Введение к работе
Актуальность темы: Основной физиологической функцией фибринолитической системы (FS) является ограничение тромбообразования и обеспечение внутрисосудистого кровотока. Ключевым ферментом FS является плазмин, который непосредственно растворяет фибрин тромба. Плазмин образуется из неактивного предшественника плазминогена под действием тканевого активатора плазминогена (t-PA), двухцепочечной урокиназы (u-РА) и одноцепочечной про-урокиназы (scu-PA). В регулировании активности FS участвуют также ингибиторы плазмина и активаторов плазминогена. Недостаточная активность FS может стать причиной тромбозов и тромбоэмболических заболеваний таких, как инфаркт миокарда, инсульт, ишемия и др. В качестве тромболитических агентов используются как физиологические активаторы плазминогена, так и бактериальный белок стрептокиназа (SK). В последние годы за рубежом проводятся клинические испытания тромболитического агента нового поколения - рекомбинантной стафилокиназы (STA), биохимические свойства которой полностью не изучены.
Скорость образования плазмина зависит как от механизма действия активаторов, так и от конформащш плазминогена. В плазме крови циркулирует, в основном, нативный GIu-плазминоген (93 Ша), который под действием образующегося при его активации плазмина превращается в легче активируемый Lys-плазминоген (85 Ша). Оба плазминогена существуют в виде двух гликоформ, которые отличаются числом и локализацией карбогидратных цепей. Показано значительное различие кинетических параметров активации двух гликоформ Glu-плазминогена фибринспецифичным t-PA, в то время как кинетические параметры активации двух гликоформ Glu- и Lys-плазминогенов урокиназой и стафилокиназой не определены.
Благодаря особенностям строения каждого из компонентов FS, их взаимодействия между собой и с клеточными рецепторами, модулированию этих взаимодействий разными факторами осуществляется сложное ее функционирование в различных состояниях организма Активация или ингибирование активности FS могут быть индуцированы как теми и иными заболеваниями, так и введением в организм лекарственных и др. средств. Актуальной задачей является изучение in vitro влияния эффекторов, присутствующих или образующихся в организме, а также вводимых в организм как лекарственные средства, на кинетику активации плазминогена его активаторами.
К настоящему времени накопились данные, что FS, помимо тромболизиса, участвует во многих физиологических и патологических процессах таких, как ремоделировакие тканей, воспаление и заживление ран, ангиогенез, рост и метастазирование опухолей. Опухолевые клетки высвобождают активаторы плазминогена и их рецепторы, стимулируя тем самым активацию плазминогена в межклеточном матриксе. Образующийся плазмин вместе с активированными им металлопротеиназами вызывает деградацию белков в межклеточном матриксе, создавая условия для мифации эндотелиальных клеток, участвующих в
формирования новых сосудов, которые необходимы для роста опухоли. Кроме того, плазмин, стимулируя разрушение основания мембраны, создает условия для миграции и инвазии опухолевых клеток в дрзтие ткани и органы. В 1994 году было обнаружено ингибирование ангиогенеза и роста опухоли продуктом деградации плазмина -ангиостатином, представляющим фрагмент первых четырех кринглов его тяжелой цепи. Получение новых данных о сложном механизме антиангиогекного действия крингл-фрагментов плазмин(оген)а является актуальной задачей работы. : Известно, что основной функцией ренин-ангиотензиновой системы (RAS) является регуляция сосудистого тонуса Тот факт, что стимулирование RAS увеличивает, а его ингибирование уменьшает риск сердечно-сосудистых заболеваний, указывает на взаимосвязь циркуляторных FS и RAS, механизм которой до конца не известен. К настоящему времени отмечены некоторые функциональные связи циркуляторных FS и RAS человека. Ключевые компоненты FS и RAS могут влиять на активность и/или высвобождение друг друга, за счет чего достигается сложная и многоступенчатая регуляция таких процессов, как образование и лизис тромбов, спазм и расширение сосудов, синтез и расщепление коллагена и адгезивных белков. Помимо кровотока компоненты этих систем могут присутствовать локально во многих тканях и органах, Например, в глазу широко представлены компоненты FS и RAS. Они играют важную роль в патогенезе таких заболеваний, как диабетическая ретинопатия, глаукома, воспалительные процессы и др. Выявление взаимосвязей FS и RAS при развитии воспаления и заживлении травмы глаза после ожога роговицы и эффектов ингибиторов двух систем на эти процессы имеет большое фундаментальное и практическое значение.
Эксперименты in vivo и оценка клинической картины ожоговой болезни глаза кроликов проводились в ФГУ Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца Росмедтехнологий (в лаборатории Биохимии, возглавляемой проф. Чесноковой Н.Б.). Анализ активности АСЕ в различных средах глаза проводился на кафедре химической этимологии химического факультета МГУ (в группе, возглавляемой в.н.с., к.х.н. Кост О.А.). Эта часть исследований была выполнена нами в рамках совместного проекта РФФИ (грант № 06-04-49712). Остальные результаты, включенные в работу, были получены частично в рамках проекта НТП «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онколопіческих, инфекционных и других опасных заболеваний» (Договора с ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» № 34/07- и 34/08-Геп-М).
Цель работы: Целью работы является анализ влияния различных эффекторов на кинетические закономерности и механизм регуляции активности FS.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
— исследовать in vitro влияние отдельных эффекторов и их комбинаций на кинетику
активации Glu- и Lys-плазминогенов его активаторами;
— определить кинетические параметры активации гликоформ 1 и 2 Glu- и Lys-плазминогенов
STA и выяснить роль фибрина и типа гликозилирования зимогена в механизме ее действия;
— изучить влияние ангиостатинов на кинетику активации шшминогена in vitro и
неоангиогенез in vivo;
исследовать in vitro перекрестное влияние ингибиторов FS и RAS на активность ключевых ферментов этих систем;
исследовать in vivo изменение уровней ключевых компонентов FS и RAS в жидких средах и тканях глаз кроликов после ожога роговицы и влияние ингибиторов двух систем на клиническую картину ожоговой болезни.
Научная новизна работы:
Получены новые данные о механизме стимулирования или ингибирования различными эффекторами кинетики активации разных форм шшминогена его активаторами.
Впервые установлено, что фибрин является мощным стимулятором плазминоген-активаторной активности STA и предложен механизм, объясняющий фибрин-селективность ее действия.
Обнаружено перекрестное подавление in vitro активности ключевых ферментов FS и RAS специфичными ингибиторами этих систем.
Впервые выявлена взаимосвязь локальных RAS и FS, функционирующих в жидких средах и в тканях глаз кроликов в ходе воспалительного процесса Показано, что ингибиторы этих систем улучшают процесс репарации ожоговой болезни.
5. Впервые показано, что ингибирование ангиостатинами генерации плазмина из
плазминогена под действием активаторов вовлекается в сложный механизм их
антиангиогепного действия.
Практическая значимость:
Обнаруженное мощное стимулирование фибрином активаторной активности STA, имеет не только научную, но и практическую значимость для улучшения режима терапии этим перспективным тромболитическим агентом.
Выявленные изменения уровней ключевых ферментов FS и RAS в жидких средах и тканях глаз кроликов в ходе развития и репарации воспалительного процесса имеют важное практическое значение для диагностических целей.
Обнаруженное улучшение процесса репарации ожоговой болезни глаз кроликов при обработке ингибиторами FS и RAS, используемыми в медицине как аитифибринолитические или гипотензивные агенты, имеют практическую значимость для терапевтических целей.
Найденное улучшение процесса заживления ожоговой болезни глаз кроликов при введении ангиостатина, имеет практическое значение для терапии.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих конференциях: XLVIII Научной Конференции Московского физико-технического института (Москва, 2005): V, VI, VII и VIII Ежегодных международных молодежных конференциях ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика» (Москва, 2005, 2006, 2007, 2008 гг.); Moscow International Conference "Biotechnology and Medicine" (Moscow, 2006); IV Московском Международном конгрессе «Биотехнология -
состояние и перспективы развития», (Москва, 2007); XXI and XXII Congresses of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Geneva, Switzerland, 2007 and Boston, USA, 2009); VI Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007); XTV Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007); XIX Congress of the International Society for Fibrinolysis and Proteolysis (Vienna, Austria, 2008); IV Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечнососудистой хирургии (Москва 2009); XXII International Conference "Biocatalysis-2009: fundamentals & applications"(ArkhangeIsk, 2009).
Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 26 публикациях, из них: 4 статьи (в том числе 3 работы по списку журналов ВАК) и 22 тезиса докладов на международных и российских конференциях.
Вклад автора состоит в планировании и проведении экспериментов, обработке их результатов и творческом участии в интерпретации, обсуждении и оформлении полученных дашых на всех этапах исследования.
Структура и обьем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения и списка литературы, изложена на 153 страницах машинописного текста и включает 49 рисунков, 20 таблиц и список цитируемой литературы из 265 наименований.
