Введение к работе
Актуальность проблемы. Окисление сукцинатдегидрогеназой (СДГ) янтарной кислоты (ЯНТ) в митохондриях является наиболее мощным процессом энергообеспечения Предшествующими работами МН Кондрашовой и сотрудников, показано, что этот процесс является основным при больших энергетических запросах - работе, стрессе, заболеваниях [Кондрашова М Н. с соавт 1973, 1976, 1982, 1988, 1991) Кроме того, установлено, что ЯНТ в микромолярных концентрациях проявляет регуляторное, "сигнальное" действие, стимулируя выделение адреналина/норадреналина [Maevsky, EI, etal,1982, 2003], которые в свою очередь активируют СДГ и окисление ЯНТ [Kondrashova, М N, etal, 2002, 2003] По - видимому это действие реализуется через специфические рецепторы из группы орфановых (orphan receptors) [Не W et al, 2004] Взаимосвязь окисления ЯНТ и ее сигнального действия с катехоламинами было выделено как новая физиологическая система регуляции - субстратно - гормональная [Kondrashova, М N, et al, 2002, 2005; Maevsky, EI, et al, 2006] Поэтому определение активности СДГ может служить показателем уровня адренэргической регуляции в организме
Исследования механизмов связи физиологических состояний и митохондриальных процессов сформировали новые научные направления - Митохондриальная физиология, Митохондриальные болезни, Митохондриальная медицина Эти области нуждаются во введении специальных стандартных показателей В клинических исследованиях цитохимическое определение активности СДГ в лимфоцитах на мазке крови по восстановлению тетразолиевых красителей является информативным первоочередным уже зарекомендовавшим себя показателем метаболизма в организме [Нарциссов РП, 1969, Зарецкая Ю.М 1983, Петричук СВ, 2005, Поборский 2005] Клиническая цитохимия рассматривает клетку как самостоятельный орган со всеми свойствами целого организма, что в полной мере относится к лимфоцитам периферической крови Лимфоциты рассматриваются не только как клетки специальной иммунной защиты, но и как элементы единой информационной системы, отражающей состояние организма и процесс его развития Биохимические методы определения СДГ не применяются по причине невозможности широкого взятия тканей для выделения митохондрий Но они имеют и другой очевидный, но привычный и потому не учитываемый недостаток Он состоит в нарушении важнейшего с точки зрения биофизики свойства живых тканей - их структурной и ультраструктурной организации в частности, и митохондрий в клетке при их выделении При этом разрушается паракристаллический комплекс ферментов матрикса - метаболой и теряются физические механизмы
регуляции ферментов [Srere Р А 1985, 1987, Fahient L А, 1988; ЛюбаревАЕ 1987, 1989] Недостаточно оцененным преимуществом цитохимического метода является сохранение структурной нативнои организации в мазке Его можно рассматривать как иммобилизацию ферментов на подложке в клеточной среде, которая стабилизирует даже выделенные ферменты на длительное время [Вудворд Дж, 1988]
Однако применяемый состав и концентрации реактивов для этого давно разработанного метода не соответствуют современным биохимическим условиям работы с митохондриями Наиболее известным способом определения СДГ является цитохимический метод Нахлас [Nachlas et al, 1957] и различные его модификации [Нарциссов Р П 1969, Петричук СВ, 2005, Quaglino, D, 1960, Пирс Э,1962, Зарецкая ЮМ 1983] На основании вышеописанного, был разработан новый цитобиохимический метод определения СДГ в лимфоцитах крови (СДГЛФ), сочетающий преимущества биохимического и цитохимического методов и исключающий их недостатки Данное изобретение значительно повышает чувствительность измерения активности СДГ вне организма, в лимфоцитах к изменениям состояния в организме, обусловленным адренэргической регуляцией Это осуществляется путем приближения состава сред к биохимическим условиям При этом необходимо использовать весь комплекс разработанных изменений состава сред, поскольку частичная замена мало эффективна Кроме того, были введены дополнительные определения окисления и действия ЯНТ в митохондриях На основании этих определений предложен более правильный способ расчета физиологической активности СДГЛФ, который сильнее коррелирует с адренэргической регуляцией Предложенные измерения впервые характеризуют действие ЯНТ в митохондриях не по одному показателю, а по специфическому паттерну (узору) характеристик Установлено, что существуют несколько типов паттернов у здоровых животных или людей Они служат чувствительной индивидуальной характеристикой При усилении действия адреналина в организме наблюдается возрастание амплитуды изменений паттернов с прохождением четко выявляемых стадий активации, гиперактивации, ингибирования Для реализации разработанного метода создан стандартный набор сухих реактивов высокой чистоты, позволяющий унифицировать измерения в разных лабораториях
Метод использует традиционную для Института Биофизики современную компьютеризованную видеомикроскопию, что обеспечивает автоматизацию обработки изображений объективность измерения, необходимый для статистической репрезентативности объем выборки
Цель работы Разработка метода определения активности СДГ в лимфоцитах более чувствительного, чем традиционные цитохимические
методы, к уровню адренэргической регуляции в организме, благодаря максимально возможному сохранению структурной организации митохондрий и иммобилизованной СДГЛФ в измеряемом препарате Использование разработанного метода для исследования проблемы участия ЯНТ в энергообеспечении при разных физиологических и патологических состояниях крысы и человека и рекомендации средств оптимизирующих функционирование этого центрального механизма энергообеспечения
Задачи исследования:
-
Разработать оптимальные условия состава среды инкубации (величину рН, влияние ЭДТА, ИЗЛ, набор дополнительных показателей восстановления НСТ) для выявления функциональной активности СДГЛФ
-
Измерить активность СДГЛФ в разработанных условиях при разной степени выраженности адренергической регуляции у крыс (гиперактивные новорожденные крысята, сравнительно с показателями взрослых животных интактных - в покое и при активации адреналином)
-
Определить для группы здоровых добровольцев цитобиохимические показатели взаимодействия ЯНТ с митохондриями
4. Определить у пациентов (с пищевой аллергией и гипертонией) цитобиохимические показатели взаимодействия ЯНТ с митохондриями и сопоставить с их функциональным состоянием организма 5 Участвовать в создании набора реактивов для стандартизации результатов, получаемых в разных лабораториях при определении активности СДГЛФ и других характеристик действия ЯНТ в митохондриях и в патентовании разработанного способа Научная новизна работы. Мы повысили информативность существующих, ставших традиционными цитохимических методов определения активности СДГЛФ за счет разработки среды, приближенной к внутриклеточной, проведения дополнительных измерений комплекса нескольких показателей восстановления НСТ, определяющих не только активность, но и функциональное состояние СДГ по специфическому паттерну - узору характеристик, и введением нового способа расчета, более точно определяющего активность СДГ ("Истинная" активность)
Благодаря этому выявили несколько уровней функциональной активности СДГЛФ, при разных состояниях организма.
Впервые у новорожденных крысят выявили гиперактивацию СДГЛФ, по сравнению с взрослыми животными в покое и при физиологической активации адреналином
Впервые в группе здоровых обследуемых выявлены четыре типа цитобиохимических паттернов взаимодействия ЯНТ с митохондриями, свидетельствующих о разном функциональном состоянии СДГЛФ, включая неизвестное ранее латентное состояние
Впервые у пациентов с пищевой аллергией и гипертонией
обнаружены четыре типа цитобиохимических паттернов,
свидетельствующих о разном функциональном состоянии СДГ, отличающихся от здоровых утратой латентного состояния, увеличением амплитуды показателей и активирующим действием ИЗЛ.
Величина амплитуды прогрессивно нарастает при развитии активации и патологии (это явление названо метаболическая гипертрофия) и может служить более чувствительным показателем выявления, развития и эффективности лечения гипертонии, чем просто измерение артериального давления
Научно-практическая значимость. 1 Разработанный метод соответствует запросам новых областей медицины- «Митохондриальных болезней» и «Митохондриальной медицины», учитывающих ведущую роль первичных и вторичных повреждений митохондрий в развитии и лечении заболеваний Он является прямым показателем активности наиболее мощного процесса энергообеспечения в митохондриях -окисления ЯНТ и может служить для диагностики и контроля лечения
2 Как другие функциональные показатели, этот метод должен быть
стандартизован Учитывая высокую чувствительность цитохимического
определения к качеству реактивов, для получения стандартных
результатов с нашим участием разработан и запатентован стандартный
набор реактивов биохимической квалификации
3 На основании определения уровня реактивности организма с помощью
описанного метода возможно подбирать индивидуальную дозу лекарств
и сочетать лекарства с природными регуляторами активности СДГ В
частности, на основании наших результатов представляется
перспективным использование ИЗЛ, как метаболита, выражение
нормализующего начальные патологические сдвиги - гиперактивацию
СДГ, а также и более глубокие - активировать ингибированную СДГ
Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы доложены на II международной научно - практической конференции «Медбиотек Перспективы развития биотехнологии в России», (Пущино 2005), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино 2005, 2007), на 10-й международной школе -конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино 2006), I Всероссийская научно-практическая конференция "Теория и практика использования новой техники и новых технологий в здравоохранении", (Сочи, 2006), 14th European Bioenergetics Conference, ЕВЕС, (Moscow, 2006), Симпозиуме «Регуляторы энергетического обмена» (Томск, 2007)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 статьи
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д б н проф М Н Кондрашовой за предложенную тему и руководство работой, неоценимую профессиональную помощь и всестороннюю поддержку; д б н проф Г Д Мироновой за советы при написании диссертации, дмн проф ЕЙ Маевскому за помощь при статистической обработке результатов и важные замечания при обсуждении результатов экспериментов, особую благодарность не MB Захарченко и АВ Захарченко которые непосредственно принимали участие в выполнении настоящих исследований
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, описания методов исследования, изложения
результатов исследования и их обсуждения, основных выводов работы,
списка литературы Диссертация изложена на страницах
машинописного текста, содержит рисунков и таблиц Список
литературы включает наименований
