Содержание к диссертации
Список использованных сокращений 4
Введение б
Глава I. Обзор литературы. 10
1.1. Метод фотодинамической терапии 10
1.1.1. Молекулярные механизмы фотодинамического действия ФС 14
1.1.2. Реакционная способность АФК по отношению к биологическая
молекулам 16
I. 1.3. Механизмы селективного накопления и локализации ФС в опухоли... 17
I. 1.4. Биологические процессы, вызываемые ФДТ 19
I. 1.5. Способы доставки противоопухолевых препаратов 20
I. 1.6. Особенности химического строения и синтеза PC и хлоринов 23
I. 1.7. Физико-химические свойства ФС 24
1.1.8. Биологические свойства ФС 27
I. 1.8. 1. Связывание ФС с компонентами плазмы крови и сыворотки. 27
-
Механизмы проникновения, локализация и накопление ФС в клетках 31
-
Накопление ФС в различных тканях и органах 34
1.2. Исследование ФС методами оптической микроскопии и спектрального
анализа 36
-
Базовые исследования основных физико-химических свойств ФС 36
-
Исследования ФС внутри клеток 39
-
Исследования локализации и накопления ФС в различных тканях и органах 42
Цель и задачи исследования 44
Глава II. Материалы и методы 45
II. 1. Химические реагенты 45
П.2. Использованные ФС 46
П.З. Изготовление липосом 48
II.4. Используемые приборы 49
П.5. Измерение генерации активных форм кислорода (АФК) 58
II.6. Определение фотостабильности ЦИХЛ 60
П.7. Молекулярные взаимодействия ФС в растворах 60
II.8, Эксперименты на культуре клеток 61
П.9. Приготовление экстрактов тканей мышей 64
11.11. Разработка методик КОМИРСИ 64
II.11.1. Методика изучения связывания ФС с компонентами плазмы и сыворотки крови на основе комбинирования методов гель-электрофореза и
КОМИРСИ 65
II. 11.2. Методика измерения концентрации ФС и их комплексов в живых
клетках методом КОМИРСИ 67
II. 11,3. Методика определения внутриклеточной локализации ФС методом
КОМИРСИ 70
II. 11.4. Методика исследования распределения ФС в срезах тканей методом
КОМИРСИ 71
IIЛ 1.5. Спектральные измерения и их обработка 72
Глава III. Результаты и обсуждение 75
III. 1. Исследование ФС на основе сульфатированных фталоцианинов.
III. 1.1. Исследование молекулярных взаимодействий сульфатированных
фталоцианинов 75
III. 1.1.1. Особенности состояния и спектров PcSn в органических
растворителях 75
IIIЛ Л.2 Исследование взаимодействий PcSn с модельными системами,
имитирующими мембраны, и биологическими молекулами 77
IIIЛ .2. Анализ накопления PcS2,4 клетками 78
-
Исследование распределения и взаимодействий Рс5г,4 в различных структурах опухолевых тканей 86
-
Исследование связывания 3-AlPcS4 с ЧСА 92
III. 1.5. Исследование методом КОМИРСИ накопления и распределения
препарата «Фотосенс» в различных тканевых структурах меланомы кожи
пациента , 98
Ш.2. Исследование ФС на основе циклоимидных производных хлорина
рб 102
Ш.2.1. Исследование физико-химических свойств ЦИХЛ 104
III.2.1.1. Исследование солюбилизаторов для приготовления стоковых
растворов ЦИХЛ 104
Ш.2.1.2. Исследование взаимодействия липосом, несущих углеводные детерминанты для направленной доставки ФС к опухолевым клеткам, с
клетками меланомы 107
Ш.2.1.3. Исследование молекулярных взаимодействий ЦИХЛ ИЗ
Ш.2.1.4. Фотостабильность ЦИХЛ 117
Ш.2.1.5. Исследование генерации АФК 119
Ш.2.1.5Л. Исследование генерации "ОН и 'Ог 119
Ш.2.1,5.2. Исследование генерации 02*~ 121
Ш.2.2. Исследование фотобиологических свойств ЦИХЛ. 125
Ш.2.2.1. Исследование связывания ЦИХЛ с компонентами плазмы крови
и сыворотки 125
Ш.2.2.2. Исследование фармакокинетики ЦИХЛ1 в экстрактах тканей
экспериментальных животных 132
Ш.2.2,3. Исследование ЦИХЛ в живых клетках 134
Ш.2.2.3Л. Выбор солюбилизатора для приготовления стоковых
растворов ЦИХЛ 134
III.2.2.3.2. Особенности состояния ЦИХЛ в клетках 134
Ш.2.2.3.3. Внутриклеточная локализация ЦИХЛ 138
Ш.2.2.3.4. Особенности внутриклеточного накопления и удержания
ЦИХЛ 145
Ш.2.2.3.5, Фототоксичность и темповая токсичность 149
Ш.2.2.3.6. Изучение механизма мембранного и внутриклеточного
транспорта ЦИХЛ 151
Заключение 154
Выводы 156
Список использованной литературы. 159
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
AlPcSi, AIPCS2, AIPCS3, AIPCS4 - моно-, ди-, три-, тетрасульфатированные фталоцианины алюминия
AIPcSn, ZnlPcSn - сульфатированньїі фталоцианины алюминия и цинка Azt- азидо-З'-деокситимидин
BODIPY-церамид - Н-((4-(4,4-дифлуоро-5-(2-тионил)-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-3-ил) фенокси)ацетил)сфингозин
BPDMA - монокислотное производное бензопорфирина CrEL - Кремофор EL "ОН - гидроксильный радикал О2 - синглетный кислород Ог'~ - супероксид-ион Н2О2 - перекись водорода НО2" - гидропероксидный радикал LT - Lyso Tracker Yelow L-Тгр — триптофан MACE - N-моноаспартил хлорина еб mTHPC - тетра(.и-гидроксифенилхлорин) PC- фталоцианины
PcSi, РсЭг, РсЭз, PcSa -моно-, ди-, три-, тетра сульфатированные фталоцианины соответственно
PcSi,s, PcS2,4 и PcS3.g- смесевые субстанции со средним числом сульфогрупп 1,5, 2,4 и 3,8, соответственно
PcSn- безметальный сульфатированный фталоцианин Rho-ФЭ - Ы-(лиссамин родамин В сульфонил)фосфатидилэтаноламин Rho-ФЭ - Ы-(лиссамин родамин В сульфонил)фосфатидилэтаноламин TPPS - тетра(4-сульфонатофенил)порфирин TrTR - трансферин конъюгированный с техасским красным W- варфарин ZnPc- фталоцианин цинка АЛК - 5-аминолевуленовая кислота АО - акридин оранжевый АФК - активные формы кислорода БАС - биологически активное соединение
БСА - бычий сывороточный альбумин ДМСО- диметилформамид ДМФХ - димиристоилфосфатидилхолин
КОМИРСИ- метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений
ЛВП- липопротеины высокой плотности ЛНП- липопротеины низкой плотности ЛОНП- липопротеины очень низкой плотности МТТ - 3-(4,5-димитилтиазол-2-ил)-2,5-бифенил тетразолий бромид НДМА - 4-нитрозо-Ы,Ы-диметиланилин НК - нильский красный НСТ - нитро синего тетразолия
Ш - конфокальный сканирующий микроспектрометр V-45 фирмы Dilor (Франция) П2 - экспериментальная установка для конфокальной микроспректроскопии, созданная в ИБХРАН
ПААГ - полиакриламидный гель Р6Ж - родамин 6Ж СЧ - судан черный В ФДТ - фотодинамическая терапия ФИ - фосфатидилинозит ФС - фотосенсибилизатор ЦИХЛ - циклоимидные производные хлорина рб ЧСА - человеческий сывороточный альбумин ЭР - Эндоплазматический ретикулум ЭТС -эмбриональная телячья сыворотка ЯФХ - яичный фосфатидилхолин
Введение к работе
Применение методов оптической микроскопии в биологии и медицине имеет давнюю историю. Основоположник научной микроскопии Левенгук А., изготовив линзы с 300 кратным увеличением, впервые наблюдал биологические объекты и их движение в капиллярах еще в 1673 году. Сейчас при стремительном развитии науки методы оптической микроскопии являются неотъемлемым этапом в исследовании биологических объектов и механизмов действия лекарственных препаратов. Наибольший интерес сейчас представляет наблюдение живых объектов в реальном времени, что исключает артефакты, происходящие с биологическим объектом в процессе его приготовления (фиксации, окрашивания и т. п.). Это стало возможным благодаря развитию лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, позволяющей получать трехмерные изображения объектов во времени. Получить дополнительную информацию о биологически активном соединении (БАС), его состоянии и микроокружении в биологическом объекте можно дополнив конфокальную микроскопию методами спектрального анализа. В связи с этим был предложен метод конфокальной микроскопии и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ). Метод КОМИРСИ основан на измерении с субмикронным пространственным разрешением и анализе в каждой точке сканируемого объекта полных спектров флуоресценции. Это позволяет установить пространственное распределение исследуемого БАС и его молекулярных комплексов в сканируемом объекте, учтя вклад собственной флуоресценции объекта в общий флуоресцентный сигнал. По спектрам флуоресценции можно определить микроокружение и молекулярные взаимодействия БАС, имеющие непосредственное отношение к его функциональной активности.
В данной диссертации представлены результаты разработки метода КОМИРСИ применительно к исследованию новых противоопухолевых соединений фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ). Метод ФДТ - новое направление лечения рака, получившее широкое развитие в России. Он основан на накоплении в опухолевой ткани введенного в организм ФС, действие которого активируется локальным световым облучением и сопровождается генерацией активных форм кислорода (АФК), приводящих в итоге к гибели опухолевых клеток [Dougherty, 2002; Dougherty et at., 1998]. ФДТ выгодно отличается от химиотерапии избирательностью поражения опухоли и отсутствием общего токсического воздействия на организм, благодаря чему интерес к методу ФДТ в клинической онкологии в России растет от года к году. В связи с этим в качестве объектов исследования были выбраны новые перспективные отечественные ФС. ФС идеально подходят для исследования методами
7 флуоресцентной микроскопии и спектроскопии благодаря их интенсивному поглощению и флуоресценции в красной и ближней ИК-области.
Применяемые в клинике ФС первого поколения имеют поглощение в области 620-640 нм, где глубина проникновения света в ткани мала. Это затрудняет лечение опухолей больших размеров, требует больших доз препарата и высокой мощности терапевтического излучения. Проницаемость тканей для света возрастает с увеличением длины волны излучения, обеспечивая более глубокое поражение опухоли. Одной из задач ведущейся в настоящее время разработки ФС нового поколения является сдвиг их длинноволнового поглощения в область оптимального проникновения света для ткани: 700-800 нм. Кроме того, разработка новых ФС направлена на улучшение их фотофизических характеристик, избирательности накопления в опухоли, увеличение фототоксичности, уменьшение побочных эффектов, в частности, за счет оптимизации скорости выведения ФС из кожи больного.
В рамках данной диссертационной работы были разработаны универсальные методики изучения ФС методами оптической микроскопии и спектроскопии, позволившие заполнить пробелы в исследовании новых ФС на пути от синтеза до клиники. Методики отработаны и их применимость доказана в исследованиях двух ФС второго поколения на основе сульфатированных производных фталоцианина: тетрасульфатированного фталоцианина алюминия и безметального сульфатированного фталоцианина. Использование отработанных методик позволило провести комплексное исследование другой группы перспективных ФС нового поколения на основе циклоимидных производных хлорина рб.
Сульфатированные фталоцианины являются одним из перспективных классов фотосенсибилизаторов второго поколения. Выбор сульфатированных фталоцианинов обусловлен их низкой темновой токсичностью, высокой фотостабильностью и высокой фотодинамической активностью по сравнению с порфириновыми аналогами, применяемыми на данный момент в клинической практике. Кроме того, синтез этих соединений относительно прост и дешев. Наибольшей активностью из известных металло-комплексов обладают сульфатированные фталоцианины алюминия и цинка. На основе смеси сульфофталоцианинов алюминия с различной степенью сульфатирования предложен отечественный препарат "Фотосенс", который сейчас уже начал применяться в клинике [Соколов и др., 1995].
Тетрасульфатированный фталоцианин алюминия - один из компонентов, входящих в состав фотосенса. Именно этот компонент фотосенса накапливается в высоких концентрациях в прилегающей к опухоли соединительной ткани [Feofanov et al, 1999].
8 Вследствие этого фотодинамическое воздействие фотосенса, по-видимому, в значительной степени происходит за счет разрушения окружающих и питающих опухоль тканевых структур. С целью выяснения возможных переносчиков тетрасульфатированного фталоцианина алюминия в крови в диссертации было проведено детальное исследование связывания этого соединения с транспортным белком плазмы крови- человеческим сывороточным альбумином (ЧСА).
Среди работ по исследованию фталоцианинов существует ряд публикаций, в которых безметальные сульфатированные производные фталоцианина (PcS„, где п-среднее число сульфогрупп на молекулу) признаны фотодинамически неактивными [Brasseur et al., 1987; Sonoda et al., 1987; Evensen et al., 1987; Rosenthal, 1991]. По результатам этих работ дальнейшее изучение PcSn было признано бесперспективным.
Разработанная сотрудниками ГНЦ "НИОПИК" новая методика синтеза PcS„ дала возможность перепроверить фотодинамический эффект с применением данных соединений. Как показали эксперименты, новосинтезированные PcSn обладают существенной фотодинамической активностью in vitro и in vivo. Так, по данным исследований, проведенных в МНИОИ им. П. А. Герцена, фотодинамический эффект с применением PcS2,4 в несколько раз превышал активность металлозамещенных сульфофталоцианов и других исследовавшихся ранее эффективных ФС на основе порфирина и хлорина. Это свидетельствовало о перспективности дальнейших исследований данного соединения и разработки на его основе препарата для фотодинамической терапии.
Механизм действия сульфатированных фталоцианинов как на тканевом, так и на клеточном уровне до настоящего времени был не изучен. В связи с этим, в данной диссертации были исследованы: локализация, кинетика накопления и удержания PcSn клетками; зависимость внутриклеточной концентрации от концентрации сенсибилизатора во внеклеточной среде; механизм проникновения препарата в опухолевые клетки. Было проведено изучение локализации и уровня накопления в клетках смесевых субстанций PcSn с различной степенью сульфатирования.
Для направленного создания эффективного ФС необходимо глубокое понимание взаимосвязи между структурой молекулы, ее физико-химическими и биологическими свойствами. К настоящему времени изучено много соединений, обладающих эффективной генерацией АФК [Sternberg and Dolphin, 1998]. Однако на основе опубликованных данных довольно сложно проследить закономерности влияния структуры на свойства ФС в биологических системах (клетках и тканях), так как отличия затрагивают и хромофорный центр, и боковые заместители. Многие известные ФС предоставляют ограниченные возможности для направленной модификации их структуры. Например, фталоцианины и нафталоцианины - симметричные молекулы, и введение заместителей происходит сразу по нескольким положениям с равной эффективностью [Ambros, 1991]. Еще сложнее ввести в эти ФС разные функциональные группы, и тем более, контролировать их взаимное расположение.
Для изучения возможности управления свойствами ФС за счет изменения структуры, нами была исследована серия циклоимидных производных хлорина рб (ЦИХЛ) с различными заместителями в пиррольных циклах A, D и имидном цикле Е (рис. 2). ////Разработаны/синтезированы в лаб. проф. А.Ф. Миронова МИТХТ/// ЦИХЛ являются новой группой ФС, поглощающих в более длинноволновой области, чем фталоцианины (максимумы поглощения лежат в диапазоне 690-750 нм). Было исследовано влияние электроноакцепторных заместителей, заряда и степени гидрофобное заместителей на фотохимические и биологические свойства ЦИХЛ, такие как растворимость, молекулярные взаимодействия с биологическими молекулами, фотостабильность, способность образовывать АФК, механизм проникновения в клетки, количественные параметры накопления в опухолевых клетках и особенности клеточной фармакокинетики, связывание с различными компонентами плазмы крови и сыворотки. Знание этих характеристик и их взаимосвязей со структурой молекулы позволяет глубже понять механизмы действия ФС и прогнозировать их эффективность in vivo.
