ протонов, выделяющихся во внутреннюю фазу тилакоида, связывается буферными группами, локализованными как на мембране, так и в^ водной фазе внутри тилакоида /98,113/. Связывание протонов с буферными группами на внутренней поверхности мембраны может приводить к тому, что при освещении хлоропластов должен увеличиваться потенциал внутри тилакоида, который будет компенсироваться перераспределением ионов, которое происходит под действием возникающей трансмембранной разности потенциалов. Мембрана тилакоида имеет большую по сравнению с про- тонной проницаемостью для многих одно- и двухвалентных ионов, поэтому в стационарном состоянии при освещении хлоропластов непрерывным светом, трансмембранная разность потенциалов имеет незначительную величину (менее 20 мЕ) /103/.
При освещении хлоропластов непрерывным насыщающим белым светом стационарное число протонов, поглощаемых хлоропластами, составляет * 500 протонов на каждую электронтранспортную цепь /ЛЗ /. При этом образуется трансмембранная разность рН (л рН), которая достигает значения *3 /54/,
В настоящее время в литературе нет единого мнения о том, где локализованы протоны, связываемые хлоропластами при освещении. Так, в работах /91,99,100/ предполагается, что в тилакоидах при освещении образуется несколько "протонных пулов", которые могут различаться как по месту своей локализации в тилакоиде, так и по их функциональным особенностям. Б частности получены данные о существовании фракции протонов, связанных акцепторными группами, локализованными внутри мембраны, которые не находятся в равновесии с протонами, локализованными в водной фазе внутри тилакоида /71/. При этом было показано /64,91,99/, что при определенных условиях протоны, выделяющиеся в системе разложения воды, не попадают во внутренний объем тилакоида, а связываются буферными группами внутри самой тилакоидной мембраны.
Регуляция процессов электронного транспорта. Механизмы регуляции электронного транспорта интенсивно исследовались рядом авторов (см., например, /21,43,94,104/). В цепи электронного транспорта в хлоропластах имеются два участка, которые могут лимитировать скорость электронного транспорта: I) акцепторный участок фотосистемы I. На этом участке скорость переноса электронов зависит от концентрации акцепторов электронов фотосистемы I - молекул ШЩҐ Д04/. Поскольку восстановленные БАДСШ используются в реакциях цикла Кальвина, то концентрация НаДб+, а, следовательно, и скорость электронного транспорта на акцепторной участке фотосистемы I определяются эффективностью работы цикла Кальвина.
2) участок между фотосистемами. В этом случае лимитирующей по времени стадией является реакция окисления пластогидрохинона фотосистемой I. Этот процесс связан с выделением протонов внутрь ти-лакоида и контролируется внутритилакоидным рН. Имеются данные /94,104/ о том, что электронный транспорт между двумя фотосистемами тормозится в результате заіснсленгія внутритилакоидного пространства, сопряженного с работой цепи электронного транспорта. Так, при освещении хлоропластов при отсутствии субстратов фосфорилиро-вания характерное время переноса электронов на участке между фотосистемами составляет приблизительно 60 мс (при pHoUt^8,0), а в условиях фосфорилирования, когда концентрация протонов внутри ти-лакоида меньше, чем в состоянии фотосинтетического контроля -приблизительно в 3 раза меньше. Таким образом, изменения концентрации протонов внутри тилакоида влияют на скорость электронного транспорта на участке между фотосистемами.
Возможны также и другие механизмы регуляции электронного транспорта, например, за счет перераспределения энергии света между пигментными системами /43/. Этот механизм связан с активацией протеин киназы, катализирующей фосфорилирование белков све-тоеобирающего пигмент-белкового комплекса фотосистемы 2. При этом происходит перераспределение энергии между фотосистемами I и 2. Имеются данные о том, что восстановленное состояние пластохи- нонового пула активизирует работу протеин киназы, а происходящее вследствие этого фосфорилирование пигмент-белкового светособираю-щего кошілекса приводит к увеличению энергии света, поступающем в фотосистему І /13/, что может привести к ее более частым срабатываниям.
Вероятно, что такой механизм регуляции электронного транспорта монет приводить к сбалансированию электронного транспорта между циклическим и нециклическим путями.
Вследствие того, что компоненты цепи электронного транспорта локализованы в мембране тилакоида, то изменение физического состояния тилакоидной мембраны такие- может влиять на кинетику фото-индуцированного электронного транспорта в хлоропластах. Так, например, в работах /17,22,78/ показано, что при изменении температуры происходит изменение структурного состояния тилакоидной мембраны, а также происходят изменения кинетики электронного транспорта /17 /. В работе /17/ показано, что с изменением температуры изменяются эффективность и частота срабатывания центров Р680. В работе /17/ показано, что кинетика переноса электронов на участке между фотосистемами также зависит от температуры. Так, при увеличении температуры от 0 до 35С характерное время переноса электронов на участке между фотосистемами уменьшается приблизительно в 3 раза /17/. Характерно, что термоиндуцированные изменения кинетики электронного транспорта скоррелированы с термоинду-цированными изменениями структурного состояния тилакоидной мембраны, регистрируемыми с помощью липидорастворшлых спиновых зондов, встроенных в мембрану тилакоидов /17,22/. Таким образом, изменение структурного состояния тилакоидной мембраны может влиять на кинетику электронного (и протонного) транспорта в хлоропластах.
Кинетика электронного транспорта зависит такие от ионного состава среды инкубации хлоропластов. Известно /37,40/, что в ин-тактных хлоропластах ионы ту выполняют роль главного противоио-на в процессах, связанных с фотоиндущфованным переносом протонов через тилакоидную мембрану. Вследствие этого концентрация ионов
Щ """ в строме и внутри тилакоидов может изменяться при освещении хлоропластов. В то же время, как было показано в работе /40/, ионы Щ + влияют на распределение энергии между I и 2 фотосистема-мі'і. Эффективное связывание ионов Mg с отрицательно заряженными группами на мембране может приводить к изменению структурного состояния тилакоидной мембраны, а, следовательно, и кинетики электронного транспорта.
Получено /21/, что при увеличении концентрации Щ + в суспензии хлоропластов (от 0 до 3 мМ) происходит увеличение фотохимической активности фотосистемы 2. При этом увеличивается эффективность срабатывания центров Р680, а их частота срабатывания практически не изменяется, уменьшается константа скорости окисления пластогидрохинона фотосистемой I. уменьшается время диффузии пластогидрохинона от фотосистемы 2 к фотосистеме I.
2. Сопряжение электронного транспорта с йотойоссЬоридированием.
Синтез АТФ в хлоропластах происходит в ATS-виншвтазном комплексе, пространственная организация которого схематически представлена на рис.1. Он состоит из гидрофобной части (CFQ), расположенной в мембране, и фактора сопряжения CPj , контактирующего с CF . Было установлено, что комплекс латерально подвижен в мембране /120/. Сопрягающий фактор CFj состоит из нескольких субъединиц (различают о типов субъединиц) /33/. Если CFj удален (что достигается обработкой хлоропластов ЗДТА при низкой ионной силе), то хлоропласти теряют способность синтезировать АТШ и аккумулировать протоны на свету вследствие интенсивной утечки протонов через СР0 /106/. Необходимо отметить, что комплекс CPj катализирует также и обратную реакцию - гидролиз кШ, причем такая реакция монет происходить даже с помощью изолированного фактора сопряжения CPj (без тилакоида) /53,5S/. Известно, что ATS-синтетаза (АТШаза) может находиться как в активном, так и в неактивном состоянии /4, 30,35,53,57,60/. Активация ATS-синтетазы - перевод ее из латентного (неактивного) в активное состояние - монет происходить под действием тепла, предварительного освещения, воздействия химическими агентами /30,60,74,84/. Механизмы работы А1)-синтетазы и ее активации в настоящее время интенсивно исследуются (см.,например, /102/), но еще окончательно не выяснены.
Неясным такие остается механизм сопряжения электронного транспорта и фотофосфорилирования. Так, при исследовании электрон-транспортной цепи с помощью ингибиторов, было показано, что в ней существуют два участка ("пункта сопряжения"), при переносе электронов через которые в хлоропластах возможен синтез ATS*. Первый такой участок (I пункт сопряжения) расположен в донорном участке фотосистемы 2 (система разложения воды). Второй участок (П пункт сопряжения) расположен на участке окисления пластогидрохинона (фотосистема I) /60/. В течение многих лет широко дискутировался вопрос о природе первинного макроэрга - то есть той променуточной формы запасания энергии, энергия которой используется для синтеза кШ /2/. Имеется ряд гипотез, посвященных данной проблеме. Ниже мы перечислил наиболее распространенные концепции мембранного фосфорилирования, лишь кратко остаанавливаясь на основных положениях и предпосылках, лежащих в основе этих представлений. В рамках небольшого обзора не представляется возможным сделать исчерпывающий критический анализ огромного экспериментального материала, используемого разными авторами в пользу той или другой концепции. Однако, по мере обсуждения наших экспериментальных данных, мы будем неоднократно возвращаться к вопросу об экспериментальном обосновании наиболее важных положений различных концепций мембранного фосфорилирования
Химическая гипотеза (Слейтер, /96/). В ее основе лежит предположение о том, что преобразование энергии, освобождающейся при электронном переносе, в долгоживущую форму происходит в молекуле переносчика-трансформатора и заключается в образовании макроэрги-ческого соединения, содержащего один из продуктов окислительно-восстановительной реакции и низкомолекулярный лиганд. Затем первичный макроэрг с помощью АТЗьсинтетазы обеспечивает синтез кШ. Эта гипотеза не получила экспериментального подтверждения, так как, несмотря на тщательные усилия многих исследователей, химический макроэрг вплоть до настоящего времени не обнаружен.
Конформационная гипотеза (Бойер-Слейтер, /46,97/). В ее основе лежит предположение о том, что превращение энергии, выделяющейся при окислительно-восстановительных реакциях в энергию мак-роэргических связей (молекулы к'Ш) происходит в результате кон-форглационных изменений белков-переносчиков электронов или мембраны тилакоида в целом. При этом предполагается прямое взаимодействие между электронными переносчиками и молекулами AIS-синтетазы.
Конаормационную гипотезу шїїно считать однім из вариантов химической с тем различием, что первичный химический макроэрг заменен на энергизованное, коншормационно измененное состояние переносчика /46,97/. Эпергпзованное состояние всей мембраны, в котором может храниться энергия, сближает конформационную концепцшэ с хеш-осмотической /76/.
Хешосмотичеекая концепция (Митчелл, /76,77/) - наиболее популярная в настоящее время гипотеза. В ее основе лепит предположение о том, что движущей силой для синтеза АТ& является фотоин-дущгруемый трансмембранный градиент электрохимического потенциала протонов, величину которого можно представить следующим образом A/uH = FAy-2;3RTApH где д^р - трансмембранная разность электрических потенциалов; трансмембранная разность рН. Согласно ІаЕтчеллу, при выходе протонов из тшгакоида через .№-синтетазу энергия, накопленная в виде Д/Цц , расходуется для синтеза кЪЪ в ATS-синтетазє. Скорость синтеза кШ, таким образом, определяется скоростью выхода протонов через ATS-спнтєтазу. Характерной особенностыэ хемносмотической гипотезы является то, что сопряжение между цепью электронного транспорта и АТй-спнтетазои осуществляется только с помощью фотоиндуцированного градиента злектрохимії-іческого потенциала для протонов.
В последние годы хемпосмотическая концепция мембранного йос-форнлирования претерпела ряд модификаций. В частности, в литературе активно обсуждается один из ее вариантов, так называемая микрохемпосмотическая гипотеза /56,107/, которая в отличие от ортодоксальной хемлосмотической гипотезы Митчелла предполагает наличие более жесткой связи между электрон-транспортной цепью и ATS-синтетазой. В этом варианте синтез АШ> также связывают с прохождением протонов из тилакоида наружу через АТ-Жсинтетазу. Однако, при этом фактически предполагается наличие дополнительного комплекса: электрон-транспортная цепь-АЇФ-синтетаза. Эффективную работу АТЗ-синтетазы обеспечивает работа сопряженной с ней электрон-транспортной цепи.
Довольно близка к микрохемиосмотической "локальная" гипотеза (Вильяме, /111,112/). В ее основе лежит предположение о том, что в результате электронного транспорта внутри мембраны возникают локальные заряды и градиенты электрохимического потенциала протонов. Высокие концентрации протонов в гидрофобной области мембраны необходимы для синтеза АЖ>.
Согласно концепции мембранного фосфорилирования, разрабатываемой Л.А.Елюменфельдом /2/, преобразование энергии непосредственно связано с процессами релаксации переносчика-трансформатора к равновесному состоянию. Предполагается, что в результате переноса электрона переносчик может оказаться в конформационно-нерав-новесном состоянии. Действительно, если характерное время переноса электрона намного меньше, чем время конформационном перестройки всей белковой глобулы молекулы-переносчика, то после восстановления (или окисления) активного центра белка-трансформатора он будет находиться в конформационно-неравновесном состоянии. В этом случае молекула-переносчик может обладать повышенной конформацион-ной энергией. Сравнительно медленная релаксация конформации макромолекулы к равновесному состоянию представляет собой фактически акт, обеспечивающий преобразование энергии. Таким образом, энергия, выделяемая в элементарном акте электронного транспорта, запасается в форме информационной энергии в течение времени релак- садни. Согласно /2/ в этом и состоит сущность первичного макроэрга. За время релаксации конформационная энергия трансформируется в химическую. В этом случае в пункте сопряжения долнен существовать лабильный комплекс между переносчиками и какой-либо группой в А1>-синтетазе. В этом случае образование aJUq под действием света для синтеза АТё может ішеть второстепенную роль, выполняющую, например, регуляторные функции.
Можно предположить, что механизм фотофосфорилирования сочетает в себе элементы нескольких гипотез или идет по какому-либо иному механизму.
Энергетический аспект пройдеш сопряжения электронного транспорта и фотофосфорилирования заключается в том, что синтез ATIJ в хлоропластах с учетом физиологических концентраций фосфата, АД&» А.Т& требует изменения свободной энергии (д(т) на величину 15 ккал/моль /2/, т.е. для синтеза одной' молекулы АТ^ необходима энергия не менее 0,63 эВ. Согласно Митчеллу /76,77/, источником такой энергии является трансмембранный градиент электрохимического потенциала протонов. AjUH=4?-2,3^pH д/ин=лУ+601дрН1 {т (трансмембранная разность электрических потенциалов) оценивается в работе /103/ и составляет^20 мВ. Поэтому величина трансмем-бранного д рН вносит основной вклад в дДОн . В стационарном состоянии, когда число актов энергодонорной реакции (перенос электронов и/или протонов) равно числу актов энергоакцепторной реакции (синтез A1Q), должно выполняться соотношение
Поэтому синтез одной молекулы АТ1>, для которого требуется изменение свободной энергии на величину A -=0,63 эВ, может произойти при прохождении через АЖ>-синтетазу П протонов, где /1 определяется из уравнения П =&&/дМц . Следовательно, величина трансмем-бранного AJUh при фосфорилировании должна определять количество протонов, прохождение которых через АТЕБ-синтетазу необходимо для синтеза одной молекулы кШ. Если в условиях фотофосфорилирования дрїї^2,6-3,0 (что получено в работах /34,54,85,86,88,89/), то это не противоречит гипотезе Митчелла, поскольку для синтеза одной молекулы АТ необходимо прохождение через АТШ-синтетазу относительно небольшого числа протонов - 3*4. Однако, в работе /104/, где лрН в хлоропластах в различных метаболических состояниях оценивался по скорости электронного транспорта на участке между фотосистемами было получено, что значение лрН при фотофосфоршш-ровании в стационарном состоянии мало (не более 0,5-1 ед.рН). Это противоречит гипотезе Митчелла. Действительно, если трансмембранный градиент рН незначителен, то для синтеза одной молекулы АТ& необходима аккумуляция энергии, выделяемой при прохождении через А15~спнтетазу большого числа протонов (не менее 10 протонов). Б то же время в экспериментах полз^чено, что синтез одной молекулы АТ& происходит, если внутрь тилакоида переносится значительно меньшее число протонов - 3*6. Следовательно, через АТ-синтетазу наружу при синтезе одной молекулы АТШ также проходит не более 3-6 протонов. Таким образом, для синтеза АТЗ> недостаточно энергии, запасенной в форме Д/Ун » и необходима энергия какого-то иного макроэрга, природа которого окончательно неясна.
Необходимо отметить, что образование в условиях фосфорилиро-вания незначительного трансмембранного градиента рН не противоре- чит гипотезе мембранного фосфорилирования JI. А.Блюменфельда.
Такім образом, для того, чтобы понять, какая форма первичного макроэрга используется для синтеза АЖ> в хлоропластах, какова роль образования Л JMh в фосфорішировании, необходимо иметь возможность с достаточной точностью измерять величину трансмембранного градиента рН. Поскольку различные методы измерения Л рН дают разные результаты, то необходимо выяснить адекватность этих методов измерения & рН. Б данной работе и проводились такие исследования.
3. Постановка задачи,
В настоящее время выяснение механизмов регуляции энергетического сопряжения в хлоропластах представляет собой одну из важнейших задач биоэнергетики. Решению этой задачи должны способствовать,, прежде всего, исследования, в которых систематически изучается влияние различных факторов (например, изменение температуры, условий освещения и др.) на эффективность сопряжения энер-годонорной реакции (электронный транспорт, перенос протонов) и энергоакцепторной реакции (синтез ATS). О этой целью в настоящей работе в различных экспериментальных условиях исследовалась взаимосвязь между скоростью синтеза А!Ш и процессами фотоиндуцированного электронного и протонного транспорта. Кроме того, необходимо было оценить возможную роль фотоиндуцированных изменений поверхностного потенциала тилакоидной мембраны в процессах энергетического сопряжения.
Как мы отмечали в предыдущем параграфе, в литературе тлеются разногласия относительно значения трансмембранной разности рН ОзрН) в хлоропластах в условиях фотофосфорилкрования. Эти оценки величины дрН были получены различными методами. В связи с этим, прежде всего, встала задача сопоставить данные, получаемые разными способами (по кинетике электронного транспорта и по распределению аминов), но в идентичных экспериментальных условиях. Решение этой задачи должно в определенной мере ответить на вопрос об адекватности этих двух методов измерения лрН.
Сопряжение электронного транспорта и фотофосгоорилирования
Синтез АТФ в хлоропластах происходит в ATS-виншвтазном комплексе, пространственная организация которого схематически представлена на рис.1. Он состоит из гидрофобной части (CFQ), расположенной в мембране, и фактора сопряжения CPj , контактирующего с CF . Было установлено, что комплекс латерально подвижен в мембране /120/. Сопрягающий фактор CFj состоит из нескольких субъединиц (различают о типов субъединиц) /33/. Если CFj удален (что достигается обработкой хлоропластов ЗДТА при низкой ионной силе), то хлоропласти теряют способность синтезировать АТШ и аккумулировать протоны на свету вследствие интенсивной утечки протонов через СР0 /106/. Необходимо отметить, что комплекс CPj катализирует также и обратную реакцию - гидролиз кШ, причем такая реакция монет происходить даже с помощью изолированного фактора сопряжения CPj (без тилакоида) /53,5S/. Известно, что ATS-синтетаза (АТШаза) может находиться как в активном, так и в неактивном состоянии /4, 30,35,53,57,60/. Активация ATS-синтетазы - перевод ее из латентного (неактивного) в активное состояние - монет происходить под действием тепла, предварительного освещения, воздействия химическими агентами /30,60,74,84/. Механизмы работы А1)-синтетазы и ее активации в настоящее время интенсивно исследуются (см.,например, /102/), но еще окончательно не выяснены.
Неясным такие остается механизм сопряжения электронного транспорта и фотофосфорилирования. Так, при исследовании электрон-транспортной цепи с помощью ингибиторов, было показано, что в ней существуют два участка ("пункта сопряжения"), при переносе электронов через которые в хлоропластах возможен синтез ATS . Первый такой участок (I пункт сопряжения) расположен в донорном участке фотосистемы 2 (система разложения воды). Второй участок (П пункт сопряжения) расположен на участке окисления пластогидрохинона (фотосистема I) /60/. В течение многих лет широко дискутировался вопрос о природе первинного макроэрга - то есть той променуточной формы запасания энергии, энергия которой используется для синтеза кШ /2/. Имеется ряд гипотез, посвященных данной проблеме. Ниже мы перечислил наиболее распространенные концепции мембранного фосфорилирования, лишь кратко остаанавливаясь на основных положениях и предпосылках, лежащих в основе этих представлений. В рамках небольшого обзора не представляется возможным сделать исчерпывающий критический анализ огромного экспериментального материала, используемого разными авторами в пользу той или другой концепции. Однако, по мере обсуждения наших экспериментальных данных, мы будем неоднократно возвращаться к вопросу об экспериментальном обосновании наиболее важных положений различных концепций мембранного фосфорилирования
Химическая гипотеза (Слейтер, /96/). В ее основе лежит предположение о том, что преобразование энергии, освобождающейся при электронном переносе, в долгоживущую форму происходит в молекуле переносчика-трансформатора и заключается в образовании макроэрги-ческого соединения, содержащего один из продуктов окислительно-восстановительной реакции и низкомолекулярный лиганд. Затем первичный макроэрг с помощью АТЗьсинтетазы обеспечивает синтез кШ. Эта гипотеза не получила экспериментального подтверждения, так как, несмотря на тщательные усилия многих исследователей, химический макроэрг вплоть до настоящего времени не обнаружен.
Конформационная гипотеза (Бойер-Слейтер, /46,97/). В ее основе лежит предположение о том, что превращение энергии, выделяющейся при окислительно-восстановительных реакциях в энергию мак-роэргических связей (молекулы к Ш) происходит в результате кон-форглационных изменений белков-переносчиков электронов или мембраны тилакоида в целом. При этом предполагается прямое взаимодействие между электронными переносчиками и молекулами AIS-синтетазы.
Конаормационную гипотезу ШЇЇНО считать однім из вариантов химической с тем различием, что первичный химический макроэрг заменен на энергизованное, коншормационно измененное состояние переносчика /46,97/. Эпергпзованное состояние всей мембраны, в котором может храниться энергия, сближает конформационную концепцшэ с хеш-осмотической /76/.
Хешосмотичеекая концепция (Митчелл, /76,77/) - наиболее популярная в настоящее время гипотеза. В ее основе лепит предположение о том, что движущей силой для синтеза АТ& является фотоин-дущгруемый трансмембранный градиент электрохимического потенциала протонов, величину которого можно представить следующим образом где д р - трансмембранная разность электрических потенциалов; трансмембранная разность рН. Согласно ІаЕтчеллу, при выходе протонов из тшгакоида через .№-синтетазу энергия, накопленная в виде Д/Цц , расходуется для синтеза кЪЪ в ATS-синтетазє. Скорость синтеза кШ, таким образом, определяется скоростью выхода протонов через ATS-спнтєтазу. Характерной особенностыэ хемносмотической гипотезы является то, что сопряжение между цепью электронного транспорта и АТй-спнтетазои осуществляется только с помощью фотоиндуцированного градиента злектрохимії-іческого потенциала для протонов.
Измерение фотоиндуцированных изменении рН и поглощения кислорода хлоропластами
Фотоиндуцированные изменения рН в суспензии хлоропластов регистрировали на установке, состоящей из рН-метра модели рїї-380 и самописца от полярографа модели LP-9 (ЧССР). Реакционную смесь помещали в термостатируемую прозрачную кювету, в которой происходило непрерывное перемешивание суспензии хлоропластов. Для регистрации фотоиндуцированных изменений рН, хлоропласти помещали в реакционную среду, содержащую слабый буфер (1 5 мМ фосфатного буфера) , концентрация хлоропластов соответствовала содержанию хлорофилла в суспензии «100 мг/мл. Концентрацию буфера подбирали таким образом, чтобы величины фотоиндуцированных изменений рН суспензии хлоропластов в наших опытах были незначительны и составляли не более 0,05-0,1 единицы рН (смотри, например, рис.6, где представлена кинетика фотоиндуцированных изменений рН суспензии хлоропластов в различных метаболических состояниях). Можно считать поэтому, что наблюдаемые изменения рН были пропорциональны изменениям концентрации (активности) протонов в среде. Для пересчета величин фотоиндуцированных изменений рН в дН (количество протонов, связываемых хлоропластами на свету) использовали стандартные добавки НСІ известной концентрации, вносимые в кювету как в темноте, так и во время освещения хлоропластов.
Скорость фотоиндуцированного электронного транспорта в хлоропластах измеряли полярографическим методом по скорости поглощения кислорода хлоропластами в присутствии метилвиологена. Известно, что прохождение четырех электронов по электрон-транспортной цепи сопровождается выделением одной молекулы О2 в системе разложения воды (фотосистема П). На акцепторном участке фотосистемы I в присутствии метилвиологена, как медиатора переноса электронов, перенос электронов сопровождается образованием супероксидных радикалов и перекиси водорода /28/:
При активно работающей каталазе, никаких фотоиндуцированных изменений концентрации 02 в среде не должно происходить, так как выделение 02 в системе разложения воды и поглощение его в акцепторном участке фотосистемы I полностью компенсируют друг друга. Это наблюдалось нами и в опыте. В присутствии хлоропластов 2,5 мМ KlaNg (ингибитора каталазы) наблюдалось фотоиндуцированное уменьшение концентрации кислорода в суспензии хлоропластов. Специальные эксперименты, проведенные нами, показали, что добавление 2,5 мМ NaNo практически не вызывает ингибирования фотофосфорилирова-ния, уменьшения фотоиядуцированного поглощения протонов и т.д. Необходжю отметить, что в случае недостаточной активности супер-оксиддисмутазы реакция с образованием перекиси может идти по иному пути /28/. Окислителем может служить, например, аскорбат
При такой реакции в присутствии NaNo при прохождении по электрон-транспортной цепи одного и того же количества электронов поглощается больше молекул 02, чем в предыдущем случае. Однако, в наших опытах, как показали эксперименты, активность супероксиддисмутазы была достаточной. Таким образом, при ингибировании каталазы прохождению четырех электронов по электрон-транспортной цепи соответствовало поглощение трех молекул Си. На основании такой стехиометрии по скорости убыли кислорода в суспензии хлоропластов при освещении и вычислялась скорость электронного транспорта в хлоропластах. Для измерения концентрации CU применяли электрод Кларка от биологического микроанализатора типа 0Р-2І0/3 производства фирмы "RadeCKLS " (ВНР) и полярограф с самописцем LP-9 (ЧССР).
Характерный вид кинетики фотоиндуцированных изменений концентрации О2 приведен на рис.2. Из рис.2 видно, что под действием света происходит уменьшение концентрации кислорода в суспензии хлоропластов. Участки Б-С и С-Е кривой на рис.2 соответствуют различным условиям освещения хлоропластов: участок С-Е соответствует освещению хлоропластов светом максимальной интенсивности (100$), а Б-С - более слабым (30%). Б момент времени Д происходит полное истощение кислорода в среде инкубации и в дальнейшем никаких изменений концентрации 0 не наблюдается. Скорость убыли концентрации кислорода в среде инкубации вычислялась по тангенсу угла наклона кривой на рис.2. Для определения концентрации 02 в среде были использованы табличные значения концентрации 0 в растворах, приведенные в работе /25 /, а также применялось титрование известными добавками дитионита, что приводило к связыванию кислорода в известной концентрации
Влияние температуры на фотоиндуцируемое поглощение протонов хлоропластами и кинетику выхода протонов из хлоропластов
При освещении хлоропластов происходит перенос электронов по цепи электронного транспорта, который сопряжен с транслокацией протонов внутрь тилакоида. Известно, что в хлоропластах фотоинду-цированное поглощение протонов из внешней среды обусловлено двумя процессами: 1) восстановлением пластохинона фотосистемой 2, соііровождающимся его протонированием /32/; 2) восстановлением кислорода фотосистемой I с последующим образованием перекиси водорода (медиатором переноса электронов от фотосистемы I к кислороду в нашей системе служит метилвиологен, подробнее см. в главе П, 2), а также в работе /28/. Выделение протнов внутри тилакоида также обусловлено двумя процессами: 1) выделением протонов в результате работы системы разложения воды (фотосистема 2) /49/; 2) окислением пластогидрохинона фотосистемой I, сопровождающимся выделением протонов внутрь тилакоида /32/. В результате, при освещении сопряженных хлоропластов наблюдается защелачивание внешней среды и должно происходить закисле-ние внутритилакоидного пространства. Это будет продолжаться до тех пор, пока перенос протонов внутрь тилакоида не скомпенсирует утечка протонов наружу. Известно /ИЗ/, что в стационарном состоянии подавляющее число протонов, поглощаемых хлоропластами при освещении, связываются буферными группшж белков и липидов. После выключения света за счет пассивной утечки протонов из тилакоида во внешнюю среду, происходит выравнивание рН внутри тилакоида и снаружи, о чем можно судить по спаду рН внешней среды до своего первоначального стационарного уровня. На рис.6 показана типичная кинетика фотоиндуцированных изменении рН в среде инкубации хлоропластов. Из рис.6 видно, что в отсутствии субстрата фосфорилирования кЩ изменения рН в ответ на включение света носят обратимый характер - после выключения света рН среды возвращается к своему первоначальному значению (кривая I). Иными словами, наблюдаемые фотоиндуцированные обратимые изменения рН суспензии хлоропластов являются следствием связывания протонов хлоропластами при освещении и выхода протонов из хлоропластов после выключения света.
В условиях фотофосфорилирования, когда в суспензии хлоропластов присутствуют АДФ и неорганический фосфат, фотоиндуцированные изменения рН имеют несколько иной вид (рис.6, кривая 3). В этом случае при включении света наблюдается вначале более быстрое увеличение рН ( участок АБ кривой 3 рис.6), а затем более медленное, монотонное увеличение рН без выхода на стационарное значение (участок ЕВ). Такое поведение кривой легко объяснить, если принять во внимание, что реакция конденсации АДФ и фосфата, приводящая к образованию АТ, сопровождается необратимым связыванием протонов: Таким образом, начальное увеличение рН при включении света (участок АБ кривой 3 рис.6) происходит вследствие переноса протонов внутрь тилакоида, а последующее, более медленное нарастание рН (участок ЕВ кривой 3 рис.6) обусловлено связыванием протонов в результате синтеза АШ . В нашей работе скорость синтеза А!Ш определялась по скорости защелачивания реакционной среды под действи-ни света (участок ЕВ кривой 3 рис.6).
После выключения света наблюдается сравнительно быстрое уменьшение рН, обусловленное выходом протонов из хлоропластов, а также существенно более медленное уменьшение рН за счет реакции гидролиза А, синтезировавшегося во время освещения хлоропластов. Такті образом, по спаду рН среды инкубации нельзя однозначно судить о количестве протонов, связываемых хлоропластами при освещении в условиях фосфорилирования. О количестве протонов, связываемых хлоропластами при освещении в условиях фосфорилирования, можно судить с полной определенностью лишь при наличии в среде так называемого "гексокиназного шунта". При добавлении гексокиназы и глюкозы фотоиндуцированные изменения рН становятся обратимыми (см.рис.6 кривая 2). Это связано с тем, что синтезируемые молекулы AT быстро подвергаются гидролизу в ходе реакции, катализируемой гексокиназой, и протоны, связанные при синтезе \1Ш, опять выделяются во внешнюю среду. Обратимое изменение рН в этом случае будет отражать связывание протонов хлоропластами в условиях фотофосфорилирования. Температурные зависимости стационарного количества протонов, связываемых при освещении хлоропластами (ДН) в разных метаболических состояниях, приведены на рис.7. Исследовались следующие состояния: а) хлоропласти в состоянии 2 - в пробах не содержалось добавлен ного кШ или АТШ; б) хлоропласти в состоянии 3 - в условиях интенсивного фосфорилирования, в присутствии І мМ АДФ, гексокиназы, глюкозы; в) хлоропласти в состоянии 4 - в состоянии фотосинтетического контроля, в присутствии кШ. Из рис.7 видно, что во всем интервале температур, при которых происходит поглощение протонов, наибольшее поглощение происходит в состоянии 4. Это объясняется тем, что в присутствии к№ (использовались каталитические количества АТШ - не более 5-Ю мкМ), уменьшается утечка протонов через протонный канал АТ5-син-тетазы, так как связывание АТ1 с активным центром фактора сопряжения CPj блокирует этот путь утечки протонов /14,52/. Напротив, в условиях интенсивного фосфорилирования (состояние 3) во всем интервале температур связывание протонов хлоропластами меньше, чем в контрольных хлоропластах (состояние 2). Это объясняется тем, что в условиях интенсивного фосфорилирования (состояние 3) скорость утечки протонов через АТ1 -синтетазу возрастает, а вследствие этого уменьшается стационарное число протонов, поглощаемых хлоропластами на свету /14,52,106/.
Влияние интенсивности света на кинетику переноса электронов между фотосистемами
В работе /104/, исходя из предположения о том, что внутрити-лакоидный рН (рНл) контролирует скорость переноса электронов на участке между фотосистемами, было измерено рНі.л в различных метаболических состояниях по кинетике электронного транспорта на участке окисления PQHg.
Характерное время переноса электронов на участке между фотосистемами можно определить по времени спада сигнала ЭПР от Р700+ на включение белого света (подробнее об этом смотри в гл.П 3, а также в работах /17,104/). Восстановление Р700+ после выключения белого света происходит за счет притока электронов от пула восстановителей, накопленных в электрон-транспортной цепи во время действия белого света.
Известно, что лимитирующим звеном на участке цепи между фотосистемой 2 и Р700 является стадия окисления пластогидрохинона (и/или пластосемихинона) /101/, все последующие стадии переноса электрона к Р700+ протекают на несколько порядков быстрее /101/. При достаточно высоких интенсивностях белого света в стационарном состоянии большая часть центров Р700 окислена (рис.3), а восстановление этих центров после выключения белого света происходит со временем, характерным для реакции окисления пластогидрохинона СГ//2 20 мс, рис.14). Все это говорит о том, что большая часть переносчиков на участке цепи между пластохиноном и Р700 (высоко-потенциальный Ре-5 центр, цитохром / и пластоцианин) в момент выключения света находятся в окисленном состоянии. Поэтому по кинетике восстановления Р700+ после выключения света можно судить об окислении пластогидрохинона фотосистемой I.
Кинетика восстановления Р700+, представленная в полулогарифмическом масштабе, показана на рис.14. После выключения достаточно интенсивного белого света наблюдается четко выраженная двухфазная кривая, в которую основной вклад (70-75$) вносит более быстрая стадия восстановления Р700+ (характерное время восстановления 50$ центров Р700+ после выключения света ty/2 20 мс). При этом вторая, более медленная стадия, имеет характерное время 1// 45-5-60 мс.
Скорость окисления РОН2 формально можно описать параметром Т//2 более быстрой стадии восстановления. Из рис.15 видно, что параметр Т//2. немонотонно зависит от интенсивности действующего света. Обращает на себя внимание тот факт, что при различных интенсивностях действующего света кинетика восстановления Р700+ (рис.14) и соответственно величина ТГ//2(рис.15Б) в условиях фосформирования практически совпадает с кинетикой восстановления Р700+ в разобщенных хлоропластах (в присутствии 10 мкМ грамициди-на Д).
Необходимо отметить, что в отсутствие субстратов фосфорили-рования кинетика восстановления Р700+ более медленная (и параїлетр Т/ тем самым больше), чем в хлоропластах в условиях фосфорилиро-вания (см.рис.15Б). Следовательно, в отсутствие фосфорилирования электронный транспорт более заторможен. Ускорение электронного транспорта в условиях интенсивного фосфорилирования объясняется тем, что за счет утечки протонов наружу через АИ-синтетазный комплекс не происходит столь сильного уменьшения рН в водной фазе внутри тилакоида (рНсл)» какое имеет место в состоянии фотосинтетического контроля /24/. В результате этого в условиях фотофосфо-рилирования не наблюдается торможения электронного транспорта. В состоянии фотосинтетического контроля (в отсутствие добавленного АДФ) происходит более сильное закисление внутритилакоидного пространства (дрН = 2,54-3), поскольку при этом имеет место лишь пассивная утечка протонов наружу, но нет утечки протонов через ATS-синтетазу, обусловленной процессами фосфорилирования. Вследствие этого скорость переноса электронов от фотосистемы 2 к Р700 уменьшается /24,104/. Из рис.15Б видно, что во всем интервале интен-сивностей действующего света восстановление Р700 после выключения света в контрольных хлоропластах (в отсутствие добавленного АДФ или разобщителя) происходит медленнее, чем в условиях фотофосфор илирования или в присутствии разобщителя. Зависимость скорости восстановления Р700 от рН в разобщенных хлоропластах (предполагалось, что при этом pHtft=pH(7t/f) была использована в работе /104/ для измерения внутритилакоидного рН в различных метаболич ческих состояниях. Следует, однако, иметь в виду, что наблюдаемая скорость исчезновения сигнала, связанная с восстановлением Р700+, определяется не только величиной pHin, но зависит также от состояния электрон-транспортной цепи. Увеличение концентрации восстановленных переносчиков в цепи между фотосистемами приводит к ускорению восстановления Р700+ /22 /. Поэтому измерения рНіл по скорости электронного транспорта могут быть корректны лишь при соблюдении трех необходимых условий: 1) состояние переносчиков электрон-транспортной цепи (степень восстановленности цепи) одинаково как в сопряженных, так и в разобщенных хлоропластах, используемых для построения калибровочной кривой;
