Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1 Структурно-функциональная организация фотосинтетического аппарата растений и водорослей 7
1.2 Природа быстрой флуоресценции хлорофилла «а» в фотосинтетических мембранах 10
1.3 Методы измерения быстрой флуоресценции хлорофилла и аппаратура для изучения состояния природного фитопланктона и растительных организмов 15
1.4 Перспективы использования флуоресцентных методов в экологическом мониторинге 22
Глава 2. Результаты и обсуждение
2.1 Разработка флуорометрических приборов для диагностики состояния фотосинтезирующих объектов 29
2.1.1 Зонд-флуорометр 29
2.1.2 Бортовой флуорометр 49
2.1.3 Проточный флуорометр 52
2.1.4Микрофлуорометр 56
2.1.5 Флуорометрический индикатор физиологического состояния растений 60
2.1.6 Импульсный флуорометр для бесконтактной регистрации флуоресценции хлорофилла посева растений 85
Заключение 96
Список литературы 101
- Природа быстрой флуоресценции хлорофилла «а» в фотосинтетических мембранах
- Перспективы использования флуоресцентных методов в экологическом мониторинге
- Зонд-флуорометр
- Флуорометрический индикатор физиологического состояния растений
Введение к работе
Совершенствование методов биоиндикации состояния окружающей среды в условиях постоянно возрастающего антропогенного воздействия на наземные и водные экосистемы остается одной из актуальных задач в системе экологического контроля и рационального природопользования. Насущная потребность выяснения степени загрязнения окружающей среды вызывает необходимость разработки оперативных методов оценки ее состояния. По мнению многих экологов, оценка качества среды должна иметь интегральный характер. Выяснение степени загрязнения среды только с позиции действия предельно допустимых концентраций токсических веществ не учитывает возможного эффекта от нескольких факторов в различных сочетаниях. Предпочтительной в этом отношении представляется биологическая оценка среды обитания, основанная на показателях "самочувствия" организма, -биоиндикации и биотестировании (В.М.Захаров, Д.М. Кларк, 1993).
Воздействие на организм неблагоприятных условий среды может вызвать множество специфичных ответных реакций и приводить к переходу организма в стрессовое состояние. Такие воздействия могут оказывать влияние на все метаболические процессы в организме, в том числе и на процессы фотосинтеза, являющиеся главным поставщиком энергии у растений. В связи с этим функционирование ФСА оказывается наиболее значимым для определения состояния растения в целом.
В настоящее время в экологических исследованиях все большее распространение получили люминесцентные методы оценки физиологического состояния растений. Эти методы обладают высоким быстродействием, точностью, позволяют проводить измерения на растительных объектах в природных условиях. Широкий круг исследований, проводимых методами измерения флуоресценции хлорофилла фотосинтезирующих организмов, показал что соотношение интенсивности флуоресценции хлорофилла при насыщающем фотосинтез возбуждающем свете (Fm) и при облучении светом низкой интенсивности, не вызывающем изменений состояния фотосинтетического аппарата (Fq), позволяет определить эффективность
утилизации света в ходе фотосинтеза, которая равна (Fm - Fo)/Fm. Эта безразмерная энергетическая характеристика фотосинтеза, аналогична коэффициенту полезного действия, является универсальной и не зависит от видовой специфики организма. Показано, что по флуоресценции хлорофилла, возбуждаемой источниками импульсного света, можно определить такие показатели долгосрочной адаптации к условиям выращивания объекта, как размеры фотосинтетической антенны ФС2 и величину пула хинонов (Kolber et al, 1998). В ответ на длительное (десятки минут) воздействие света можно определить величину потока электронов по цепи фотосинтетического электронного транспорта и оценить возможности системы срочной защиты от избыточного облучения по нефотохимическому тушению.
Использование флуоресцентных методов исследования состояния ФСА конкретных природных объектов (высшие растения, водоросли) требует разработки специальной аппаратуры. Для высших растений представляет интерес как исследование отдельных органов (листья, побеги), так и интегральные характеристики растения в целом, а также посева (группы) растений. Для исследования природных популяций водорослей интерес представляет распределение фитопланктона в толще воды, а также исследование индивидуальных клеток массовых видов фитопланктонных сообществ.
В результате проведенных работ созданы, испытаны и используются для поведения экологических исследований следующие приборы:
зонд-флуорометр, предназначенный для измерения в природных водах {in situ) на глубине до 200 м обилия фитопланктона и эффективности функционирования его фотосинтетического аппарата, а также регистрирующий подводную облученность и температуру, что позволяет рассчитывать первичную продукцию;
проточный флуорометр, предназначенный для измерения в природных водах по ходу судна обилия фитопланктона и эффективности функционирования его фотосинтетического аппарата и снабженный спутниковой системой непрерывной регистрации географических координат;
бортовой флуорометр для исследования адаптационных характеристик состояния фотосинтетического аппарата проб природного фитопланктона и культур водорослей;
микрофлуорометр, позволяющий измерять параметры флуоресцентные одиночных клеток водорослей;
дистанционный флуорометр для бесконтактного измерения эффективности фотосинтеза и скорости прироста биомассы посевов высших растений;
флуорометрический индикатор функционального состояния фотосинтетического аппарата листьев и однолетних побегов высших растений, предназначенный для проведения массовых обследований деревьев и кустарников на больших территориях.
Природа быстрой флуоресценции хлорофилла «а» в фотосинтетических мембранах
Часть энергии, поглощенной пигментами фотосинтетического аппарата, высвечивается обратно в виде флуоресценции или диссипирует в тепло. При комнатной температуре в спектре флуоресценции наблюдается преимущественно полоса при 685 нм, принадлежащая антенному хлорофиллу а ФС2. При понижении температуры проявляются длинноволновые полосы флуоресценции при 710-730 нм, связанные с хлорофилл-белковым комплексом (ХБК) ФС1, а также полоса при 695 нм, принадлежащая ХБК ФС2 (Krause, Weis, 1991). Вспомогательные пигменты in vitro, из-за высокой скорости миграции энергии на хлорофилл не флуоресцируют (Wilhelm, 1990). Исключение составляют фикобилипротеины (Glazer, 1984).
Подавляющая часть флуоресценции, наблюдаемой при изучении листьев высших растений или водорослей, генерируется в ФС2. Вследствие высокой эффективности дезактивации возбужденного состояния Р680 и разделения зарядов в РЦ, флуоресценция ФС2 характеризуется низкими значениями квантового выхода (1—3%) и времени затухания (100—200 пс) (Klimov et al., 1977; Haehnel et al,. 1982; Haworth et al., 1983). При комнатной температуре вклад ФС1 во флуоресценцию крайне мал (Krause, Weis, 1991).
Реакционный центр ФС2 состоит из специальной молекулы хлорофилла Р680, которая в возбужденном состоянии является первичным донором электрона для первичного хинонного акцептора Qa. Восстановление Р680+ происходит очень быстро, менее чем за 1 мкс, а скорость окисления Qa" значительно меньше и лимитируется темновыми реакциями. Состояние реакционного центра ФС2 в котором Р680 восстановлен, Qa окислен, называется открытым. Через время порядка 1 мкс после разделения зарядов и появления первичной пары Р680+ происходит восстановление Р680+ от вторичных доноров. В результате РЦ оказывается состоянии P680Qa которое называется закрытым (Goh, Schreiber, Hedrich et al., 1999; Renger, 1992).
Энергия кванта света, поглощенного в ФС2, может быть превращена в энергию разделенных зарядов P680+Qa" которая используется в дальнейших реакциях фотосинтеза, либо потеряна путем излучения кванта флуоресценции или рассеяния в тепло. Эти три процесса характеризуются константами скорости KPh, Kf и Kd, соответственно.
При открытом состоянии реакционных центров эффективность использования энергии возбуждения в фотосинтезе высока, вероятность потери энергии минимальна и квантовый выход флуоресценции, K/(KPh + Kf + КД минимален и составляет около 2%. Снижение выхода флуоресценции хлорофилла в результате использования энергии света в первичных реакциях фотосинтеза называют фотохимическим тушением флуоресценции хлорофилла. При закрытых реакционных центрах фотохимическое разделение зарядов становится невозможным и квантовый выход флуоресценции возрастает до Kj/(Kf + Kd) и составляет около 5%. Разность между максимальным и минимальным выходом флуоресценции называется переменной флуоресценцией. Эта величина пропорциональна той части энергии света, которая используется в фотохимических реакциях фотосинтеза при открытых реакционных центрах ФС2 и теряется в виде флуоресценции и тепла при закрытых реакционных центрах. Из приведенных выше соотношений связи значений выхода флуоресценции при открытых и закрытых реакционных центрах следует одно из важнейших соотношений Fv/Fm = Kph/(Kph + Kf + Kd), т.е. отношение интенсивностей переменной и максимальной флуоресценции равно квантовому выходу использования энергии света открытыми реакционными центрами ФС2. По изменению этой величины можно судить о потенциальной эффективности первичных процессов фотосинтеза в ФС2. В настоящее время этот параметр флуоресценции, как показатель состояния и эффективности функционирования ФСА, широко используется в фундаментальных и прикладных исследованиях. (Антал и др., 1999, 2000, 2001; Казаков, Маторин, 1998; Маторин, Венедиктов, 1990; Маторин, 1985, 2000; Маторин и др., 1997, 2002, 2004; Павлов и др., 2004; Ficek et al., 2000; Pogosyan, Matorin, 2005). В ответ на включение возбуждающего света у адаптированного в темноте объекта происходят изменения во времени интенсивности флуоресценции хлорофилла. Таким образом, можно наблюдать характерную индукционную кривую флуоресценции, в которой различают несколько фаз (Рис. 2) (Hansen et al., 1991; Lazar, 1999a, 1999b; Riznichenko et al., 1996). Параметры кинетики изменения амплитуды флуоресценции хлорофилла а обладают большой информативностью для характеристики состояния ППФ (Bukhov et al., 2003, 2004). Это связано с тем, что изменения состояния ФСА сопровождаются изменением вероятности тушения электронного возбуждения молекул хлорофилла, что и проявляется в изменении квантового выхода флуоресценции при освещении (эффект Каутского) (Govindjee, 1995). Сложная кинетика нарастания переменной флуоресценции хлорофилла отражает последовательное заполнение различных пулов пластохинона на акцепторной стороне ФС2, а кинетика затухания — гетерогенность окисления восстановленного пула.
Сложная кинетика нарастания переменной флуоресценции хлорофилла отражает последовательное заполнение различных пулов пластохинона на акцепторной стороне ФС2, а кинетика затухания — гетерогенность окисления восстановленного пула и процессы нефотохимического тушения. Интенсивность флуоресценции при включении света быстро возрастает до уровня О (origin), который соответствует квантовому выходу флуоресценции при открытых реакционных центрах ФС2 (F0); скорость подъема определяется только временем нарастания интенсивности света при открытии затвора. В дальнейшем интенсивность флуоресценции возрастает до уровня промежуточного максимума I (initial). Вслед за тем возможно небольшое снижение до уровня D (dip), которое наблюдается не всегда и сменяется подъемом до максимума Р (peak). Последующие изменения интенсивности флуоресценции приводят к снижению ее уровня до стационарного состояния Т (terminal) через ряд промежуточных фаз S (steady-state) и М (maximum). Быстрые фазы увеличения квантового выхода до уровня Р отражают уменьшение фотохимического тушения связанное с восстановлением первичного хиноннного акцептора Qa и пула пластохинона PQ. При длительной предварительной темновой адаптации образца или при достаточно высокой интенсивности действующего света, выход флуоресценции на уровне Р может быть равен Fm. Дальнейшие фазы индукции флуоресценции, приводящие в конечном счете к снижению выхода флуоресценции обусловлены, с одной стороны, возрастанием фотохимического тушения при активации темновых реакций углеродного метаболизма и соответствующим уменьшением степени восстановленности хинонных акцепторов ФС2, а с другой стороны -развитием процессов нефотохимического тушения, которое вызывается целым рядом процессов, таких как электрохимический потенциал протонов на мембране, тушение каротиноидами, циклический перенос электронов в ФС2, и фоторазрушение реакционных центров ФС2 (Aro et al., 1993; Demmig-Adams, Adams, 1992; Vassiliev et al, 1994).
Использование импульсных флуорометров позволило выяснить механизмы процессов, происходящих при включении и выключении постоянного освещения. В адаптированных к темноте листьях все центры фотохимически активны и флуоресценция соответствует уровню F0. При освещении их насыщающей вспышкой флуоресценция становится максимальной (Fm) и быстро релаксирует в темноте до исходного уровня. На постоянном свету происходит частичное восстановление Qa. Освещение образца на этом фоне постоянного освещения насыщающей фотосинтез вспышкой увеличивает уровень флуоресценции но только до величины F m, меньшей чем Fm, т.к. имеет место нефотохимическое тушение флуоресценции, связанное с диссипацией части энергии возбуждения в РЦ и фотосинтетической антенне. Оно обусловлено, по крайней мере, тремя процессами: энергизационным ДрН-зависимым тушением, уменьшением сечения поглощения ФС2 вследствие перехода части фосфорилированных ССК к ФС1 и фотоингибированием ФС2 (Walters, Horton, 1993; Weis, Berry, 1987). Таким образом, разница между максимальной флуоресценцией Fm и F m обусловлена той частью флуоресценции, которая тушится за счет нефотохимических процессов. Все эти процессы отражаются на кинетической кривой, которая имеет немонотонный характер. При длительной экспозиции листьев на сильном свету флуоресценция сначала возрастает до Fm, затем снижается до F m за счет нефотохимического тушения (Рубин, 2000; Krause, Weis, 1991).
Перспективы использования флуоресцентных методов в экологическом мониторинге
На долю фитопланктона приходится почти половина фотосинтетической биологической продукции Земли. В морских экосистемах фитопланктон является главным источником органического вещества и фундаментом практически всех пищевых цепей. Поэтому обилие фитопланктона является одним из необходимых показателей экологического состояния акваторий, что нашло отражение в нормативных документах России и других стран (Левашов, 2003; Сиренко, 1988).
В 50-е годы прошлого века были разработаны спектрофотометрические методы определения хлорофилла в экстрактах органических растворителей. С тех пор мерой обилия водорослей было принято считать содержание в них хлорофилла а. Принципиальный недостаток такого подхода давно известен специалистам и неоднократно обсуждался. Хотя все водоросли содержат хлорофилл а, различные таксономические группы фитопланктона имеют значительно различающийся набор пигментов, ассоциированных в ФСА. Соотношение между содержанием хлорофилла а и дополнительных фотосинтетических пигментов может варьировать в широких пределах у различных групп водорослей и зависит от условий обитания водорослей.
Анализ современных подходов к определению обилия фитопланктона и большой опыт российских и зарубежных исследований показывает, что наиболее оперативным и чувствительным для решения этой задачи являются измерения интенсивности флуоресценции хлорофилла водорослей в природной воде. Использование флуорометрического метода для определения хлорофилла в составе фитопланктонных водорослей не предполагает какой-либо предварительной подготовки воды для измерения. В современных приборах время измерения параметров флуоресценции не превосходит 5 секунд для самых бедных по содержанию фитопланктона вод, когда для повышения точности необходимо произвести накопление нескольких сотен индивидуальных измерений.
Впервые метод определения концентрации хлорофилла фитопланктона по интенсивности флуоресценции при возбуждении постоянным светом был предложен Лоренцом (Lorenzen, 1966). Флуоресцентный метод оценки концентрации хлорофилла нашел широкое применение в экологии и гидробиологии как при работе с фитопланктоном in vivo, так и при определении концентрации пигментов, экстрагированных органическими растворителями из клеток водорослей (Маторин и др., 2004; Fadeev et al., 1999; Ostrowska et al., 2000a, 2000b).
Достоинством метода служит быстродействие и высокая чувствительность по сравнению с прямым спектрофотометрическим определением пигментов (Карабашев, Ханаев, 1983; Dieter, 1986). Вместе с тем, использование этого метода в полевых условиях сопряжено с трудностями, вызванными гетерогенностью фитопланктона и изменением его квантового выхода флуоресценции под влиянием факторов среды (Pogosyan et al., 1996). Для увеличения точности при определении хлорофилла предлагается по возможности проводить измерение флуоресценции в постоянных условиях и периодически калибровать флуорометр по стандартным методикам. Добавление к фитопланктону диурона (ингибитора транспорта электронов в акцепторной части ФС2) существенно уменьшает изменения флуоресценции, вызванные изменением физиологического состояния растительного организма (Keller, 1987; Kiefer, Reynolds, 1992; Putt et al., 1987).
Зависимость выхода флуоресценции от состояния водорослей позволила предложить методы определения фотосинтетической продукции (Калачев и др., 1983; Bates, Piatt, 1984). Для такого определения было использовано увеличение выхода флуоресценции фитопланктона на свету после введения диурона или атразина. Показано, что относительная переменная флуоресценции Fv/Fm коррелирует с первичной продукцией фитопланктона (Antal, 2001). В работе (Гольд и др., 1984) предложено при определении фотосинтетической продуктивности учитывать таксономические группы водорослей путем регистрации флуоресценции при возбуждении в разных областях спектра. Описание ряда конкретных зондирующих устройств для работ с фитопланктоном в природных условиях приведено в книге (Карабашев, 1987; Маторин и др., 1996; Левашов, 2003; Pogosyan, Matorin, 2005). Существуют приборы, в которых флуоресценция возбуждается естественным освещением, однако в большинстве флуорометров применяется искусственное возбуждение постоянным или импульсным освещением. Для контактного зондирования флуоресценции могут быть использованы флуорометры, помещенные на борт судна или лодки, с применением отбора проб или проточных кювет, через которые посредством шланга или помпы непрерывно прокачивается вода, что позволяет осуществлять непрерывную запись свечения. Проточные флуорометры отличаются простотой и надежностью. К недостаткам проточных флуорометров следует отнести некоторое искажение профилей флуоресценции при зондировании за счет протяженности шлангов для подачи воды и трудности связанные с тем, что при работе на судне возникают неточности в определении глубины, с которой производится забор воды. Всех этих ограничений лишены погружаемые зонды-флуорометры. При помощи погружаемых зондов-флуорометров можно получить распределение хлорофилла по глубине, не извлекая на поверхность проб воды. Одновременное использование проточного флуорометра позволяет также проводить измерения обилия фитопланктона приповерхностных вод по ходу судна или вести непрерывный контроль этого показателя в течение длительного времени с платформы, буя или судна. Получаемая информация может быть обработана статистическими методами, записана в файлы и передана по любым телекоммуникационным каналам в удобной для пользователя форме (Babin et al., 1996).
Зонд-флуорометр
В настоящее время активно развивается космический мониторинг морей и океанов, но он получает информацию только с поверхности моря. Регистрируется температура или цветность моря. Однако важно определять, что происходит в толще воды под поверхностью.
Исследование количества и состояния природного фитопланктона in situ предполагает необходимость зондовых измерений по всей глубине фотической зоны водоема, которая в океане может достигать 200 м. Для приемлемого пространственного разрешения зондовой флуорометрии (порядка 1 м по глубине) при ограниченном времени зондирования требуется высокое быстродействие измерений. Кроме того, устройство должно обладать высокой чувствительностью, так как минимальное содержание хлорофилла в природных водах (олиготрофные зоны океана) может составлять 0,01 мкг/л. Поэтому при конструировании погружаемого зонда был выбран вариант двухлучевого импульсного флуорометра, в котором реализуется метод «накачки и зондирования». К началу наших работ не изготовлялось коммерческих приборов, удовлетворяющих поставленным задачам. В связи с этим нами был создан зонд-флуорометр, способный работать до глубины 200 м, для измерения параметров флуоресценции (F0j Fm и Fv/Fm) природного фитопланктона в естественных условиях с одновременной регистрацией температуры и подводной облученности. Прибор состоит из погружаемого герметичного корпуса с встроенной в него электронной и оптической системами измерения, блока питания и ШМ-совместимого компьютера, управляющего процессом измерений по заданной пользователем программе. Регистрирующая часть зонда состоит из фотоумножителя, усилителя сигналов, аналого-цифрового преобразователя, интерфейса связи с компьютером и двух независимых импульсных источников света с длительностью вспышек 0,01 мс (спектральная область 400-480 нм). Измерение всех параметров производится в автоматическом режиме и результаты выводятся на экран компьютера в реальном времени по мере погружения аппарата в виде графиков, отражающих вертикальный профиль температуры, подводной облученности, величин F0 и Fm в относительных единицах, показатель эффективности фотосинтеза водорослей (Fm-Fo)/Fm, а также концентрацию хлорофилла а, рассчитанную по величине Fo в соответствии с калибровкой.
Конструкция погружаемого зонда приведена на рис. 3. Зонд состоит из внутренней цилиндрической части (1), на которой смонтирована оптическая схема прибора, и сферического гермокорпуса (2), имеющего разъем по экватору и стягиваемого двумя маховиками (3) сверху и снизу. Такая конструкция обеспечивает необходимую герметичность. В нижней полусфере располагается измерительная камера флуорометра (4), закрытая снизу заглушкой со световым замком (5), два импульсных источника света (6) с системами фокусировки в центр измерительной камеры и датчики температуры (7) и глубины (давления) (8). В верхней полусфере располагаются фотоэлектронный умножитель (9) для регистрации сигнала флуоресценции, плата датчиков (10), блоки питания ФЭУ и электроники (11), а также контроллер управления и передачи данных (12). Все платы соединяются между собой с помощью разъемов.
Импульсные источники света генерируют последовательные pump-and-probe вспышки с частотой 2 Гц (см. рис. 3). В качестве источников света используются две ксеноновые лампы СШ-20 в комбинации с сине-зелёными светофильтрами СЗС-22. Спектр возбуждения флуоресценции распределен в интервале длин волн от 400 до 550 нм. Энергия насыщающей вспышки составляет 1 Дж, тестирующей - 0.01 Дж. Длительности вспышек около 10 мкс. Интенсивность флуоресценции регистрируется фотоумножителем ФЭУ-68 после прохождения через комбинацию светофильтров ПС-8 и КС-18, обладающих пропусканием в дальней красной области (А 670 нм).
При погружении зонда, вода за счет гидравлического сопротивления маховиков попадает в сквозную измерительную камеру (см. рис. 3), в которой через 0,5с происходит измерение флуоресценции клеток фитопланктона, адаптированных к условиям облучения на данной глубине. Скорость погружения составляет 0.1-0.3 м/с 1, что позволяет получать профили измеряемых величин с высоким разрешением.
При освещении первой зондирующей вспышкой света регистрируется Fo, интенсивность флуоресценции при открытых РЦ ФС2. Интенсивность F0 с точностью до квантового выхода флуоресценции прямо пропорциональна коэффициенту абсорбции синего света антенными пигментами ФС2 суспензии микроводорослей, величина которого соответствует доле света, поглощенного ФС2 клеток в единице объема воды, и может служить мерой количества фитопланктона (Matorin et al., 2004). Насыщающая вспышка света переводит большинство РЦ в закрытое состояние, а через 50 мкс, что существенно меньшее времени оборота РЦ (1 мс), подается вторая зондирующая вспышка, и регистрируется флуоресценция (II), соответствующая максимальному уровню насыщения флуоресценции короткой мощной вспышкой (Schreiber et al., 1995). Разницу между интенсивностями флуоресценции Fv=Fm-Fo называют переменной флуоресценцией хлорофилла и она соответствует той части поглощенной световой энергии, которая расходуется на фотосинтез при открытых РЦ ФС2. Показано, что отношение Fv/Fm отражает эффективность фотохимического преобразования энергии в РЦ ФС2 (Klughammer, 1992) и может служить характеристикой физиологического состояния фитопланктона (Маторин, Венедиктов, 1990).
Регистрируемые сигналы флуоресценции, а также подводной освещенности, температуры и давления (глубины) посылаются в реальном времени по соединительному кабелю в управляющий бортовой компьютер. Параметры флуоресценции, температура и освещенность отображаются на экране в виде вертикальных профилей в реальном времени. Обработка получаемой информации с помощью специальных программ позволяет оперативно получать информацию о распределении флуоресцентных параметров фитопланктона по поверхности и вертикальным разрезам. На рис. 5 приведена типичная схема морского зондирования.
Интенсивность флуоресценции Fo коррелирует с содержанием хлорофилла а. В наших экспедициях также наблюдали корреляцию Fo и хлорофилла а (рис. 6). Значение интенсивность флуоресценции (F0) отражает общее содержание всех пигментов светособирающего комплекса, ассоциированных в ФС2 ФСА водорослей, но не содержание самого хлорофилла а. Значение Fo зависит от соотношения пигментов в составе ФСА водорослей. Это соотношение значительно отличается у разных таксономических групп водорослей (рис.7).
Соотношения пигментов в составе ФСА водорослей зависит от интенсивности и спектрального состава света, к которому адаптирован фотосинтетический аппарат растительного объекта. Кроме того, на величину Fo влияют процессы фотохимического и нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла.
Флуорометрический индикатор физиологического состояния растений
Следствием постоянно возрастающих антропогенных нагрузок на городские экосистемы в последние годы является массовая гибель зеленых насаждений в Москве. Причин может быть несколько, причем для разных районов, а возможно, и разных видов растений они могут быть различными.
В действующей системе мониторинга состояния зеленых насаждений основное внимание уделяется выявлению очагов болезней и очагов массового развития вредителей, причем о состоянии самих растений часто судят только по их внешнему виду. Эта система мониторинга нуждается в дополнении объективными показателями физиологического состояния деревьев и кустарников, до их поражения болезнями и вредителями, так как именно снижение иммунитета растений в неблагоприятных условиях создает условия для развития инфекций.
Используемые методы мониторинга должны быть аппаратурными и экспрессными, с тем, чтобы обеспечить возможность объективной оценки состояния большого числа растений за короткое время, а также не травмировать растения.
Одним из важнейших функциональных показателей состояния растений является состояние ФСА. Значение этого показателя определяется как важностью фотосинтетической функции, так и высокой чувствительностью ФСА к повреждающим воздействиям. Для определения потенциальной фотосинтетической активности целого растения можно использовать характеристику флуоресценции хлорофилла, поскольку высокая чувствительность методов регистрации флуоресценции позволяет надежно регистрировать сигнал флуоресценции от интактного излучения.
Слой феллодермы в коре древесных растений содержит большое количество хлорофилла, который обладает фотосинтетической активностью. Измерение характеристик флуоресценции хлорофилла в интактных побегах могло бы значительно расширить возможности мониторинга состояния древесных растений, так как позволило бы получить информацию о состоянии растений не только в период их активной вегетации, а круглогодично. Появляется возможность проследить динамику вхождения растений в состояние зимнего покоя, степень холодового повреждения растений зимой и выхода их из покоя весной, что важно для перспективного прогноза состояния зеленых насаждений. Поскольку хлорофиллосодержащий слой феллодермы покрыт оптически плотным слоем омертвевших клеток, то необходимо было убедиться, что чувствительность метода позволяет проводить измерения, не нарушая целостности побега, а вариации оптической плотности этого слоя у разных побегов и в различных участках одного и того же побега не мешают получать достоверные данные об их состоянии.
Переменную флуоресценцию хлорофилла измеряли с помощью импульсно-модулированного флуорометра, изготовленного на кафедре биофизики биологического факультета МГУ, на основе разработанного ранее флуорометра (Лядский и др., 1987). Основным отличием данной конструкции от более ранней является использование светодиода вместо импульсной лампы для импульсного возбуждения флуоресценции и фотодиода вместо фотоумножителя для регистрации флуоресценции. Это позволяет использовать данный флуорометр для полевых измерений на интактных растениях. Принцип импульсной модуляции измеряющего света был предложен У. Шрайбером (Schreiber, 1986). В данном методе темновой уровень флуоресценции хлорофилла при открытых реакционных центрах (F0) определяют у адаптированных к темноте побегов. При дополнительном кратковременном освещении интенсивным постоянным светом, которое вызывает переход всех хинонных акцепторов ФС2 в восстановленное состояние (закрытое состояние реакционных центров ФС2), регистрируют максимальный выход флуоресценции (Fm). Эффективность использования света в реакциях фотосистемы 2 определяют как отношение переменной флуоресценции (Fv=Fm - F0) к максимальной - Fv/Fm.
Исследуемый образец выдерживали в темноте (1-3 мин), после чего измеряли F0, освещая образец импульсами красного света (длина волны 680нм) длительностью 3 мкс и частотой около 1 кГц. Амплитуда вспышек выбирается минимально возможной, при которой обеспечивалась достаточная чувствительность флуорометра, но выход флуоресценции не возрастал под действием зондирующего света. Затем включали постоянный насыщающий свет (галогенная лампа накаливания КГМ-70, интенсивность света 500 вт/м2) на время около 1 с и измеряли новый, увеличенный уровень импульсов флуоресценции, возбуждаемой зондирующим светом - Fm. Весь процесс измерения происходил под управлением компьютера и занимал не более 2-4 мин.
Для измерения флуоресценции хлорофилла а в коре побег фиксировали в специальном зажиме. В зажиме был закреплен световод с тремя отводками, к которым присоединяли два источника света (измеряющего и действующего) и фотодиод, регистрирующий флуоресценцию в однолетних побегах нижних ветвей деревьев. На каждом растении выбирали не менее пяти ветвей, на каждой из которых измеряли 5-8 побегов и данные усредняли. Побеги срезали на рассвете в отсутствие яркого солнечного освещения. Время темновой адаптации интактных побегов перед измерением флуоресценции составляло 1-3 мин. Срезанные побеги перед измерением флуоресценции адаптировали в темноте в течение 30 мин для нивелирования различий во времени между временем срезания разных побегов и измерением флуоресценции. Рис. 17. Флуорометрический индикатор физиологического состояния растений.
Чтобы убедиться, что предлагаемый показатель действительно может быть использован для характеристики физиологического состояния деревьев, необходимо было определить, как сильно он варьирует в пределах одного органа, одного дерева и у деревьев разных видов, растущих в одинаковых условиях.
